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1、多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作。多糖的性质往往与它的分子量大小有关。例如，多糖溶液的粘度不但随浓度的增大而升高，而且与多糖分子量大小有关。一般说来，分子量增大，粘度增高。在生物学研究中，发现某些多糖由于分子量大小方面的差别，所产生的某些效应也有一定差异。,第5章 多糖的分子量测定,由于不同分子量大小的多糖具有不同的性质，在多糖的应用中，如以其作为试剂使用于某些实验时，往往需要在它的分子量大小方面作选择。可见,不论在多糖性质的研究，或是在它的用途等方面，都涉及分子量方面的问题，往往需要测定它的分子量。因而测定分子量成为研究和制备多糖的一项经常性工作。,第4章 多糖的干燥和纯度
2、鉴定,测定多糖分子量时，为了避免因存在杂质而影响测定结果，需要把检测的样品(简称样品或检样)适当提纯。用于分子量测定的样品，纯度要求虽然不十分高，但至少要达到:(1)去除杂质和水分。(2)把不同化学结构的组分相互分开，使它们在测定分子量中不相互干扰。(3)把不同分子量大小的组分相互分开。另外,在用某些方法进行分子量测定时，需要先将小分子量的盐和单糖除去。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,一、渗透压法：利用膜渗透压计(Membrane Osmometer，简称MO仪)可以测定范围在1万50万之间的多糖分子量。本法不需用标准品.原理:把多糖水溶液装在半透膜制成的透析袋内，袋外为溶剂(水)，水分子可以
3、自由通过半透膜，多糖分子则不能通过透析膜，因此袋内的多糖分子必将吸引更多的水分子渗入袋内，形成一定的渗透压。渗透压与溶液中的溶质分子数有关，可以用范特荷甫公式表示，即 V=nRT(1-1)式中渗透压；V溶液体积；n溶液摩尔数；R气体常数；T绝对温度。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,因 n=W/M，W=CV,代人上式简化后得:M=RT/(/C)(12)C:浓度 有些研究者认为应当考虑溶剂在不同温度时的密度D，即 M=RT/(/c*D)(13)D:密度 仪器和试剂 本试验采用的膜渗透压计为德国Knauer公司的膜渗透仪.与该公司特制的专为测定水溶性物质用的双层膜作为半透膜,溶剂为脱气蒸馏水。膜渗透
4、仪的主要部件是渗透池,由半透膜分隔成上下两池,下池底部中央有一压敏换能元件。操作时先将下池充满纯水，加上半膜后再将上池充满测定的溶液。在恒温条件下使两池达成平衡，压力之差由换能器输出信号放大后记录，求得值.,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,膜渗透压计示意图,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,操作 以右旋糖酐分子量的测定为例。(1)仪器准备：将脱气后的蒸馏水充满下池。浸泡好的半透膜覆盖其上并注意勿使气泡进入。将上池压紧。按操作要求逐步旋紧中心螺丝(约8小时)，装上针阀及校正杯进行仪器校正(约12小时)，取下针形阀及校正杯，装上进样管，用溶剂充分冲洗后，开动记录仪，划出基线(约12小时)。(2)样品准备
5、：每一测定的样品需配35个不同浓度的溶液。本试验中用右旋糖酐配制成 O.209 g100 mL(C1)，O.403 g100 mL(C2)及O.626 glOO mL(C3)3种浓度的溶液。(3)样品测定：先用浓度为C1的样品由进样管注入上池，清洗3次，再注满进行测量，直到记录仪达到平衡。划出的直线与基线之间的距离即为该浓度溶液的值。同法测定C2，C3溶液的值。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,第六章 多糖的分子量测定,(4)分子量计算：R气体常数（848）T绝对温度渗透压D密度,将/C对C作图求得 RT/C c0为1.50。T=24 M=，D=0.9973代人式得:D M168O00.CC-O
