基因工程重点总结.docx

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1、基因工程重点总结第一章 绪 论 1、重组DNA技术：是指将一种生物体的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 4、基因工程的基本操作程序 .从供体生物的基因组中分离获取带目的基因的DNA片段 限制性核酸内切酶将含有外源DNA和载体分子切开 (3)DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到载体分子上，形成DNA重组分子 (4)将重组DNA分子引入到受体细胞 筛选和坚定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的记忆工程菌或细胞 (7）将选出

2、的细胞克隆的目的基因进一步演剧分析，并设法使之实现功能蛋白的表达 基因工程的工具酶 一、限制性核酸内切酶P15：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：表达产物协助酶识别特殊的作用位点。 1、粘性末端的意义P 连接便利 i）不同的DNA双链 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 5末端标记 凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴造成人

3、工粘性末端。 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 2、同裂酶：是不同来源分离出来的不同酶，但具有相同的识别顺序，切割DNA的方式可以相同，也可不同。如XmaI和SmaI 3、同尾酶：它们是不同的酶，但切割后可产生相同的粘性末端，因此同尾酶的切割片断之间可以相互连接，这种酶在分子生物学中有较大的价值。 4、远距离裂解酶：这类酶的识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别顺序结合，然后滑行到识别顺序以外的另一个位点进行切割。 5、可变酶：这类酶是II型酶中的一个特例，它们的识别顺序中的1个或几个核苷酸是可变的，并且其识别顺序般大于6个碱基对。 6、II 型限制性核

4、酸内切酶酶解注意事项 浓缩的酶应该用缓冲溶液稀释，稀释后应尽快用完； 保存在50%甘油中，-20度条件下； 酶切反应的时候，最后加酶； 酶从冰箱中取出后应该放置于冰上或者冰盒上； 酶应该分成小份，避免反复冻融； 取酶要用新的灭菌的吸头，避免污染； 加酶的体积不要超过反应体系的1/10。 7、影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的纯度 蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等 解决方法：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶 加大反应总体积，延长反应时间。 DNA甲基化程度 反应条件 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异

5、性，即Star activity现象。 EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%，可切割5PuPuATPyPy3 酶的纯度 酶切反应的温度和时间 大多数的内切酶，最适反应温度为37度，但也有例外，如Sma I 为25度。酶解时间可以通过加大酶量而缩短。 8、限制性内切酶的命名 二、DNA连接酶 1. 两种DNA连接酶 大肠杆菌连接酶 需要 NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。 T4噬菌体DNA连接酶 以ATP作为辅助因子；不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端；RNA:DNA杂交分子中RNA上的缺口。 2. T4噬菌体RNA连接酶 以ATP作为辅助因子；催化单

6、链DNA或RNA的 5-p与3-OH共价链接 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团。 需要能量 动物或噬菌体中：ATP ；大肠杆菌中：NAD+ 1 第二章 只能连接相邻核苷酸之间的缺口 3. 影响连接反应的因素 (1)DNA末端的浓度 (2)反应温度 ATP浓度 三、常用的DNA聚合酶的特点 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3OH端。 2. 主要区别 持续合成能力和外切酶活性不同 3. DNA聚合酶在基因工程中的用途 大肠杆菌DNA聚合酶I 基本性质：53的DNA聚合酶活性;53的核酸外切酶活性；35的核酸外切酶活性。 基本用途 缺口前移标

7、记法：Nick translation ；制备P标记的探针。 Klenow fragment Klenow fragment的性质 具有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。 基本用途 v 3端补平 补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。 v DNA 3末端标记 在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 v 在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成。 v 双脱氧末端终止法测定DNA序列 T4 DNA聚合酶 基本特性： a.具有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。 b.在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切 c.在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 d.在有四种dNT

8、P均存在时，聚合活性占主导地位。 基本用途 a.补平隐蔽末端； b.DNA 3末端标记 标记 a. 放射性标记 b. 非放射性标记 i）生物素标记： 生物素，又称维生素H、辅酶R 可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。也可以被生物素连接酶催化与蛋白质共价结合。 生物素的识别亲和素： 能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用： 抗生物素蛋白：是一种鸡卵清蛋白 链霉抗生物素蛋白：细菌中avidin的类似物 ii）地高辛标记： 可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。 地高辛的结合物是抗地

