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1、T载体转化连接T载体转化连接.txt41滴水能穿石，只因为它永远打击同一点。42火柴如果躲避燃烧的痛苦，它的一生都将黯淡无光。蓝白斑筛选的原理 分类:生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成
2、具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。 T载体： 聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR
3、产物两侧3端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。 感受态细胞制备注意事项： 1、制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。 2、42度热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 3、菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 1 调整期：细菌代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP以及其他细胞成分 2 对数期：细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定 3 稳定期：有害代谢产物积累，新增细胞数目与死亡细胞数目达到动态平衡，次级代
4、谢产物大量积累，形成芽孢 4 衰亡期：细菌数目急剧下降，出现畸形细菌 (二) 对数期(log phase) 对数期又称指数期(exponential phase)。在此期中，细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有分裂形成的新细胞都生活旺盛。这一阶段的突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。这时，细菌纯培养的生长速率也就是群体生长的速率，可用代时(generation time)表示。所谓代时，即单个细胞完成一次分裂所需的时间，亦即增加一代所需的时间(也叫增代时间或世代时间)。在此阶段，由于代时稳定，因此，只要知道了对数期中任何两个时间的菌数，就可求出细菌的代时。
