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1、发酵简答题1. 简述菌种保藏的基本原理和方法？ 2. 酶解法制备淀粉水解糖的优点和缺点有哪些？ 3. 简述发酵过程的组成部分？ 4. 简述发酵工业对微生物菌种的要求 七、回答题 1分析发酵时泡沫产生的原因、泡沫对发酵的影响，并说明常见除去泡沫的方法。 2分析发酵工业中杂菌污染的危害、原因和预防措施 五、1菌种保藏的原理是将菌种在低营养水平、缺氧状态，干燥和低温等条件下贮藏，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力，从而减少其变异。方法有斜面低温保藏法、蒸馏水保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥法、液氮保藏法等。 2以酶为催化剂，在常温常压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。优点：反应条件温和；副反应少；可在较高
2、淀粉浓度下水解，对原料要求不高；糖液的质量高、营养物质较丰富。缺点：水解时间长，酶制备较复杂，设备较多。 3菌种的培养基原料来源广、廉价；培养条件易控制；发酵周期短；菌株高产；菌种抗性强，如抗病毒能力强；菌株性状稳定，不易变异退化；菌种安全性高，不产生有害物质。 4危害有：杂菌产生的一些物质会影响产量或产品质量、消耗大量的营养物质而影响生产菌的正常生长，杂菌产生的一些物质可以抑制生产菌的生长，杂菌会寄生于生产菌体内，杀死生产菌。 评分标准：根据答案要点及书写情况酌情给分。 六、原因：机械泡沫。发酵泡沫。影响：减少发酵的有效容积、增加了染菌的机会； 泡沫严重时，影响通气搅拌的正常进行，影响生产率
3、。消泡方法：化学消泡和机械消泡。 评分标准：根据答案要点及书写情况酌情给分。 五、论述绘图题 1、列举膜分离技术并作相应说明。 2. 绘图并说明氧从气相传递到液相的菌体中需要克服的几种阻力。 第 页 共 9 页 3. 噬菌体的特点、感染过程危害程度及治理措施。39发醇过程中异常现象处理措施？ 40Monod(莫诺)方程表明了什么和什么的重要关系？简介Monod(莫诺)方程？ 41补料分批发酵技术的特点, 与分批发酵，连续发酵的区别？ 42 通风发酵设备中的机械搅拌发酵罐必须满足的基本条件？ 六、论述题： 43如何提高高产菌的稳定性？ 44发酵过程中溶解氧的控制措施？ 39发酵液pH对发酵的影响
4、包括哪些方面？ 40比底物消耗速率方程？ 41补料分批发酵的适用范围 ？ 42优良的发酵装置应具有的基本特征包括哪些内容 ？ 六、论述题： 43试述对微生物反应器设计的基本要求？ 44 大规模微生物发酵工程生产, 选择菌种应遵循的原则是什么？ 三、简答题 4、简述种子制备过程中种子级数对发酵过程的影响？ 答：过多会增加发酵操作环节，造成衰退菌体细胞过多，发酵过程控制难度增大。 过少会使种子菌体数量偏少，发酵启动慢，种子液中旺盛细胞比例下降。 级数过发酵种子制备周期长，发酵设备多，菌种代数多，活跃细胞比例少；过小，菌体数量少，发酵迟缓，产物转化 率低，周期长。 5、简述搅拌对发酵过程的意义？ 答
5、：增加气液接触面积；延长气泡运动路线，增加气液接触时间(使液体作涡流运动) ；减少气泡周围液膜厚度，增大kL值(使发酵液呈湍流运动) ；避免菌体结团，增加菌体对氧气的吸收。改善发酵 四、应用题 1、设计一套“苯酚降解菌株的分离筛选”实验方案。 答：1.确定实验方案：首先查阅果胶酶生产资料，了解所需菌种的生长培养特性。 2. 采样：选择富含果胶物质的果园等环境挖取离地面515 cm处的土样。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 3. 增殖：适度稀释后，取0.1 m1涂布于已添加及未添加果胶底物的土浸出汁平板。 4. 分离：利用目的菌株产果胶酶特性选取能分解果胶的透明菌落的纯种菌株。 初筛：向固
6、体真菌培养基中加入一定的果胶，使培养基形成混浊半透明状态根据菌体产果胶酶溶解果胶出现透明圈大小，初步筛选出产酶高的菌种。 复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到真菌液体培养基中30深层培养24 h后，进行酶活力比较实验，确定果胶酶的具体生成量。选择出高产酶菌株即为分离菌株. 五、分析题 某发酵车间连续数批多只发酵罐出现染菌，染菌发现时间一般在18-20小时左右，经镜检确认所染杂菌为单一的芽孢杆菌，请分析导致染菌的可能原因并说明理由，同时请提出解决措施。 答：原因分析 早期18-20小时左右发现染菌，其原因可能有：种子带菌、发酵罐内有死角、设备泄漏、培养基灭菌不彻底、空气带菌。 由于所染杂菌为单
7、一的芽孢杆菌，因此可将设备泄漏的原因排除。在剩余的原因中，只有空气带菌才有可能导致整个车间连续数批出现染菌。种子带菌、发酵罐内有死角、培养基灭菌不彻底等原因导致的染菌一般都出现在个别发酵罐，而且不具有连续性。虽然从理论上分析，空气带菌造成的染菌，所染杂菌的类型应该不会是单一菌型，但由于空气压缩机的出口温度高达140左右，因此在实际生产过程中，由于空气过滤器失效导致的染菌，在绝大部分情况下，所观察到的杂菌一般为单一的芽孢杆菌。根据以上分析，基本可以断定染菌的原因为空气带菌。 措施 首先对所有发酵罐进行熏罐或煮罐处理，然后通过空培养进一步确证染菌的原因。在确证染菌原因为空气带菌，更换空气过滤器。
8、本题评分原则：能分析早期染菌的原因但没包含空气带菌；能完整分析早期染菌的原因；能分析出染菌的原因并适当进行解释；能分析出染菌的原因并适当进行解释，提出的解决措施合理。 1、举出几例微生物大规模表达的产品, 及其产生菌的特点？ A.蛋白酶 表达产物一般分泌至胞外，能利用廉价的氮源，生长温度较高，生长速度快,纯化、分离及分析快速；安全性高，得到FDA的批准的菌种。 B.单细胞蛋白 生长迅速，营养要求不高，易培养，能利用廉价的培养基或生产废物。适合大规模工业化生产，产量高，质量好。安全性高，得到FDA的批准的菌种。 C. 不饱和脂肪酸 生长温度较低，安全性高，能利用廉价的碳源，不饱和脂肪酸含量高，