9、高辛抗体。 iii）偶联酶及其底物 常用的两种酶：辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 酶的作用：催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光。 iv）用非放射性标记的探针检测原理 探针DNA用生物素或地高辛标记，亲和素或地高辛抗体与酶偶联，酶催化一个发光或显色反应，亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。 核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。 T7 DNA聚合酶 从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基：有53的DNA聚合酶和35的核酸外切酶活性 大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白， 增加大亚基对模板的亲和性 T7

10、DNA聚合酶的特点： u 持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 u 35外切酶活性高：单链和双链都能降解。 u 不受DNA二级结构的影响 T7 DNA聚合酶的用途 以大分子量DNA为模板的合成：如M13 进行末端标记：与T4 DNA聚合酶相同 补平隐蔽末端：合成补平3隐蔽末端； 水 解修平3突出末端。 修饰后的T7 DNA聚合酶 T7DNA聚合酶的化学修饰 去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚 合速率提高了3倍。 修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 l Sanger双脱氧链终止法对长片段DNA进行测 序的理想用酶 l 标记DNA 3隐蔽末端 l 更有效地补平末端 Taq-D

11、NA聚合酶 具有耐95左右高温达30min以上的特性； 2 催化53的DNA新链合成，最适温度6872，合成速度1200bases/min； 在合成的DNA链的3端常多一个“A”； 不具35的外切酶活性,即无校正功能，大约每合成500个碱基要错配一个； 具微弱的53的DNA外切酶活性。 pfu聚合酶 v 具有耐95左右高温达30min以上的特性； v 催化53的DNA新链合成，最适温度6872，合成速度600bases/min； v 合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A； v 合成的DNA片段长度在2kb以内； v 具35的外切酶活性,即有校正功能； v 无53的DNA外切酶活性。

12、Taq Plus I DNA Polymerase 具有耐95左右高温达30min以上的特性； 催化53DNA新链合成，6872最适； 可合成10-30kb的长DNA片段； 合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A； 具35的外切酶活性,有很强的校正功能， 大约每合成1.6x106个碱基要错配一个； 具微弱的53的DNA外切酶活性。 Pyrobest DNA polymerase u 高保真性和Pfu 等DNA聚合酶相同， Taq 的10倍以上。 u 良好的扩增性能，优于 Pfu 等DNA聚合酶。 u 扩增得到的PCR产物为平滑末端 依赖于RNA的DNA聚合酶 反转录酶的基本特性：以RN

13、A为模板聚合cDNA链 M-MuLV:鼠源RT, 来源于鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus) 最适温度42, 以RNA、DNA或RNADNA杂分子为模板，需引物，需Mg2+或Mn2+为辅助因子，具有RNase H活性，特异性地对RNADNA杂分子中的RNA降解 禽源RT, 来源于鸡成髓细胞增多症病毒(Avian Myeloblastosis virus) Powerscript Reverse Transcriptase CLONETECH公司的专利产品，源于M-MuLV的一个点突变。无RNase H活性，故合成的cDNA不会因此变短。具有末端转移酶活性，

14、倾向加3个“C”。用于合成全长cDNA。 三、核酸酶 1. 单链核酸外切酶：核酸外切酶VII 大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ 2. 双链核酸外切酶：核酸外切酶 III 大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3端外切 3.双链核酸外切酶：核酸外切酶 核酸外切酶特异性地从5 端外切 4.单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶基本特性： 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍；Zn2+必需；最适pH范围为4.0 - 4.3；需要NaCl 10 - 300 mM；降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。 5.Bal31核酸酶 Bal31核酸酶的基本特性： A: 来自艾氏交替

15、单胞菌 B: 单链内切双链外切的核酸酶： Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变 四、核酸修饰酶 1.末端脱氧核苷酸转移酶 53DNA聚合酶活性 末端转移酶的特性： 需要3OH、二甲胂酸缓冲液。 不需要模板。 底物可以是单链DNA是3OH突出的双 链DNA平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 随机添加的dNTPs，如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。末端转移酶的用途： 同聚物加尾：给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。 再生酶切位点：便于回收克隆片断。 非放射性标记DNA片断的3端： 催化非放射性标记物参入DNA片断的3端。 2.T4多核苷酸激酶P35

