多糖的提取和纯化.docx

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1、多糖的提取和纯化多糖的提取和纯化 目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50，以防止糖昔键断裂。稀碱法适合于提取碱溶性糖。然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。第四步是沉淀多糖。大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉

2、淀。常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。最后是除去蛋白质。除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。 多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。 纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内

3、的均一组成。因此，测得的分子量一般为平均分子量。过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。 1.2.1发酵、提取 取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25下通 气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。 上述菌丝体经水洗涤后，用3倍量热水(90一100)浸取3h，浸取液经浓缩加3倍量95肠乙 醇，离心得乙醇沉淀物一Le。 1.2。2

4、分离、纯化 取Le上样于DEAE一纤维素柱上，用O。Olmol/L pH 6.95 Tris-HCI缓冲液洗脱，洗脱液分 部收集，分别用UV(280nm)和酚硫酸法测定其吸收值(A值)，合并吸收峰重叠的洗脱液，经浓 缩、透析、冻干得淡黄色絮状物Le一2 Le一2进一步用DEAE一纤维素(DE52型)分离，先用pH7.8的0.oosmol/L硼酸缓冲液洗脱， 后用含lmol/L NaCI的o.Zmol/L硼酸缓冲液洗脱.各洗脱液按上法用UV230nm和酚硫酸法 检测，分别收集既含肤又含糖的洗脱液.用o.005mol/L硼酸缓冲液洗脱的组分为Le一2一1，用含 lmol/L NaCI的硼酸缓冲液洗

5、脱的组分称Le一2一2o 1.2.3鉴定 1.2.3.1纯度 (l)HPLC法 将样品配成1%浓度后进样.进样量20召L。流动相:0.002mol/L NaAc;流 速:0.6ml/min。记录色谱曲线和样品保留时间(Tr)。 (2)醋酸纤维薄膜电泳 缓冲液:pH8.6巴比妥缓冲液.电压12OV，25min.阿利新蓝法 染色. 123.2分子量测定 用T系列标准葡聚糖(T-40:44，400 Da；T-70：85，000 Da；T-110:110，000 Da;T-500:450，000 Da)上HPLC柱，测出保留时间后对分子量对数作出标准曲线.然后根据样品的保留时间，从标 准曲线上求出样品

6、分子量。 1.2。3.3单糖组成 (l)薄层层析将Le一2一1及Le-2一2分别用三氟醋酸在110下水解4h.蒸去三氟醋酸并蒸 干，用3ml水溶解后点样。层析板:醋酸纤维素层析板(DC一Aufolien CelluloseF。);展开剂:正 丁醇(BuOH):毗唆(Py):水(HZO)二6:43;显色剂:苯胺一邻苯二甲酸. (2)气相色谱取上述水解液加IOmg NaBH。在室温下还原Zh，用冰醋酸调pH至5，减压蒸 干后加lml乙酸配，100水浴lh，进行乙酞化处理，将乙酸化产物的氯仿抽提液作气相色谱分 析，柱温205，气化温度250。 13.1多糖的分离、纯化将长裙竹荪子实体干品洗净、剪碎，

7、用5倍的3%三氯乙酸溶液于 5提取8h，离心，收集上清液，用4N NaOH溶液中和上清液至pH7，浓缩、离心，上清液加3倍 体积的95%乙醇沉淀，收集沉淀物，冷冻干燥得粗多糖，得率约为8%.粗多糖含蛋白质较多，采 用蛋白酶法脱蛋白一次，Sevag法脱蛋白5次，去蛋白液经透析，加3倍体积95%乙醇沉淀， 水溶解，再醇析，反复三次得脱蛋白多糖。脱蛋白后的多糖(2 .0g)溶于水(1Oml)中，用DEAE一纤维素(Cl-)型柱(3.3X53cm)层析，用水作洗脱剂，分部收集，每管10ml，用硫酸一苯酚法测定 多糖的分布。合并多糖单一峰位部分，减压浓缩至5ml，再进行一次DEAE一纤维素(B4O7 2

8、-型) 柱(1.8x50cm)层析，用水作洗脱剂.分部收集，用硫酸一苯酚法测定多糖分布.合并单峰洗脱 液，浓缩至小体积，用SephadexG一200柱(2.OX5ocm)进一步纯化用o.05mol/1 NaCI溶液作 洗脱剂，用硫酸一苯酚法测定多糖分布，合并单峰洗脱液，透析去盐，浓缩，再加3倍体积的95师 乙醇沉淀，沉淀物经冷冻干燥得到多糖，命名为DIA。 1.3.2纯度鉴定聚丙烯酞胺凝胶电泳按文献方法进行.阿利新蓝染色。 醋酸纤维薄膜电泳按文献方法进行，缓冲液为o.025mol/l pHg.0的硼砂缓冲液，纸长 scm，电压160V，电泳50min，阿利新蓝染色。 凝胶过滤法采用Sephar