9、D.抗生素 生产性能稳定，产量高，不产色素，能利用廉价原料 F. 氨基酸 代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单 2、工业化菌种的要求？ A能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 B有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强 C. 遗传性能要相对稳定 D. 不易感染它种微生物或噬菌体 E. 产生菌及其产物的毒性必须考虑 F. 生产特性要符合工艺要求 5、自然界分离微生物的一般操作步骤？ 样品的采取预处理培养菌落的选择初筛复筛性能的鉴定菌种保藏 13、什么是培养基发酵培养基的特点和要求？ 培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同
10、时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。 有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降
11、低能耗。 14、用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？ 碳源糖类、油脂、有机酸和低碳醇。 葡萄糖，所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应 糖蜜，是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。 淀粉、糊精，缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶。成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应。 15、什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？ 经微生物
12、生理作用后能形成酸性物质的营养物叫生理酸性物质，若菌体代谢后能产生碱性物质的营养物称为生理碱性物质 16、常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？ 常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨等；常用的无机氮源有氨水、铵盐和硝酸盐。 有机氮源在发酵培养基中的作用有：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。诱导某些酶的产生。 17、什么是前体？前体添加的方式？ 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。前体使用时普遍采用流加的方法。 1
13、9、什么是产物促进剂？产物促进剂举例？ 是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 29、什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？ 接种量移入种子的体积接种后培养液的体积 细菌5、放线菌20 霉菌10 30 什么是发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？ 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数 发酵级数对发酵影响：1.种子级数少，可简化工艺和控制，减少染菌机会 2.种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 3.级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-
14、4级。 4.在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面 影响发酵级数的因素：(1)菌种生长特性,孢子发芽及菌体繁殖速度;(2) 发酵规模.工艺要求.接种量的影响. 37、什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？ 一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来,产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。在这些发酵过程中，菌体的生长、基质的消耗、产物的生成三个速度都有一个高峰，三高峰几乎同时出现。 二类发酵：产物形成与底物利用间接相关，为部分生长联系型，又称中间发酵型，产物不是碳源的直接氧化产物，而
15、是菌体代谢的主流产物。它的特点是在发酵的第一时期碳源大量消耗用于菌体的迅速增长而产物的形成很少或全无，第二时期碳源大量消耗用于产物的高速合成及菌体的生长。 三类发酵：产物形成与底物利用不相关，为非生长联系型，又称复杂发酵型，产物的生成在菌体生长和基质消耗完以后才开始，与菌体生长不相关，与基质消耗无直接关系，所形成的产物为次级代谢产物。 41、临界溶氧浓度、氧饱和度的概念？ 临界氧浓度：CCr临界氧浓度：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。 氧饱和度：发酵液中氧的浓度临界溶氧溶度 饱和溶氧浓度：在一定温度和压力下，空气中的氧在水中的溶解度。(molm3) 50、 发酵过程中pH会不会发生变化为什