16、 功能：催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。 如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。但天然的DNA的5端都是磷酸化的。 多核苷酸激酶的用途： u 正向反应 u 交换反应标记法 反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时， 多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与 DNA5端的磷酸交换。 3. 碱性磷酸酶 来源于牛小肠碱性磷酸酶 可催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5磷酸变为5-OH末端 第三章 用于基因克隆的载体 载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 3

17、 载体应具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性，具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，具有较高的外源DNA的载装能力，具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点， 具有合适的筛选标记。 一、质粒载体 A: 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子； B: 质粒常见于原核细菌和真菌中； C: 绝大多数的质粒是DNA型的； D: 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA； E: 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb。 1.天然质粒的缺陷 分子量大，拷贝数低；筛选标记不理想。 2.理想载体条件 具有较小的分子质量和

18、较高的拷贝数 具有若干限制性内切酶的单一酶切位点，以满足基因克隆的需要 具有两个以上的选择标记基因 (4)缺失的mob基因 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达 3.质粒的选择标记及其工作原理 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记： 氨苄青霉素抗性 卡那霉素抗性 四环素抗性 链霉素抗性 氯霉素抗性 i）氨苄青霉素,青霉素的衍生物。 a.抑菌原理，通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。 b细菌抗性原理：Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。 ii）氯霉素 a.抑菌原理：通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细

19、菌。 b.细菌抗性原理： Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。 iii）卡那霉素 a.杀菌原理：通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。 b细菌抗性原理：Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。 iv）链霉素 a.杀菌原理：通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。 杀死细菌。 b.细菌抗性原理： Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。 v）四环素 a.抑菌原理：通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。 b.细菌抗性原理：Tet

20、r 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。 4.重要的大肠杆菌质粒载体 pBR322: 松弛型复制；氯霉素可扩增；拷贝数 50 - 100 / cell；用于基因克隆。 a.元件来源： 复制起点 ori：pMB1系列的高拷贝型复制起点； Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因； Tetr基因：pSC101的Tetr 基因。 b.选择标记:氨苄青霉素和四环素抗性 c.pBR322的优点: 双抗菌素抗性选择标记：插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet中都死亡。 获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡。 分子小

21、，克隆能力大：载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全：失去了转移蛋白基因mob。不能通过接合转移。 pUC18 / 19(P43)： 拷贝数 2000 - 3000 / cell；装有多克隆位点；正选择颜色标记 lacZ；用于基因克隆和测序。 a.元件来源: 复制起点:pBR322的 ori Ampr 基因:pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。 lacZ的启动子:大肠杆菌 lacZ基因:大肠杆菌lacZ的-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。 b.正选择标记 lacZ 的显色原理: -半乳糖苷

22、酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 -肽： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断。 lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.; 受体菌lacZ突变 受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失，不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 载体lacZ与互补 4 pUC质粒载体上的lacZ编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。 互补的插入失活 pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。 c.IPTG的诱导作用 IPTG

23、是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ肽都表达。从而互补。 d.pUC系列载体的优点 更小的分子量 选择方便:Xgal显色、抗菌素双重直接选择。 克隆便利:具有多克隆位点 测序方便 pGEM-3Z 由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。 可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录 pGEM-3Z的特点： 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA 外源基因正接反接都可以转录。 MCS与pUC18的完全一样。 噬菌体或病毒DNA(P52-56) 噬菌体或病毒的D

24、NA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：a.高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；b.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。 单链噬菌体载体 M13的生活周期 M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA，+DNA合成DNA，形成RF dsDNA，DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白，组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞。 M13载体的构建 a.克隆区域的选定 i.基因间隔区 M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。 ii.酶切位点 IG区内只有一个 BsuI 切点。 b.加入酶切位点 i.在IG区内加入单一内切酶位点 黏粒质粒:组成

