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1、基于EST和Genome序列设计SSR引物的步骤EST-SSR 引物开发步骤 1、首先计算机安装PC 版perl 程序，然后从GenBank/dbEST 中以FASTA 格式下载该种中所有的EST 序列，共29830 条。 2、利用Blastclust软件，对这些EST 序列进行冗余性查找，利用CD_HIT快速批量去冗余序列。 3、利用est_timmer去除EST 序列中过短的序列和过长的序列以及mRNA 的“帽子”和“尾巴”(A或T)。 4、利用misa.pl识别和定位SSR，其中配置文件misa.ini 用来设置识别SSR 标记的标准。 5、利用primer3 模块批量设计SSR 引物，
2、 引物设计的主要参数是， 引物长度2026bp； 退火温度Tm 值4865；含量30%70%；PCR 扩增产物长度大于150bp。 6、利用MacVector7.0 软件对所设计的引物进行验证，引物由上海生工生物技术有限公司合成。 Genome-SSR 的引物开发步骤 1、通过Genbank数据库，检索相近种的全基因组序列。保存成FAST格式。 2、利用SSRHunter1.3搜索基因组序列中的简单重复序列信息位点。 3、选取信息位点核苷酸重复基序为26个的序列为靶标序列，利用软件Primer Premier 5.0设计SSR引物，引物设计的主要参数是， 引物长度2026bp； 退火温度Tm 值4865；含量30%70%；PCR 扩增产物长度大于150bp。并用Oligo 6.65验证引物各项指标的适合度，看有没有引物二聚体、发卡结构等。 4、挑选满足一定条件的引物序列用于合成。 5、挑选不同居群的3-4个个体，对引物的可扩增性进行检测。对可扩增性的引物还要进行下一步的筛选工作。