16、么？ 发酵过程中pH是不断变化的 1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一 2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降 4）某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。 5）菌体自溶 pH上升，发酵后期，pH上升 6）杂菌的污染，pH下降 51、 pH对发酵的影响表现在哪些方面？ pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性
17、时使菌的新陈代谢受阻。 pH影响微生物细胞膜所带电荷。从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。 pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。 pH值影响代谢方向。pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。 pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响。 26 与分批培养和连续培养相比补料分批培养具有哪些优点？ 答：同传统的分批发酵相比，它
18、的优越性是明显的。首先它可以解除营养物基质的抑制。产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。对于好氧发酵，它可以避免在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况，还可以在某些情况下减少菌体生成量，提高有用产物的转化率 在真菌培养中，菌丝的减少可以降低发酵液的粘度，便士物料输送及后处理；与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异问题，其适用范围也比连续发酵广。 27 发酵工艺控制的目标是什么？控制参数主要有哪些？ 答：目标：得到最大比产物生成速率，其次才是最短的生产周期，并由此获得最大的经济效益。 参数：营养物质的浓度、种类、比例，溶解氧浓度，氧化还原点位，CO
19、2量，发酵液黏度，温度，PH，泡沫，促进剂，前体，酶，代谢产物，菌体浓度，生长速率，死亡速率，细胞状态等。 28 温度对微生物细胞的生长和发酵代谢产物的影响有哪些？生产上怎样控制发酵过程的温度？ 答：细胞生长： 随着温度的上升，细胞的生长繁殖加快。这是由于生长代谢以及繁殖都是酶参加的。根据酶促反应的动力学来看，温度升高，反应速度加快，呼吸强度增加，最终导致细胞生长繁殖加快。但随着温度的上升，酶失活的速度也越大，使衰老提前，发酵周期缩短，这对发酵生产是极为不利的。发酵代谢产物：温度对发酵有很大的影响。它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制，影响发酵液的理化
20、性质，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。控制：发酵设备上装有热交换设备。 29 P对微生物细胞的生长和发酵代谢产物的影响有哪些？生产上怎样控制发酵过程的PH？ 答：p值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面： 影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用；P值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。另外，pH值还会影响某些霉菌的形态。 控制：首先需要考虑和试验
21、发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。如果达不到要求，还可在发酵过程中补加酸或碱。过去是直接加人酸(如H2SO4)或碱(如NaOH)来控制，现在常用的是以生理酸性物质(NH)4SO4和生理碱性物质氨水来控制，它们不仅可以调节pH值，还可以补充氮源。当发酵液的pH值和氨氮含量都偏低时，补加氨水，就可达到调节pH和补充氨氮的目的；反之，pH值较高，氨氮含量又低时，就补加(NH)4SO4。此外，用补料的方式来调节pH值也比较有效。 30 请分析泡沫产生的原因，泡沫对发酵的影响有哪些？生产上怎样控制发酵过程所产生的泡沫？ 答发酵过程泡沫产生的原因 1、通气
22、搅拌的强烈程度通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。 2、培养基配比与原料组成培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。 3、菌种、种子质量和接种量 菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量 4、灭菌质量 培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。 影响：发酵罐的装料系数减少、液相体积氧传递系数减小等。泡沫过多时，影响更为严重，造成大量逃液，发酵液从排气
23、管路或轴封逃出而增加染菌机会等，严重时通气搅拌也无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶。 控制：泡沫的控制，可以采用三种途径：调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度；采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫；还可以采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。对已产生的泡沫工业上采用机械消泡或者加消泡剂的方法。 四简答 1、工业上常用的菌种保藏方法？ 斜面冰箱保藏法； 沙土管保藏法； 石蜡油封保藏