9、osc 4B柱(79 X 1 .6cm)进行凝胶层析，用蒸馏水洗脱，硫酸一苯酚 法隔管测定多糖的分布。 紫外分光光度法采)JI UV一300进行扫描(200一400nm)。观察260nm、280nm处是否有吸收 峰。 根据上述测定结果，鉴定多糖的纯化。 1.3.3分子量测定采用Sepharose 4B凝胶柱(79x l.6cm)层析，洗脱剂为蒸馏水，洗脱 速度为3ml/8min，分部收集，用硫酸一苯酚法测定多糖的分布。再以标准葡聚糖T一40 (44 .4Kd)、T一70(85Kd)、T一110(110Kd)和T一500(45Kd)分别重复上柱，测得各自的洗脱体积 Ve，以Log M.W.对洗脱

10、体积VO作图得标准l山线。山多糖DIA的洗脱体积，查标准曲线图，求得 该多糖的分子量。 1.3.5纸层析分析多糖DiA用2N H2SO4封管，100 水解6h，水解液用BaC03中和、过滤、 浓缩后点样分析。采川新华中速层析滤纸，下行法。溶剂系统为醋酸乙酯:吡啶，水 =10，4，3;显色剂为苯胺一邻苯二甲酸。 干品洗净剪碎5倍蒸馏水，98-100 提取5h纱布粗滤，离心3000转/分上清液适当浓缩，加3倍95乙醇沉淀，离心3000转/分沉淀冻干粗多糖蛋白酶法和sevag法脱蛋白脱蛋白多糖Sephadex A-25柱层析，先用0.1mol/LNaCl洗至无糖检出，再用0.1-3.9mol/LNa

11、Cl梯度洗脱含糖部分Sephadex G-200柱层析0.1mol/LNaCl洗脱多糖纯品 Sevag法(即氯仿与正丁醇的比例为3:1)脱蛋白,振摇0.5h左右,使样品中蛋白质与混合液形成凝胶,再反复多次用离心法除去。 1 多糖研究概述 1.1 多糖提取：多糖多为水溶性多糖，组分不溶于高浓度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。多糖的提取一般分三步进行。浸提：一般采用冷水或温水浸提。浸提一段时间后，加乙醇或丙酮深淀，离心分离沉淀。用乙醇或乙醚脱水，最后真空干燥或冷冻干燥后得粗多糖。 脱蛋白：用丧Sevag法 (即氯仿与正丁醇的比例为3:1)脱蛋白，振摇0.5h左右，使样品中蛋白质与混合液形

12、成凝胶，再反复多次用离心法除去。也可用三氯醋酸法，三氟三氯乙烷脱蛋白。纯化：多糖纯化多采用柱层所。脱蛋白后的多糖用水溶解后，用DEVE纤维素柱层析，然后依次用不同浓度的Na2CO3，NaOH洗脱。此外，纯化还可采取凝胶柱层析法，超滤法等。 1.2 多糖分子量的测定：所谓多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组分，因此测定的多糖分子量为平均值。以前多采用蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差很大。目前常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于一百万的多糖，用高压液相法为最好。 1.3 多糖结构的确定：多糖的活性与其

13、结构有关，但确定多糖的细微结构是很难的，原因是分级纯化难关，从自然界分离的粗多糖是非常复杂的大混合物，包括生物大分子混合；不同多糖(中性多糖、酸性多糖或杂多糖)的混合；同种多糖大小分子的混合，必须采取适合特点的方法分离分级纯化，否则不易确定其结构。 从同一样品采用不同分级方法，常有不同结果。植物的不同部位，因功能不同，其中的多糖也是各色各样的，必须分开来研究。比如人参的根、茎、叶、果中的多糖，虽都含有中性杂多糖、酸性杂多糖组分，其组成与结构都是不同的。在人参茎、叶、果的中性杂多糖、酸性杂多糖组成中都有葡萄糖，而根的中性杂多糖、酸性杂多糖组成中都没有葡萄糖，而只有以葡萄糖为主链的类淀粉多糖储存在

14、根部。 多糖结构确定有化学降解法、酶降解法、免疫化学法、放射化学法、红外光谱法、核磁共振法、气相层析法、质谱法、质谱与气相层联用、高效液相色谱法等，要完成对多糖整体结构的分析，必须将各种方法结合起来。 多糖的结构研究，还不能忽视金属离子的贡献，多糖链中含烃基、乙酰基、氨基、硫酸基等易与多种金属离子形成络合物。多糖在自然环境中是否与金属离子有关系，如何才会是其最佳状态，也是应考虑的。金属离子的加入或可能是多糖的活性中心的成员，金属离子的存在因络合多糖链而会影响构象变化。多糖的结构确定与生物活性测试后，研究者的进一步是研究其构象、大分子间相互影响、活性中心、金属离子影响以及化学修饰的研究，从不则角