25、包括质粒复制起点、抗性标记、cos位点 噬菌粒 噬菌粒载体的特点 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 a.能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 ；b.能像质粒那样在受体细胞中自主复制；c.装载量比常规的M13mp系列要大很多；d.通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA；e.重组操作简便，筛选容易 人工染色体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体(BAC) 表达载体构建的原则 1阅读框与外源基因高效表达 2启动子与外源基因高效表达 3转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达 4有效地翻译起始与外源基因高效

26、表达 5终止密码选择与外源基因高效表达 6外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达 第四章 核酸操作的基本技术 1 核酸提取基本原理 碱抽提法提取质粒DNA原理 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。 所用的试剂作用 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件下有活性。 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解。 EDTA Mg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-

27、SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质变性沉淀。 NaAc-HAc缓冲液 冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的NaAc有利于变性的大分子沉淀。 乙醇 用于沉淀DNA。DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 RNase A 5 降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE缓冲液 DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子，有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止

28、DNA被酶降解。 碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第一步：溶菌 使用“溶液”溶解细菌细胞壁。 Solution I 的配制：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNase A 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 Solution II 的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS 第三步：中和 溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。 Solution III的配制：3M 醋酸钠 第四步：离心除去沉淀 上清液中含有闭合质粒DNA。 第五步：纯化DNA 上

29、清液过柱或酚-氯仿抽提。 第六步：沉淀DNA 0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。 2基因组或其他DNA的提取 3 DNA的定量和纯度测定 4 核酸的保存 DNA的保存 最好是溶于TE中，短时间保存可放于4冷藏室。70下DNA能保存5年以上，一般的长期保存只需放于20。DNA样品中加入1滴氯仿，可避免细菌和核酸酶污染，但实验前需通过乙醇沉淀及洗涤去除氯仿。 RNA的保存 RNA溶可溶于0.3mol/L的醋酸钠或无RNase的双蒸消毒水，70保存。 RNA的长期保存可以以沉淀形式贮存于乙醇中，在20至80保存。 RNA溶液中，加一滴0.2mol.L的VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于70，可保

30、存数年。 5 DNA的凝胶电泳：DNA琼脂糖凝胶电泳,对0.8到10kb的dna有最佳的分离效果;聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨效率高，可分辨100bp到1kb的大分子，最单核苷酸链来说分辨率额可以达到1bp 6 核酸的分子杂交 分子杂交：不同来源的单链核酸，只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为分子杂交。 Southern bloting：Zorthern bloting Western bloting 7 DNA序列分析 双脱氧链终止法原理 DNA复制是以一条链为模板，按碱基配 对的原则进行的。 脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。 复制反应可以在体外进

31、行。 2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。 双脱氧链终止法技术要点 a. 制备单链DNA模板 b. 制备一小段单链引物 需带有放射性或荧光标记。 c. 特殊的DNA多聚酶 i.不能有53和35的外切酶活性； ii.与模板的亲和力高，不会提前脱离模板 d. 制备2和3双脱氧的ddNTP 第五章 聚合酶链式反应 1.PCR反应原理 DNA模板变性 95oC 双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。 DNA模板与引物复性 40-65oC 引物:人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。 DNA链的延伸 72oC DNA聚合酶按碱基配

32、对原则延伸DNA链。 新一轮循环开始 变性复性延伸。 理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。 1个循环的结果 2.PCR反应曲线 3.PCR的过程 第一步 变性 94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。 第二步 复性 6 50-60 oC下1分钟，引物与模板复性。 引物的浓度高， 引物的链短。 第三步 延伸 72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。 第四步 变性 94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。 第五步 重复 4. PCR的特点 特异性强 PCR使用专门合成的DNA引物。 延伸过程是在高温下进行。 这就避免

33、了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。 敏感性高 ：需要的模板量极低 快速：整个PCR过程约4小时即可完成。 简便：对模板的纯度要求低。 可以扩增mRNA RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。 5.影响 PCR的因素 Taq DNA聚合酶 热稳定性 最适温度高 最适温度：72-78 oC 延伸速度：约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb Taq酶的功能缺点 具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。 Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感。 当dNTP的浓度为0.7-0.8mmol/L时

