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1、第二讲 发酵工业菌种,提 纲,发酵常用微生物 发酵菌种的分离筛选 发酵菌种的培养 发酵菌种的选育 发酵菌种的保藏,2.1 发酵常用微生物,细 菌：大肠杆菌、枯草杆菌，谷氨酸棒杆菌 放线菌：生产抗生素，如链霉素、金霉素 酵母菌：啤酒酵母，假丝酵母，酿酒酵母 霉 菌：青霉，黑曲霉，梗霉 其 他：担子菌菇类微生物 藻类生物柴油制备,未培养微生物（uncultured microorganisms):无法采用现有常规方法在实验室里培养的微生物。常规方法：温度范围：10-70；压力范围：常压条件；pH范围：2-10；耐盐范围：低盐范围,发酵微生物的新宝库未培养微生物,黄石公园Obsidian Pool的
2、故事,75 95 OC富含Fe(II)、H2S、H2、CO2,Nanoarchaeum equitans来自海底热溢口的怪异新古菌,球菌：直径约为400 nm基因组：500 kb与一特异古菌宿主共生极端嗜热特殊rRNA：古菌中新的一界,N.equitans,Ignicoccus,99%的微生物尚属未知,Amann,Ludwig&Schleifer,Microbiol.Rev.59:143(1995),2.2 发酵菌种的分离筛选,发酵工业对菌种的要求使用廉价培养基，目的产物产量高；生长较快，发酵周期短；培养条件易于控制；抗噬菌体和杂菌污染能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病
3、原菌；,2.2.1 发酵菌种的来源,1）根据资料直接向有科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买；（ATCC，CCCCM，NCTC，IFO）2）从大自然中分离筛选新的微生物菌种；3）从生产过程中发酵水平高的批号中分离筛选；,中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统（CCCCM）,农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC)中国农业农业资源与农业区划研究所(IARRP)抗生素菌种保藏管理中心(CACC)中国医学科学院医药生物技术研究所(IMB)四川抗生素工业研究所(SIA)华北制药厂抗生素研究所(IANP)林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)中国林业科学研究院(CAF)普通微生物菌种保藏管理中
4、心(CGMCC)中国科学院微生物研究所(IMCAS)中国科学院武汉病毒研究所(IVCAS)工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)中国食品发酵工业科学研究所(IFFI)医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)中国药品生物制品检定所(NICPBP)中国预防医学科学院皮肤病研究所(ID)中国预防医学科学院皮病毒学研究所(IV)兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)中国兽医药品监察所(IVDC),2.2.2 菌种分离思路,新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优
5、良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。,定方案：查阅资料，了解菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。富集培养：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。菌种分离：利用分离技术得到纯种。菌种初筛和复筛：进行生产性能测定与优选。包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,2.2.3 菌种分离与筛选的步骤,（一）采样,1、采样对象 以采集土壤为主。一般田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园
6、内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,从自然界筛选,2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,（二）富集培养,为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物
7、才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,（三）菌种分离,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法：平板划线分离法 稀释分离法,（四）初筛和复筛,采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。初筛：平板筛选和摇瓶筛选复筛：摇瓶培养,有机溶剂耐受菌库,荧光圈直径/菌落直径,脂肪酶产生菌LX1,橄榄油罗丹明B平板,生产菌LX1,脂肪酶产生菌筛选与鉴定,鉴定为Pseudomonas
8、 aeruginosa,何冰芳等，一种耐有机溶剂脂肪酶其应用及其产生菌株，申请号：200910212447.4,实例：自然界中细菌的细菌筛选,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,（五）毒性试验,2.2.4 生产菌种的筛选,在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于
9、培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。,2.2.5 发酵工业菌种的鉴定,经典的分类鉴定法形态学特征生理生化特征血清学实验与噬菌体分离氨基酸和蛋白质分析 现代分类鉴定方法微生物遗传型鉴定（16S rRNA）细胞的化学成分特征数值分类法,2.3 发酵菌种的培养,发酵的一般过程：保藏菌种实验室培养种子扩大培养菌种发酵发酵下游处理 种子制备流程：保藏菌种实验室种子制备生产车间种子制备,生产车间种子制备,种子罐级数的确定：一、二、三级发酵接种龄的确定:对数生长期接种量：不同的菌种种子质量判断：形态、数量和生理生
10、长特性种子质量控制措施：综合考虑,2.4 发酵菌种的选育,菌种选育的重要性 运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。,发酵工业菌种育种的方法,常规育种：理化诱变育种细胞工程育种：杂交育种，原生质体融合代谢工程育种：组成型、抗分解调节、营养缺陷型、抗反馈调节突变株基因工程育种：定点突变和定向进化技术,育种方法选择时考虑的因素,(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发 酵试验)；(2)对菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度；(3)经济费用；如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多
11、半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。,2.4.1 诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱变,物理、化学诱变方法,1、诱变剂和诱变处理,物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由
12、专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。,化学诱变剂：碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂，烷化剂使用最有效。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是安全经济，用量少，设备简单；3、大部分诱变剂是致癌剂，使用必须非常谨慎，要 避免化学诱变剂与皮肤接触；,诱变剂的选择,1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十分有效。,2、诱变育种步骤,出发菌株的选择
13、 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选,(一)出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。,5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞
14、，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。,(二)处理菌悬液的制备,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,(三)诱变处理,根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,(四)中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。,方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样
15、，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,(五)分离和筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。,实例
16、：紫外线的诱变育种,新型诱变技术,低能离子束诱变 激光辐射和微波电磁辐射诱变 超高压诱变 低温等离子诱变 太空育种,离子束诱变选育D乳酸高产菌,Sporolactobacillus sp 10keV,N+离子束诱变 0.41015-6.61015ions/cm2,（溴酚绿指示剂）,（wild type 40 g/l）,突变筛选,Y1Y10,（88 g/l）,10keV,N+离子束诱变 0.41015-6.61015ions/cm2,Y11Y20,（溴酚绿指示剂）,低能量离子注入机,（120140 g/l）,突变筛选,2.4.2 营养缺陷型的选育,营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物
17、质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。,营养缺陷型的用途,营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。,2.4.3 基因工程育种,运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在
18、新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。,一个完整的基因克隆过程,获得待克隆的DNA片段（基因）；目的基因与载体在体外连接；重组DNA分子导入宿主细胞；筛选、鉴定阳性重组子；重组子的扩增与或表达。,2.4.5 杂交育种,细菌杂交酵母杂交,1、细菌杂交,在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。F因子存在于细胞中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)。F
19、因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。,2、酵母杂交育种技术,1）酵母繁殖方式酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，通常繁殖体为双倍体，但经特定诱导，可产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。酵母细胞可形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。,2）酵母杂交杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。,2.4.6 原生质体育种,原生质
20、体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。,原生质体方法,2.4.7 诱变菌种的筛选,筛选过程的成功依赖于排除那些已知的或并非需要的代谢产物的检验方法，这样才能识别出人们需要的化合物。性能鉴别；菌种筛选方法；,菌种筛选方案,初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所
21、以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,菌种筛选的手段,初筛从菌体形态变异分析 平皿快速检测法具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等 摇瓶培养法摇瓶培养法也可用于初筛。初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。,特殊变异菌的筛选方法,营养缺陷型突变株的筛选 经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营养缺陷型的筛选一般包
22、括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。抗性突变菌株的筛选 抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10-6频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法（噬菌体筛选法、耐高温法）和阶梯性筛选法（药物筛选法）两种手段。,组成酶变异株的筛选 许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。,2.5 工业微生物菌种保藏技术,在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏
23、，对于一成功的工业发酵过程极为重要。,1、理想的菌种保藏方法,(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别 是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。,2、工业微生物菌种保藏方法,1）冷冻干燥或真空干燥保藏；2）超低温或在液氮中冷冻保藏；3）转接培养或斜面传代保藏；4）土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏；,冷冻保藏,冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，
24、同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。,冷冻保藏种类,普通冷冻保藏技术(-20)超低温冷冻保藏技术(-60一-80)液氮冷冻保藏技术,普通冷冻保藏技术(-20),将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。该方法不适宜多数微生物的长期保藏。,超低温冷冻保藏技术,要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低
25、温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于超低温冰箱中保藏。如待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。,液氮冷冻保藏技术,1、冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。,2、液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1）待
26、冷冻保藏菌种悬液的制备；2）控速冷冻；(a)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于较大的 金属容器中；(b)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(c)以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度 之上几度的细胞冻结点(通常为-30)；(d)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可 能快地发生相变；,冻干保藏,冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外有运用动物血清的报道。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力
27、。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。,培养物的冻干过程,冻干菌种的保藏与再生,2.5.3 其他保藏方法,1、斜面传代保藏 2、矿物油中浸没保藏,1、斜面传代保藏,将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。,因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。,2、矿物油中浸没保藏,将琼
28、脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。,浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株23年也应做一次存活试验。,不同菌种保藏方法比较,基因工程菌的保藏,由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。,当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。,