15、度来阐明结构与功能的关系。 2.1 工艺流程 银耳孢子发酵粉热水煮提冷却离心沉淀加一定浓度NaOH液搅拌，离心上清液3V乙醇沉析多糖沉淀多糖粗品蒸馏水加热溶解冷却离心上清液Sevag法除蛋白离心取上清液减压浓缩蒸馏水透析透析袋内容液3V乙醇沉析多糖沉淀真空干燥精制多糖离子交换层析洗脱液减压浓缩3V乙醇沉析多糖沉淀银耳碱提取多糖离子交换层析纯化洗脱液减压浓缩3V乙醇沉析多糖沉淀干燥均一体银耳碱提取多糖。 2.2.1 水提取 取300g银耳孢子发酵粉，加入10倍量的水，煮提约4h。煮后放冷，将提取液离心。提取后的残渣加入约10倍的水，以相同的方法煮提2次并离心分离，收集沉淀。合并3次所得的上清液，

16、浓缩至小体积后放置，另作它用。取少许沉淀，加入水搅拌溶解后离心，用苯酚-硫酸法检测上清液反应阴性。将所得沉淀于50烘箱中烘干，粗多糖重量为188.8g。 2.2.2 碱液提取 取140g粗多糖，加入0.5mol/L NaOH1000ml，搅拦提取6h，离心15min，沉淀以相同的方法再提取2次，合并3次所得的提取液，沉淀另置。将提取液减压浓缩至约原体积的1/3，以1mol/L的HCl中和至pH=7，中和液减压浓缩至小体积。浓缩后的中和液用流动水透析3天。透析后的溶液用3V85%乙醇沉析，离心15min。收集沉淀，得到0.5mol/L NaOH提取的碱溶性多糖。0.5mol/L NaOH提取后的

17、粗多糖，继用1mol/L NaOH、2.5mol/L NaOH、5mol/L NaOH分别进行提取，得到1mol/L NaOH、2.5mol/L NaOH、5mol/L NaOH提取物。将0.5mol/L NaOH提取物用约700ml水搅拌溶解，加入175ml Sevag试剂，机械搅拌0.5h，离心。反复用此法除蛋白，直至无蛋白质反应为止。将所得上清液减压浓缩至小体积，流动水透析3天，透析袋内溶液用3V85%乙醇沉析。抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，得0.5mol/L NaOH提取精制多糖，称重为4.470g。以相同的方法对上述1mol/L NaOH、2.5mol/L NaOH

18、、5mol/L NaOH提取物除蛋白。除蛋白后的各提取物重量分别为3.908g、0.929g、0.399g。 2.2.3 分离、纯化 分离 710 :取600mg0.5mol/L NaOH提取所得精制多糖加入10ml蒸馏水，使之充分溶解，抽滤，取滤液。将滤液加于已经预处理的DEAE-32-纤维素层析柱，用0.1M NaCl溶液洗脱，流速为0.5ml/min，每10ml为1个单位分部收集，苯酚-硫酸法检测。合并单一洗脱峰浓缩至小体积，以流动水透析。透析液加入3V85%乙醇沉析。抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，多糖重量为148mg。以相同的方法分别对1mol/L NaOH、2.5m

19、ol/L NaOH、5mol/L NaOH提取物进行DEAE-32-纤维素柱层析，分别得到单一洗脱峰。1M，2.5M，5M提取物分别得多糖113mg，180mg，157mg。 纯化:用相同的方法分别对0.5M、1M、2.5M、5M提取物所得多糖用DEAE-32-cellulose柱层析纯化，洗脱液为0.1MNaCl，苯酚-硫酸法检测。所得多糖纯品重量分别为TFFB-A112mg、TFFB-B82mg、TFFB-C98mg、TFFB-D121mg。 2.4 纯度检查 取醋酸纤维素 薄膜，置于缓冲液中浸泡10min后取出，吸去 多余的水分，在薄膜中央点样，电压为240V，电泳约40min。电泳完毕

20、后，取出薄膜，置于染色液中染色15min后脱色。结果TFFB-A、TFFB-B、TFFB-C、TFFB-D四个样品于薄膜负极方向均有一个斑点。 2.5 单糖组成分析 2.5.1 纸层析 分别取各个多糖纯品10mg溶于2ml2mol/L三氟乙酸中，封管，沸水中水解6h。冷却后点样于What-man No.1层析滤纸上，用乙酸乙酯-吡啶-水-冰醋酸展开剂饱和后展开，展开后用苯胺-邻苯二甲酸显色，用相应的标准品做对照。结果如图1。 图1 银耳碱提取多糖水解物纸层析结果1D-葡萄糖 2D-半乳糖 3D-甘露糖4D-木糖 5TFFB-A 6TFFB-B7TFFB-C 8TFFB-D 9葡萄糖醛酸10D-阿拉伯糖 11鼠李糖 12D-果糖 从图1中可以看出，TFFB-A单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-B单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-C单糖组成为:鼠李糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-D单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖或半乳糖。各糖的Rf值之比为:D-葡萄糖;D-半乳糖;D-甘露糖;D-木糖:葡萄糖醛酸:D-阿拉伯糖:L-鼠李糖:D-果糖=1:0.9:1:1.2:0.8:1:1.5:0.8。