34、，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。引物的短DNA。 引物的长度 理论计算：419=2.751011。 即2.751011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会。 引物的碱基序列 3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。 引物的碱基组成 i.尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力。ii.避免连续相同碱基排列或内部回文序列. iii.避免形成引物二聚体，两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。 引物的Tm值 手工计算：Tm=含量低于50%时，复性温度低于55oC。实际复性温度选择低于Tm值5oC 引物的浓度 简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨

35、基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。 套嵌引物 dNTP dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性 模板DNA 纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。 模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。 Mg2+ Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般

36、的 PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 6.标准的PCR反应体系 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul 7.提高PCR扩增的特异性 一定范围内提高退火温度； 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及 多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会； 降低引物和酶的浓度可以

37、减少错误引发， 尤其是能减少引物二聚体的引发； 7 改变Mg2+的浓度； 引物设计的特异性； 减少循环次数； 热启动 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来 提高扩增的特异性 8.引物设计的基本原则： 典型的引物1到30个核苷酸长 ； 选择GC含量为45到55碱基的分布是随机的； 避免引物间和引物内产生碱基以上互补； 避免3末端的错误配对； 设计5端和中间区为G或C的引物； 避免引物对3末端存在互补序列； 避免3末端富含GC，设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 避免存在可能会产生内部二级结构的序列。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物量：每条引物的浓度

38、0.1 1umol或10 100 pmolRT-PCR 引物设计特别注意：跨越两个外显子 附加序列:目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。 9 聚合酶链式反应技术类型 巢式PCR： 是为了增加扩增的灵敏度,对已知序列设计出第一对引物,扩增25个循环,然后根据序列设计第二对引物(在第一对引物内部),如此扩增,不受平台效应限制,灵敏度高。 降落PCR： 其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火

39、温度时比较适合。 竞争引物PCR： 有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。 不对称PCR： 用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。 技术关键：两个引物的浓度相差100倍。 锚定PCR 锚定PCR是在未知DNA cDNA片段的一个末端人工接上一个已知序列片段,利用一个基因特异引物与这个人工序列区引物进行扩增，所以它是一种半特异性扩增。 反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列 技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子。 兼并引物PCR 兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能

40、性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3末端兼并，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。 RT-PCR 在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应。 技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 实时荧光定量PCR 常规定量PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量，重复性差，半定量。 实时定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量。 实时荧光定量PCR原理 在PCR反

41、应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 i.Ct 值 C代表Cycle，t代表threshold(荧光域值)。 含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 ii.荧光域值的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 iii.Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中

42、横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 iv.荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针，荧光染料。 v.TaqMan荧光探针 与目标序列互补的寡核苷酸探针 两端分别标记一个报告荧光基团(荧光素)和一个淬灭荧光基团(淬灭剂)。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 8 实时荧光

43、定量PCR的特点: 特异性强：具有引物和探针的双重特异性 重复性好：同一标本的Ct值相同 敏感性高：可检测百万分之一个感染细胞或10病毒DNA分子 线性范围广：定量的动态范围达5-6个数量级，因而相差较大的DNA起始拷贝数也不需稀释 工作效率高：一次定量96个样品仅需1-2h 但仪器及配套试剂极其昂贵 10.聚合链式反应的应用 第六章 目的基因的克隆与基因文库的构建 一、基因组DNA片断化 1.限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。 优点：由于有粘性末端，产物可以直接与载体连接。 缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！ 2.随机片断化 限制性

44、内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。 a.限制性内切酶的选用原则 i.内切酶识别位点的碱基数：影响所切出的产物的长度和随机程度。 1）4bp的内切酶：平均每44bp一个切点。随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。 2）6bp的内切酶：平均每46bp一个切点。 ii.内切酶粘性末端：能与常用克隆位点相连 机械切割法 a.超声波：超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。 b.高速搅拌：1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。 二、基因文库的构建 1. 基因文库 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 2. 构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 对载体的要求 载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 3. 基因文库构建的一般步骤 染色体DNA大片段的制备 断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。 物理切割法： 超声波或机械搅拌。 酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的