24、法； 真空干燥冷冻保藏法； 液氮超低温保藏法 2、发酵培养基由哪些成份组成？ 碳源 构成菌体和产物的碳架及能量来源 氮源 构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质 无机盐和微量元素 生长因子 水、产物形成的诱导物、前体和促进剂 3、根据操作方式的不同，发酵类型主要分成哪几种？ 分批发酵 连续发酵 补料分批发酵 固体发酵 4、简述发酵工程的类型 微生物菌体发酵：以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。 微生物酶发酵：微生物具有种类多、产酶品种多、生产容易和成本低等特点。 微生物代谢产物发酵：初级代谢产物、次级代谢产物。 微生物的转化发酵微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物
25、转变成结构相关的更有经济价值的产物。 生物工程细胞的发酵：这是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”以及细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。 5、简述发酵技术特点 发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成； 在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单； 原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源，微生物本身能有选择地摄取所需物质； 容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应； 发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要
26、进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。 五、论述 1.论述液体深层发酵有哪些优点？发酵方式分为几类？ 优点： 是很多微生物的最适生长环境； 菌体及营养物、产物易于扩散，使在均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模； 液体输送方便，易于机械化操作； 厂房面积小，生产效率高，易自动化控制，产品质量稳定； 产品易于提取、精制等。 方式： 分批发酵 ：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。 连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。可以有效地延长分批
27、培养中的对数期。 补料分批发酵又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。 可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。 2、论述发酵下游加工过程 预处理方法： 加热：适当加热之后，发酵液中的蛋白由于变性而凝聚，形成较大的颗粒，发酵液的粘度就会降低。此法仅适用于对非热敏感性产品发酵液的预处理。 调节PH值：适当的PH值可以提高产物的稳定性，减少其在随后的分离纯化过程中的损失。此外，发酵液PH值的改变会影响发酵液中某些成分的电离程度，从而
28、降低发酵液的粘度。注意选择比较温和的酸和碱，以防止局部过酸或过碱。草酸较常用。 加入絮凝剂：通常情况下，细菌的表面都带有负电荷，可以在发酵液中加入带正电荷的絮凝剂，从而使菌体细胞与絮凝剂结合形成絮状沉淀，降低发酵液的上粘度，利于菌体的收获。 固液分离方法：常用到过滤、离心等方法。如果欲提取的产物存在于细胞内，还需先对细胞进行破碎。沉淀提取法、色谱分离法、萃取法、膜分离技术 精制：初步纯化中的某些操作，如沉淀、超滤等也可应用于精制。大分子(蛋白质)精制依赖于层析分离，小分子物质的精制则可利用结晶操作 成品加工：经提取和精制后，根据产品应用要求，有时还需要浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加稳定剂等加
29、工步骤。 2、现代发酵工程所用的发酵罐应具备那些特征？ 答：、发酵罐应有适宜的径高比。罐身较长，氧的利用率较高； 、发酵罐应能承受一定的压力。因为发酵罐在灭菌和正常工作时，要承受一定的压力和温度； 、发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，实现传质传热作用，保证微生物发酵过程中所需的溶解氧； 、发酵罐内应尽量减少死角，避免藏污纳垢，保证灭菌彻底，防止染菌； 、发酵罐应具有足够的冷却面积； 、搅拌器的轴封要严密，以减少泄露 7、叙述防止发酵菌种退化的具体条件措施有那些？ 答：控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。 创造良好
30、的培养条件：如在赤霉素生产菌G.fujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退效果。 利用不易衰退的细胞传代：对于放线菌和霉菌，菌丝细胞常含有几个细胞核，因此用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核的，用于接种就可避免这种现象。 采用有效的菌种保藏方法 合理的育种：选育菌种是所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞;合理选择诱变剂种类或增加突变位点，以减少分离回复突变；在诱变处理后及分离提纯化，从而保证保藏菌种的纯度。 、选用合适的培养基 在培养基中添加某种化学物质可以防止菌种退化。或者选取营养相对贫乏的培养基在菌种保藏培养基，限制菌