6、,二、端基法 原理测定单位重量样品中所含可测端基之数，计算检样的分子量.例如,对某一种多糖的分子结构，业已明确知道它每一个分子链含有一个可测端基和每毫克中所含的可测端基为A mmol，那么，该多糖的分子量应该是1A。可见检样的分子量,是它每毫克重量中所含可测端基的毫摩尔数的倒数，在端基法测定分子量时，分子量计算的通式为:检样重量mg可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn)用端基法测分子量要求检样的化学结构须具备如下两个条件：(1)每一个分子链端须具有可以用化学方法作分析的基团，以便采用一定的定量分析方法，对该端基作定量分析。(2)检样的每一个分子链，它所含可测端基的数目，不但须明确，而且数目
7、应固定不变。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,下面介绍几种常用的测定多糖还原端基的定量分析方法:3，5一二硝基水杨酸比色法 本方法在还原糖与3，5一二硝基水杨酸反应时，产生颜色。测定检样时，用一个已知分子量和已知浓度的溶液作参比，经过比色，计算检样的分子量。试剂 3，5一二硝基水杨酸溶液：称取666 mg经2次重结晶的3，5一二硝基水杨酸，溶解于200 mL浓度为1 molL的氢氧化钾溶液中。操作(1)称取样品100200 mg放人100 mm20 mm试管，加15 mL试剂，经过搅拌使样品溶解，然后在65的恒温水浴中保温1小时，待冷却至室温后，将反应液移入50 mL容量瓶，用水淋洗反应管多次，
8、淋洗液并入容量瓶，添加水至刻度。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,(2)用同样方法，取试剂15 mL放人试管，经保温，待冷却到室温后，移人容量瓶加水到50 mL，作为对照溶液。比色时用500nm滤光板。(3)如果检测的样品是淀粉，则可用麦芽糖作参比物。取麦芽糖4mg，与检样的显色反应同样操作。(4)从50 mL容量瓶中取一部分作适当稀释，配制成几个不同浓度的溶液,测定它们的光密度，作浓度光密度曲线图。图中的麦芽糖浓度，可以用麦芽糖的毫摩尔表示，读取样品的光密度之后，从该曲线查对其相应的毫摩尔数，从而计算样品的分子量:M=样品(mg)/x.,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,碱性铜盐试剂反应滴定法：以
9、碱性铜盐试剂氧化还原糖方法，测定多糖端基的半缩醛基团，从而计算出它的分子量。试剂 碱性铜盐试剂：Na2HPO412H2O 76.6 g，酒石酸钾钠40 g，浓度为1 molL的氢氧化钠溶液100 mL，浓度为10的CuSO45H2O的溶液80 mL，Na2S04 180 g，加水配成1000 mL。O01 molL碘酸钾溶液 25碘化钾溶液(用时新鲜配制)l molL H2S04 00025 molL硫代硫酸钠溶液(临用前，以O02 mol几的硫代硫酸钠溶液稀释，经标定后使用)。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,操作(1)精确称取样品12 g，用蒸馏水溶解后，配制成50 mL，吸取两份5 mL分
10、别置于两只容量为100 mL具磨砂口的三角烧瓶。(2)另取一只100 mL具磨砂口的三角烧瓶，盛放5 mL蒸馏水，作滴定对照用。(3)向三角烧瓶中分别加入碱性铜盐试剂5 mL，然后接上具磨砂接头的冷凝管，放入正在沸腾的水浴中，煮沸30分钟之后，小心地把它们从水浴取出，取时勿使瓶中溶液搅动，待冷至室温后，于各瓶中精确量加O.01 molL的碘酸钾溶液15 mL，再加25的碘化钾溶液1 mL(须沿瓶壁加入，使沾在瓶壁上的反应液淋洗入瓶中，加液时勿使反应液搅动，避免受空气氧化)，再加1 molL的H2S04 15 mL，加毕后立即搅拌混匀，然后加1可溶性淀粉l mL为指示剂，用O002 5mol/l
11、的硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色退去为止。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,如果检测的样品是右旋糖酐，参比物应以异麦芽糖为宜，但是异麦芽糖的结晶纯化比较困难，可改用龙胆二糖(gentiobiose)作参比物.龙胆二糖是结构16的葡萄糖双糖，实验证明，异麦芽糖的还原性质为龙胆二糖的939，因此用龙胆二糖作参比物去计算右旋糖酐的分子量需要经过校准。用硫代硫酸钠溶液滴定测定龙胆二糖，每毫升O.002 5molL的硫代硫酸钠相当于0.216 mg龙胆二糖，因此样品(右旋糖酐)的分子量:M=0.939W/V(0.216/342.3)式中W-样品的取量(mg)；V-滴定时用去的O002 5molL的硫代硫酸钠体积
