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1、第七章微生物的遗传变异和育种,几个概念,遗传(heredity)变异(variation)遗传型(genotype)表型(phenotype)饰变(modification),第一节 遗传变异的物质基础,（一）转化实验,实验材料：Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae 的几种形态S型和R型,转化实验,转化实验,从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等），并对各组分进行转化试验,（二）噬菌体感染实验,实验材料：E.coli 噬菌体,（三）病毒的拆开和重建实验(TMV和HRV),结 论,核酸是负载遗传信息的真正物质基础,二、
2、遗传物质在细胞中的存在方式,核酸的七个水平,遗传物质 类型,核基因组,真核生物的,原核生物的,核外染色体,真核生物的,原核生物的,细胞质基因,线粒体,叶绿体等,共生生物,2um质粒等,有核膜包裹的真核(DNA+组蛋白),无核膜包裹的核区(环状双链DNA),(二)细胞核水平,原核生物的质粒,1.质粒的定义指游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA(circular covalently closed DNA)。,2.特点,超螺旋结构；携带某些特殊功能的基因（核基因组上所缺少），如具有接合、产毒、抗药、固氮或降解环境毒物功能的基因；某些质粒可与
3、核染色体发生整合或脱离 附加体；当用一些理化因素处理时，可使子代细胞中的质粒消除，如丫啶类染料、丝裂霉素、紫外线或高温等因素；具有重组的功能 质粒与质粒间、质粒与染色体之间；有些质粒不表现任何功能 隐蔽性质粒；,3.质粒的种类,按其复制与核染色体的复制是否同步 严紧型质粒(stringent replication plasmid)松弛型复制控制质粒(relaxed replication plasmid)按其功能 接合性质粒：如F质粒 抗药性质粒：如R质粒 产细菌素的质粒：如Col质粒 具有生理功能的质粒：如固氮的mega质粒、降解质粒等 产毒质粒：如Ti质粒,4.典型质粒简介,1）F质粒(
4、F plasmid)是E.coli 等细菌决定性别并有转移功能的质粒。,2）R质粒(R plasmid,resistance plasmid),3）Col质粒(col plasmid),大肠杆菌素,是一类由E.coli某些菌株所产生的细菌素，具有通过复制、转录、转译或能量代谢等方式而专一性地杀死它种肠道菌或同种其他菌株的能力，由Col质粒编码；,4）Ti质粒(tumor inducing plasmid),Agrobacterium tumefaciens（根癌土壤杆菌）从一些双子叶植物的受伤根部侵入，最后在其中溶解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，合成正
5、常菌株所没有的冠瘿碱类，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。,致癌区冠婴碱合成区冠婴碱分解区Ti质粒接合转移区(tra)毒性区(vir)DNA复制区(rep),6个功能区：,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变（gene mutation）（一）定义 核酸上一对或几对碱基突然发生的可遗传的变化。,（二）基因突变的类型,基因突变的类型有哪些？哪些突变型是选择性突变株？哪些是非选择性突变株？为什么？举例说明如何筛选抗性突变株？,突变株的表型,（三）突变率,每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率；自发突变几率一般在10-610-9范围内；突变率为10-9的含义,抗性突变是
6、最常见的突变类型；细菌产生抗药性的途径基因突变抗药性质粒的转移生理适应由基因突变引起的抗药性的原因？,两种观点：,突变的性状与引起突变的原因间呈对应性 抗性突变株的产生是由环境因素诱发出来的，属定向变异；突变是自发产生的，与环境是否存在该物质无关。,1.变量试验（fluctuation test）,实验设计者美国的鲁里亚和德尔波留克根据统计学原理设计；时间：1943年实验材料：对T1噬菌体敏感的大肠杆菌实验目的验证突变的性状与引起突变的原因间有无直接对应关系实验过程,如果突变的性状与引起突变的原因间呈对应性结果如何？如何解释得到的实验结果？噬菌体的作用？,实验结果讨论,突变的发生在时间上是随机
7、的,2.涂布试验（Newcombe experiment）,实验设计者1949年纽康布实验材料对T1噬菌体敏感的大肠杆菌采用固体平板培养实验过程,突变率的计算,接种时每一平皿的细胞数：5104培养5h后每一平皿的细胞数：5104 212.3（5100）=2.6 1086个平皿上共发现28个突变菌落突变率=突变的细胞数/增加的细胞总数=28/6（2.6 108-5104）=1.810-8,3.平板影印试验（replica plating）,实验设计者1952年，美国的莱德伯格夫妇实验材料E.coli K12实验过程,Lederberg 的平板培养法,（四）突变的特点,不对应性自发性稀有性独立性诱
8、变性稳定性可逆性,(五)基因突变及其机制,突变,诱变,自发突变,基因突变,染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位,碱基置换,移码突变,转换,颠换,缺失,添加,诱变剂：凡能显著提高突变频率的理化因子；1）碱基置换转换（transition）嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换颠换（transversion）嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换,1.诱发突变,直接引起置换的诱变剂直接与核酸的碱基发生化学反应，体内或离体均有作用。如：亚硝酸、羟胺、和各种烷化剂；间接引起置换的诱变剂通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后引起的变化。如：碱基类似物；,诱变剂种类,2）移码突变 DNA分子中的一个或少数几个核苷
9、酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变；诱变剂种类：丫啶类染料（原黄素、丫啶黄、丫啶橙、-氨基丫啶等）和ICR类化合物；,3）染色体畸变,某些强烈理化因子，如电离辐射（X射线等）和烷化剂、亚硝酸等引起DNA分子的大片段损伤；染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位；染色体数目的变化；,染色体的易位,转座DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。,2.自发突变(spontaneous mutation),1、由背景辐射和环境因素引起；2、由微生物自身有害代谢物引起；3、由DNA复制过程中碱基配对错
10、误引起等。,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,胞嘧啶水合物,胸腺嘧啶二聚体,二氢胸腺嘧啶,胸腺嘧啶-胞嘧啶二聚体,1.光复活作用,UV,可见光,二聚体解离,光激活酶(photoreactivating enzyme),2.暗修复（切除修复）,酶I核酸内切酶,酶II核酸外切酶,酶IIIDNA聚合酶,酶IVDNA连接酶,（一）自发突变与育种,从生产中育种 定向培育优良菌株,（二）诱变育种,二、突变与育种,指利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学试验或生产实践使用。,诱变育种的基本环
11、节 诱变育种的原则 突变株的筛选方法 产量突变株的筛选 抗药性突变株的筛选 营养缺陷型突变株的筛选,春日霉素产生菌的孢子悬液 诱变 涂布平板 培养2天（29）,保持合适的温、湿度,产量突变株的筛选,抗药性突变株的筛选,营养缺陷型突变株的筛选,(1)与筛选营养缺陷型有关的三类培养基基本培养基(minimal midium，MM)-完全培养基(complete medium,CM)+补充培养基(supplemental medium,SM)A（2）与营养缺陷型突变有关的菌体野生型(wild type)能在-中生长营养缺陷型(auxotroph)能在+或A生长原养型(prototroph)能在-中生
12、长,原菌株(出发菌株),诱变剂处理,淘汰野生型,检出缺陷型,鉴定缺陷型,营养缺陷型突变株的筛选方法,营养缺陷型突变株的筛选方法,夹层培养法,影印接种法,营养缺陷型突变株的筛选方法,(4)营养缺陷型的筛选举例枯草杆菌氨基酸缺陷型,（生长谱法）,营养缺陷型突变株的筛选方法,+上生长的营 养缺陷型,培养,营养缺陷型的鉴定生长谱法,作为研究代谢途径和基因重组等遗传规律的标记菌种；作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种；用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；,营养缺陷型突变株的应用,Ames test测定潜在化学治癌物,理论依据一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改
13、变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。生物化学统一性法则生物的“三致”（致突变、致畸变、致癌变）物质可引起核酸结构的改变，从而引起其功能的改变；反之亦然。基本原理Salmonella typhimurium 的his-菌株在-的平板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。,试验步骤：,可疑“三致”试样+鼠肝匀浆,S.t his+-,阳性,阴性,培养,1、某突变菌株在基本培养基上无法生长，而在添加了0.1%碱水解酵母核酸后，该菌株能生长。请设计一实验方案以进一步确定该菌株的生长必需物。2、什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请设计一个具体实验方案。3、怎样
14、用实验证明突变是自发产生的，而不是受环境诱导产生的？,作业题,第三节 基因重组,(gene recombination),基因重组的定义两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。重组和杂交的关系重组是在核酸分子水平上的杂交，与细胞水平上的杂交有明显区别杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。,一、原核生物的基因重组,（一）转化（transformation）1.定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的杂种后代称为转化子。2.能进行转化的微生物种类Streptococcus pneu
15、moniae；Bacillus；Rhizobium；Pseudomonas；Staphylococcus；Saccharomyces cerevisiae；Neurospora crassa；Aspergillus niger等。但肠道菌科的细菌如E.coli等很难进行转化。,3.影响菌株间发生转化的因素与它们在进化过程中的亲缘关系有关；最易与细胞表面结合的是dsDNA；发生转化的细胞必须处于感受态;转化的频率低（0.1-1%，最高为20%）;转化需要的DNA浓度极低;4.感受态（competence）指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。不同菌种感受态细胞所占比例、出现
16、的时间和维持时间不同外界环境因子如环腺苷酸（cAMP）和Ca2+等可提高受体细胞的感受态水平。调节感受态的是一类特异蛋白感受态因子,dsDNA,5.转化过程,6.转染(transfection)用提纯的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主细胞，可增殖出一群正常病毒后代的现象称为转染。,1.定义通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。获得的重组细胞称为转导子。2.转导的种类普遍转导局限转导,（二）转导(transduction),通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何DNA小片段的“误包”，而将其遗传
17、性状传递给受体菌的现象；一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介；可分为完全普遍转导和流产普遍转导；,普遍转导(generalized transduction),完全普遍转导(generalized transduction),供体,受体,（2）流产普遍转导外源DNA片段不与受体细胞核染色体组进行交换、整合和复制，仅表现稳定的转录、转译和性状表达，且每经过一次分裂，就受到一次“稀释”。,通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象；特点：只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；缺陷噬菌体的形成方式
18、是在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率（-10-5）的误切；需要通过UV等因素对溶源菌的诱导；分为低频转导和高频转导,局限转导(restricted transduction),1)低频转导（LFT）,部分缺陷噬菌体以大肠杆菌噬菌体为例,其频率为10-410-6（LFT裂解物）,2)高频转导（HFT）,双重溶源菌（double lysogen）同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌；被紫外线等诱导时，正常的 噬菌体具有补偿缺陷噬菌体（如 dgal）所缺失的部分基因的功能，使两种噬菌体同时获得复制；存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体；双重溶源菌产生的裂解物中含有等量的和 dgal粒子
19、HFT裂解物 低m.o.i.Ecoli.K12gal-高频地把它转化成 稳定的 gal+转导子；,高m.o.i.的LFT裂解物 感染 Ecoli.K12gal-?,低频转导和高频转导的异同点,相同点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带不同点低频转导：在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例极低，称为低频转导裂解物。用其感染宿主，只获得极少量的局限转导子高频转导：产生高频转导裂解物，用其感染宿主，可获得较多的转导子。,当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主基因上，而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称溶源转变。,溶源转变,（三）接合（conj
20、ugation）,供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的核基因组传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。能进行结合的微生物种类主要在细菌和放线菌中存在；研究得最清楚的是E.coli；E.coli有性别分化，决定性别的是一种质粒，即F因子是属于附加体的质粒。根据F因子在细胞内的存在方式，将E.coli分为四种类型：,F+菌株含有游离的F因子，在细胞表面还有性菌毛 F-菌株不含F因子，细胞表面没有性菌毛。Hfr（高频重组）菌株F因子整合在核染色体组特定位点上F菌株Hfr菌株内的F因子因不正常切离而脱离核染色体组时形成的游离的但携带一小段核染色体基因的特殊F因子 初生的F菌株,大肠
21、杆菌的四种类型,F质粒的4种存在方式及相互关系,大肠杆菌的接合方式,F+F-F+F+Hfr F-Hfr+F-（多数情况下）Hfr F-Hfr+Hfr（少数情况下）F F-F+FF因子转导以F质粒通过接合来传递供体基因的方式,中断实验,（四）原生质体融合(protoplast fusion),通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为融合子。能进行原生质体融合的细胞极其广泛原核生物、真核生物、高等动植物、人体,原生质体融合的主要步骤：,1 选择亲本有特殊价值有选择性遗传标记2 获得原生质体脱壁酶去除细胞壁（细菌、放线菌、真菌
22、）3 原生质体融合促融合剂PEG(聚乙二醇)或电脉冲4 筛选稳定的融合子,原生质体融合的主要步骤：,各种融合子 长成菌落,检出A+B+,+,原生质体融合的 特点,1.重组频率高2.不受亲缘关系的影响3.能转移多数基因，可获得生产性状更为优良的新物种4.两个原生质体表面直接接触，对等融合形成（双向转移）,原生质体融合,二、真核微生物的基因重组,基因重组的方式：有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化；（一）有性杂交 指不同遗传型的两性细胞之间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。举例酿酒酵母酒精酵母：产酒精率高但对葡萄糖的发酵力弱面包酵母：产酒精率低但对葡萄糖的
23、发酵力强,S.cerevisiae的双倍体和单倍体的比较,准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。准性生殖过程菌丝联结频率低形成异核体质配后两个单倍体核集中到同一细胞。核融合异核体中的两个细胞核，低频率产生双倍体杂合子体细胞染色体交换和单倍体化 双倍体杂合子不稳定，在进行有丝分裂过程中，极少数核内的染色体会发生交换和单倍体化，从而形成具有新性状的单倍体杂合子。,（二）准性杂交,准性生殖和有性生殖的比较,准性杂交育种,选择亲本：营养缺陷型强制异合：分生孢子相互混匀-移单菌落：长
24、出的菌落接种到-斜面检验稳定性：夹层法促进变异：诱变处理增加新性状,第四节 基因工程,一、基因工程的基本操作目的基因的获得载体的选择目的基因与载体DNA 的体外重组重组载体导入受体细胞重组受体细胞的筛选和鉴定“工程菌”的大规模培养二、基因工程的应用,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种保藏的原理根据微生物的菌种生理、生化特性，在 人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。,复壮狭义：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性称为复壮。广义：在菌种衰退前，有意识地选择到自发的正变个体衰退菌种经过长期传代培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。,二、菌种衰退与复壮,三、防止菌种衰退的方法,控制传代次数创造良好的培养条件利用不易衰退的细胞传代采用有效的菌种保藏方法,四、菌种复壮的方法,纯种分离法通过宿主体复壮淘汰已衰退的个体理化因素诱变五、菌种的保藏方法低温斜面保藏液体石蜡保藏砂土管保藏真空冷冻干燥保藏,