31、株的生长代谢减少变异反而发生从而防止菌种的退化。 9、不同时间染菌对发酵有什么影响，染菌如何控制？ 答：种子培养期染菌：由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素或只有很少抗生素。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。 发酵前期染菌：发酵前期最易染菌，且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物或产生很少，抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。 染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些
32、营养，重新接种再用。 发酵中期染菌 ：发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。 措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。 发酵后期染菌：发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。 发酵染菌后的措施： 染菌后的培养基必须灭菌后才可
33、放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。 凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒 14、什么叫染菌，对发酵有什么影响，对提炼有什么危害？ 答：染菌：发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖 染菌的影响：发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。 造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失 扰乱生产秩序，破
34、坏生产计划。 遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。 影响产品外观及内在质量 发酵染菌对提炼的影响：染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯 三、问答题 1、发酵工程的概念是什么？发酵工程基本可分为那两个大部分，包括哪些内容 答：发酵工程是利用微生
35、物特定性状好功能，通过现代化工程技术生产有用物质或其直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。也可以说是渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展，由于主要利用的是微生物发酵过程来生产产品，因此也称为微生物工程。 一.发酵部分 1.菌种的特征和选育 2.培养基的特性，选择及其灭菌理论 3发酵液的特性 4.发酵机理。 5.发酵过程动力学 6.空气中悬浮细菌微粒的过滤机理 7.氧的传递。溶解。吸收。理论。 8.连续培养和连续发酵的控制 二.提纯部分 1.细胞破碎，分离 2.液输送，过滤. 除杂 3.离子交换渗析，逆
36、渗透，超滤 4.凝胶过滤，沉淀分离 5溶媒萃取，蒸发蒸馏结晶，干燥，包装等过程和单元操作 2、现代发酵工程所用的发酵罐应具备那些特征？ 答：、发酵罐应有适宜的径高比。罐身较长，氧的利用率较高； 、发酵罐应能承受一定的压力。因为发酵罐在灭菌和正常工作时，要承受一定的压力和温度； 、发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，实现传质传热作用，保证微生物发酵过程中所需的溶解氧； 、发酵罐内应尽量减少死角，避免藏污纳垢，保证灭菌彻底，防止染菌； 、发酵罐应具有足够的冷却面积； 、搅拌器的轴封要严密，以减少泄露。 3、微生物发酵的种子应具备那几方面条件？ 答、菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，
37、迟缓期短。 、生理性状稳定。 、菌体总量及浓度能满足大量发酵罐的要就。 、无杂菌污染。 、保持稳定的生产能力。 4、发酵工业上常用的氮源有那些，起何作用？ 答：氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 1、无机氮源 种类：氨盐、硝酸盐和氨水 特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用后能形成酸性物质的无机
38、氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。 所以选择合适的无机氮源有两层意义： 满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH 2、有机氮源 来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。 成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须
39、考虑原料的波动对发酵的影响 5、发酵产品的生产特点是什么，什么是种子扩大培养，其任务是什么？ 答： 、种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 、种子扩大培养的任务： 现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。 发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下： 1，发酵过程一般来说都是在常温
