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1、病毒的鸡胚接种病毒的鸡胚接种 教学目标 使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。 材料准备 1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、2027 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。 2.种毒新城疫病毒悬液。 3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。 4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。 方法步骤 鸡卵的保存、孵育及检卵 1.保存 孵育前，保存在4.520 的室温内，以10 左右最佳，最多不能超过10 d。 2.孵育 先将温箱调节温度为37.337.8 ，湿度45%60%。将鸡卵孵入后
2、，每日翻卵23次。 3.检卵 孵后第46 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。鸡胚的生长情况分为以下几类： 未受精 4 6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。 生活鸡胚 46 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。 濒死或死亡鸡胚 鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。 作标记 将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。 各种途径的鸡胚接种方法 1.尿囊腔接种 接种方法 孵育911日龄的鸡胚，经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。在气室中心或远离胚胎侧
3、气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.10.3 mL新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h内死亡的鸡胚。 实图6-20鸡胚的结构 实图6-21尿囊腔接种 收获方法 收获时间须视病毒的种类而定。新城疫病毒在接种后2448 h即可收获病毒。收获前将鸡胚置于04 冰箱中冷藏4 h或过夜，使血管收缩，以免解剖时出血。气室朝上立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳，形成直径为1.52.0 cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开气室中央的绒毛尿
4、囊膜，然后用吸管从破口处吸取尿囊液，每胚可得56 mL，贮于无菌小瓶内，无菌检验后，冰冻保存，做种毒或试验之用。 消毒 将用过的镊子、注射器等放入煮沸锅消毒5 min，取出后擦干包好，高压灭菌待用。卵壳、鸡胚等置于消毒液中浸泡过夜，然后弃掉。无菌室内用紫外线灯消毒30 min。 2.卵黄囊接种法 接种方法 选用68日龄鸡胚，划出气室和胚胎位置，垂直放置在固定的卵架上，用碘酊及酒精棉消毒气室端，在气室的中央打一小孔，针头沿小孔垂直刺入约3 cm，向卵黄囊内注入0.10.5 mL病毒液。拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化37 d。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h内死亡的鸡
5、胚。 收获方法 将濒死或死亡鸡胚气室部用碘酊及酒精棉消毒，直立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳。用另一无菌镊子撕开绒毛尿囊膜，夹起鸡胚，切断卵黄带，置于无菌双碟内。如收获鸡胚，则除去双眼、爪及嘴，置于无菌小瓶中保存；如收获卵黄囊，则用镊子将绒毛尿囊膜与卵黄囊分开，将后者贮于无菌小瓶中。收获的鸡胚或卵黄囊，经无菌检验后，放置-25 冰箱冷冻保存。 消毒同尿囊腔接种法。 3.绒毛尿囊膜接种法 接种方法 选912日龄鸡胚，经照视后划出气室位置并消毒。在胚胎附近略近气室处，选择血管较少的部位以磨卵器磨一与纵轴平行的裂痕或将蛋壳锉开成三角形，小心挑起卵壳，造成卵窗，见到白色而韧性的壳膜，以针
6、尖小心挑破壳膜，注意切匆损伤其下的绒毛尿囊膜。另外，在气室的顶端钻一小孔，在卵窗壳膜刺破处滴一滴无菌生理盐水，用橡皮乳头紧贴气室小孔，向外吸气，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷形成一小凹。除去卵窗部的卵壳，用注射器或吸管滴入23滴病毒液于绒毛尿囊膜上。用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗上，周围用石蜡封固，同时封气室端小孔。接种部位朝上横卧孵化，不许翻动。每日自卵窗处检查，经4896 h，病变发育明显，鸡胚可能受感染死亡。 收获方法 用碘酊消毒卵窗周围，用无菌镊子扩大卵窗至绒毛尿囊膜下陷的边缘，除去卵壳及壳膜，注意匆使其落入绒毛尿囊膜上。另用无菌镊子轻轻夹起绒毛尿囊膜，用小剪刀沿人工气室周围将接种
7、的绒毛尿囊膜全部剪下，置于灭菌的平皿内，观察病变。病变明显的膜，可放入小瓶中保存。 消毒 同尿囊腔接种法。 4.羊膜腔接种法 接种方法 选1214日龄鸡胚，经照视后划出气室位置并消毒，按绒毛尿囊膜接种法造成人工气室，撕去卵壳膜，用无菌镊子夹起绒毛尿囊膜，在无大血管处切一0.5 cm小口。用灭菌无齿弯头镊子夹起羊膜，针头刺破羊膜进入羊膜腔，注入新城疫病毒液0.10.2 mL。用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗上，周围用石蜡封固，同时封气室端小孔。横卧孵化，不许翻动。每日检查发育情况，24 h内死亡者弃去。通常培养35 d。 收获方法 用碘酊消毒卵窗周围，用无菌镊子扩大卵窗至绒毛尿囊膜下陷的边缘，除去卵壳、壳膜及绒毛尿囊膜，倾去尿囊液。夹起羊膜，用尖头毛细吸管或注射器穿入羊膜腔，吸取羊水，装入小瓶中冷藏。每卵约可收获0.51 mL。 消毒同尿囊腔接种法。 注意事项 (1)鸡胚污染即可引起发育鸡胚死亡或影响病毒的培养，故整个操作应在无菌室或超净工作台内完成，做到无菌操作。 (2)鸡胚培养是在生活鸡胚中进行操作，接种后的鸡胚必须带毒发育一定时间才有利于病毒的增殖，故必须谨慎操作，以免影响鸡胚的生理活动或引起死亡。 (3)培养条件如温度、湿度、翻动等必须适当，并在全程保持稳定。 (4)病毒液使用前及收获后，必须先作无菌检验，确定无菌后方能使用或保藏。