12、(mL)(空白对照滴定值减去样品滴定值)。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,第六章 多糖的分子量测定,把多糖转化为氰醇(cynohydrin)的测定法：把多糖(P)与氰化钾反应，成为多糖氰醇(PCHOHCN)，然后在碱性条件下使氰醇水解，释放出氨 PCHOPCHOHCNNH3 释放的氨用标准浓度盐酸吸收，再用氢氧化钠滴定。释放的氨的毫摩尔量，即为多糖还原基团的毫摩尔量，从而计算多糖的分子量。本方法常用于纤维素等的分子量测定。试剂 O4 molL醋酸，O8 molL氰化钾溶液，20氢氧化钠溶液，O01 molL的标准盐酸，O01 molL的标准氢氧化钠。,操作(1)精确称取样品100200 mg，
13、放在500 mL具磨砂口的圆底烧瓶中，加蒸馏水3 mL，使样品吸水润湿，再加浓度为O4 molL的醋酸5 mL和浓度为O8 molL的KCN的溶液5 mL，盖上玻璃塞后于39温度保温48小时。然后用酸将反应液酸化至甲基红呈酸性。(2)通以空气，驱逐反应液中剩留的氰化物，然后加浓度为20的氢氧化钠溶液10mL。(3)以蒸汽蒸馏法将氨蒸出并吸收于一定体积(VHCL,)的标准盐酸中。蒸馏完毕，以标准氢氧化钠滴定盐酸(吸收溶液)，记录所消耗的氢氧化钠的体积(VNAOH)。(4)样品的分子量:M=样品质量/(VHCL*0.01)-(VNAOH*0.01),第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,五、分子筛法原理
14、凝胶过滤测定中，洗脱体积称为Ve，当分子量足够大，过凝胶柱时不进入凝胶的洗脱体积为死体积V0，小分子物质进入柱子后，其洗脱体积较大，极限值为Vt，即床体积。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,Kav为分配系数，表示物质在流动相(凝胶珠外的液体)和固定相(包括凝胶内的液体和凝胶本身)之间的分配比，则有:Kav=(Ve-Vo)/(Vt-V0),另一种分配因子的表示法为Kd，即溶质在凝胶外液体和凝胶内液体体积Vi之间的分配比 Kd=(Ve-V0)/Vi,Kav可能与球状蛋白或多糖的表观Stokes半径rs有关，并有下式 Kav=exp-丌L(rs+rr)(rs+rr)式中,L表示固定相浓度，rr表示固定
15、相棒状分子的半径，对于类似形状和水合作用的分子，rs与分子量之间存在一种固定的相互关系。Kav，Kd及其他凝胶过滤参数与球状蛋白和糖胺聚糖分子量之间的经验关系式已经建立。对于球状蛋白，Kav对lgM作图得校正曲线。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,操作(1)1.6cml00cm层析柱，装填5Agarose(Pharmacia或Bio-Rad)，用6 molL氯化胍平衡，洗脱，调节pH6.O，流速1.4 g(hcm2)，收集每1克级分。为了柱流量的足够精确测定，可采用称重试管，并测定总的流出重量。(2)将标准蛋白样品和1 mg的糖蛋白样品溶于6 molL氯化胍溶液中，二硫键还原后羧甲基化，洗脱液中
16、蛋白质在280nm处测定光密度，死体积用1mg的蓝色葡聚糖(加入样品中)测定，DNP-甘氨酸可作为Vi的标记，通过Kd对lgM作图(或其他标准方法)以处理凝胶层析数据获得分子量。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,六、超过滤法超过滤是在常规微粒过滤基础上发展起来的细微粒子过滤新技术，是膜法分离的一种。原理 通过孔径不同的半透膜，借助于外加压力所造成膜两侧的压力差，截留1lO nm的粒子。这样大小的粒子可以是溶液中的大分子或胶体溶液中的胶悬体，因此超过滤又名分子过滤。超过滤法测多糖的分子量是应用适宜的分子量截留值的超过滤膜，以各种已知分子量不同的多糖作标准进行超滤测百分滤过量，然后以百分滤过量对分子
17、量作图得出标准曲线，在相同超过滤膜和相同测定条件下测定样品的百分滤过量，从标准曲线上即可求出近似的分子量。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,实例 应用Amicon公司生产Amicon超过滤器(Model MMC，8 Chambers)和超过滤膜PM-10(分子量截留值10 000)，XM-50(分子量截留值50 000)，XM-110A(分子量截留值100 000)测定香菇菌丝多糖的近似分子量：从人工培养的香菇菌丝提取的多糖是甘露聚糖.粗制多糖经Ect纤维素柱层析和柱层析纯化的精制得到多糖KS-2.为测定KS-2的分子量.步骤如下:(1)将已知分子量的各种多糖溶于水或O.15 molL NaCl
18、(溶于0.01 molL，pH7.2的磷酸盐缓冲液中)，制成浓度为100 gmL或200gmL。(2)各取5mL置 Amicon超过滤器中超滤，收集2.5 mL，取O.5 mL 测糖含量，比较滤前及滤后的糖含量，算出百分滤过量(三次平均值)。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,(3)以百分滤过量对分子量作图得出三种膜的三条标准曲线图71超过滤测KS-2分子量-在PM-10上的标准曲线 在XM-50上的标准曲线，_ 在XM-110A上的标准曲线 50滤过量，口 Ks-2的百分滤过量。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,(4)再用KS-2在三种膜上和相同测定条件下进行超滤，结果PM-10、XM-50膜基本
19、上完全截留KS-2，而XM-110A膜适合于KS-2的分子量测定。(5)从XM-110A膜上测得KS-2的百分滤过量，然后再从XM-110A的标准曲线上得出KS-2的近似分子量约6000095000。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,七、高效液相色谱法测定多糖分子量多糖的高效液相色谱(HPLC)多是高效体积排阻色谱(HPSEC)或称高效凝胶渗透色谱(HPGPC)。这种色谱法，样品分子与固定相凝胶之间无相互作用，完全是按分子筛原理分离。根据经验公式，多糖的分子量M与分配系数Kav,洗脱体积Ve存在如下关系 Kav=K1一K2lgM(6-1)Kav=(VeVo)/(Vt一VO)(6-2)由各种已知分
20、子量的标准多糖测得的洗脱体积Ve，结合Vt和V。即可计算得到每个标准品的Kav，Kav与lgM存在线性关系，在半对数坐标纸上作图即得标准曲线。再由样品的洗脱体积Ve，计算得到Kav，由Kav之值查标准曲线得lgM，最后得被测样品的分子量。当然也可以不用标准曲线，而用线性回归求得分子量。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,仪器和试剂 高效液相色谱仪，示差折光检测仪(日本Shodex RI SE-51)，色谱柱(Bio-Gel TSK-40，TSK-50)，积分仪(Waters732)或记录仪(LKB2210)，标准多糖(T-葡聚糖系列，Pharmacia出品)，葡萄糖(分析纯)。流动相：O.2 mo
21、lL磷酸盐缓冲液(pH6.O)。操作(1)样品及各种标准多糖分别称量并溶于缓冲液中,使成浓度为 O.2(WV)，溶液经离心机(16 000 rmin)离心3分钟。(2)取上清液，由注射器相继进样，进样量20L。(3)选定流速、纸速等其他控制参数。(4)开始运行。(5)结束运行。由各种标准糖的Ve值计算对应Kav，在半对数坐标纸 上画出Kav对lgM的标准曲线。(6)由样品的Ve值计算Kav，从标准曲线上查找对应的lgM,得到样品分子量M。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,实例(1)按上述操作进样品20L，选定流速O.5mLmin，纸速1mmmin。(2)RI衰减数1，结果测得 T-2000的保留时间即柱的空体积Vo为20.95分钟，葡萄糖的保留时间即柱的总体积Vt为40.36分钟以及各种T系列葡聚糖的Ve(表1)，,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,表6一1 葡萄糖分子量Mw,Ve及其Kav计算值,根据方程式计算得相应的Kav。Kav对lgM作图，得到标准曲线（图2）。(3)由于样品的Ve为29.51分钟，则Kav为O.441，从标准曲线上查得lgM=4.95，由此得该样品之分子量:M=89 000。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,图2 lgM与Kav的标准曲线,