40、常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。 2，发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。 3，发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单的代谢产物。 4，由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。 5，发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消
41、毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。 6，微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。 7，工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，开可以取得显著的经济效益。 基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌来进行反应；反应设备也不只是常规
42、的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。 发酵产品的生产特点： 一般操作条件比较温和； 以淀粉、糖蜜等为主，辅以少量有机、无机氮源为原料； 过程反应以生命体的自动调节方式进行； 能合成复杂的化合物如酶、光学活性体等； 能进行一些特殊反应，如官能团导入； 生产产品的生物体本身也是产物，含有多种物质； 生产过程中，需要防止杂菌污染； 菌种性能被改变，从而获得新的反应性能或提高生产率。 6、培养成分用量的确定有什么规律？ 答： 、参照微生物细胞内元素的比例确定。培养基的成分配比虽然千差万别，但都是用来培养某种微生物的，而不同类型的微生物
43、细胞的成分比例其实是有一定规律的。这些规律可以在很大程度上知道培养基的基本成分配比的选择。 不同种类的微生物内某种成分的含量其实是比较稳定的。培养基最终会被微生物吸收利用，因此其成分比例可以参考该种微生物的成分比例，至少可以作为一个重要依据。另外，尽管不同种类的微生物的成分比例有一定的差异，但还是有一定共性的。所以培养基中这集中营养成分不管由什么具体物质提供，其用量基本上也符合这种关系。 参照碳氮比确定。如果培养基中碳源过多，不利产物的合成。同样碳源过少或氮源过少对发酵的影响也是不利的。不同种微生物碳氮比差异很大，既是同种微生物在其不同生理时期对碳氮比要求也有不同，所以最适碳氮比要通过试验确定
44、，一般在100：之间。 、其他因素。培养基中一些用量极少的物质一般要严格控制，不能过量。例如，维生素、微量元素、某些生长因子、前体等。具体用量要通过试验确定。培养基中的一些成分的比例会影响培养基的某些理化性质，这时要引起重视。 7、叙述防止发酵菌种退化的具体条件措施有那些？ 答：控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。 创造良好的培养条件：如在赤霉素生产菌G.fujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退效果。 利用不易衰退的细胞传代：对于放线菌和霉菌，菌丝细胞常
45、含有几个细胞核，因此用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核的，用于接种就可避免这种现象。 采用有效的菌种保藏方法 合理的育种：选育菌种是所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞;合理选择诱变剂种类或增加突变位点，以减少分离回复突变；在诱变处理后及分离提纯化，从而保证保藏菌种的纯度。 、选用合适的培养基 在培养基中添加某种化学物质可以防止菌种退化。或者选取营养相对贫乏的培养基在菌种保藏培养基，限制菌株的生长代谢减少变异反而发生从而防止菌种的退化。 8、如何选择最适发酵温度？ 答：1、根据菌种及生长阶段选择。 微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。在发酵前期由于菌量
46、少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。 2、根据培养条件选择。 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。 3、根据菌生长情况 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气
47、能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。 9、不同时间染菌对发酵有什么影响，染菌如何控制？ 答：种子培养期染菌：由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素或只有很少抗生素。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。 发酵前期染菌：发酵前期最易染菌，且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物或产生很少，抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。 染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。 发酵中期染菌 ：发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂
