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1、营养缺陷型菌株的筛选,实 验 七,营养缺陷型等基本概念,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：野生型：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。遗传型表示法是A+B+营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长。A营养缺陷型用A-B+表示，B营养缺陷型用A+B-表示 原养型：一般指营养缺陷型突变经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。遗传型均用A+B+表示,与营养要求有关的3种遗传型关系,培养基的基本概念（按营养需求成分分）,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基：基本培养基（MM
2、）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基。不同菌株的要求不同，此试验要先确定，非常重要。完全培养基（CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。补充培养基：凡只能满足相应的营养缺陷突变株生长需要的组合或半组合培养基。,营养缺陷型的用途,营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大，主要有两方面应用：1、是作为研究代谢途径和遗传规律及育种技术不可少的标记菌种；2、可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物目的在于切断某些代谢途径以积累中间代谢产生或切断一条代谢途径而积累另一分支途径的末端产生。解除代谢途径中的反馈抑制和阻遏。,目的要求,1、了解应用物理、化学因素
3、对细菌进行诱变的方法。2、初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛选与鉴定的方法技术。体会其相应的科学理念。,实验原理诱变及诱变剂说明,利用化学、物理等诱变手段诱发突变是遗传学研究和育种工作的常用手段。主要有DNA碱基化学性质改变引起置换、插入移码、大片段畸变、碱基二聚体形成等。最终引起遗传信息在复制中的改变。本次实验利用紫外线进行诱变处理（主要是形成嘧啶二聚体，引起后续DNA复制错误，达到诱变的目的）。诱变后需要暗培养（防止光复活作用）。紫外线剂的控制紫外灯的功率、照射距离、照射时间。（需要前期试验确定，杀菌率在70%左右）,实验原理营养缺陷型的培养生长情况,营养缺陷型在完全培养基（CM）上生长良
4、好，而在基本培养基（MM）上则不生长；未发生突变的野生型在两种培养基上都能生长。筛选的理论依据,实验原理营养缺陷型筛选的四个环节,第一步：诱变剂处理第二步：淘汰野生型，浓缩缺陷型基本培养基（使营养缺陷型由少数变为多数）抗生素法：青霉素适用于细菌；制霉菌素适用于真菌菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放线菌 高温杀菌法：利用芽孢和营养体对热敏感性的差异。第三步：检出缺陷型第四步：鉴定营养缺陷型（此步因时间关系不再进行）,实验材料,菌种：大肠杆菌实验培养基：肉汤液体培养基（CM）；肉汤固体培养基（CMA）；2倍肉汤液体培养基（2CM）；基本液体培养基（MM）；基本固体培养基（MMA）；无N基本液体培
5、养基（无N）；2倍含N基本液体培养基（2N）实验试剂：生理盐水；青霉素钠实验器材：10mL带盖离心管、10mL吸管、90mm培养皿、15150mm试管（带硅胶塞）、1mL刻度吸管（或微量加样枪和吸头）,实验步骤,1、菌种培养收集洗涤2、诱变剂处理3、淘汰野生型，浓缩缺陷型基本培养基抗生素法：青霉素适用于细菌；制霉菌素适用于真菌菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放线菌4、检出缺陷型夹层培养法5、鉴定营养缺陷型（此步骤因时间关系不再进行）下学期微生物学实验中有相关内容学习,1、菌种培养收集洗涤（第一天）,大肠杆菌接种于肉汤液体培养基，37静止培养1824小时（老师处理）。无菌取10mL培养液放入无
6、菌15mL离心管中，3500转/分钟离心10分钟，弃上清液，留下菌体沉淀。在上述沉淀中加入5mL无菌生理盐水，悬浮沉淀（均匀），备用。,2、诱变剂处理（第一天）,吸取上述洗涤悬浮好的菌悬液3mL，放至60mm培养皿中，摇晃成薄层。将上述培养皿（连盖）放在40W的紫外灯下，距离30厘米（处理前先开紫外灯稳定30分钟），灭菌1分钟，然后开盖处理5分钟。照射完毕后，先盖上皿盖，再关紫外灯。吸取3毫升2倍肉汤培养液到上述处理后的培养皿中。置于37恒温培养箱内，避光培养12小时以上。诱变后DNA复制形成纯合子过程。注意紫外线防护（不要长时间暴露在其下）。,3、淘汰野生型，浓缩缺陷型（第二天）,（1）吸5
7、毫升紫外线处理过并重新培养的菌液，放入已灭菌的15mL离心管，3500转/分离心10分钟。（2）倒去上清液，加入5mL生理盐水，打散混匀沉淀，如此重复离心洗涤三次，加生理盐水到原体积（5mL）。（3）吸取经离心洗涤的菌液0.1毫升于5毫升无N基本培养液，37培养1224小时。缺营养情况下休眠菌体（饥饿处理）。,3、淘汰野生型，浓缩缺陷型（第三天）,（4）培养24小时后，按11加入2N基本培养液5毫升（含青霉素钠盐2000单位/毫升），使青霉素钠在菌液中的最终浓度约为1000单位/毫升，再放入37温箱中培养。利用青霉素只作用于生长的细胞，杀死在基本培养基中生长的野生型，留下休眠不生长的缺陷型。（
8、5）培养24小时后，3500转/分离心10分钟，用基本液体培养基重复离心洗涤三次，悬浮于5mL基本培养液，备用。去除青霉素钠（第四天内容）,4、检出缺陷型夹层培养法（第四天）,取1无菌培养皿，倒入5mL灭菌溶化后基本固体培养基（MMA），铺满铺平培养皿皿底，凝固后形成底层。第一层取上一步骤处理好后的菌悬液0.1mL加入到5mL灭菌溶化后冷却至45-50 基本固体培养基（MMA）中（试管），快速搓动混匀后（快速），倒入上述有底层的培养皿中，铺满铺平，冷却凝固。第二层冷却凝固后，再倒入5mL灭菌溶化后冷却至45-50 基本固体培养基（MMA），铺满铺平，冷却凝固。第三层放入37 恒温培养箱中，培养
9、48小时。,培养好后，仔细观察培养皿，标记已生长出的菌落。标记好后，倒入5mL灭菌溶化后冷却至45-50 肉汤固体培养基（CMA），铺满铺平，冷却凝固。第四层第六天内容放入37 恒温培养箱中，培养48小时。第八天内容再次仔细观察培养好培养皿，前后对照标记，找出新生长出的菌落，此菌落可能是缺陷型菌落。如有新生长出的菌落，用无菌牙签（接种针），挑取菌落，分别点接于含基本固体培养基（MMA）和肉汤固体培养基（CMA）培养皿上，放入37 恒温培养箱中，培养48小时。观察，如果在基本固体培养基（MMA）无生长，而肉汤固体培养基（CMA）生长，则得到营养缺陷型菌株，保藏进行鉴定营养缺陷型。反之失败。,夹层
10、培养法及其结果示意图,5、鉴定营养缺陷型,利用生长谱法确定所挑取菌株具体缺少什么营养物而不能生长。生长谱法：在混有供试菌（待鉴定菌）的平板表面点加相应微量营养物，视某营养物的周围有否长菌（微型菌落圈）来确定该供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。下学期微生物学实验再具体详细介绍。,附：检出营养缺陷型的方法介绍,夹层培养法四层培养基（三基本一完全）限量补充培养法微量富（限）营养物逐个检出法灭菌接种针或牙签，分别接种于基本培养基和完全培养基影印平板法分别转印于基本培养基和完全培养基上,夹层培养法及其结果,夹层培养法,先在培养皿上倒一层MM琼脂培养基，凝固后倒上一层含菌的MM琼脂培养基，凝固后再倒
11、一薄层MM琼脂培养基，培养24hr，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。缺点：结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。,限量补充培养法营养不同，生长差异,该法有两种情况：（1）目的是检出营养缺陷型（广泛）将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的MM固体培养基上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。（2）目的是定向筛选某种特定的缺陷型（特定）在基本培养基中加入某种单一（微量）的氨基酸、维生素或碱基等物质。,逐个检出法（点接）,用接种针或牙签将诱变处理后CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种（
12、先MM后CM，操作时要避免带入CM培养基成分），依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。,影印平板法,（1）将一较培养皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。（2）完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。（3）将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。（4）将CM和MM在恒温培养箱中培养。（5）二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。,实验结果及思考题,试验完成后，报告自己的明确结果（可能有其不确定性，可以和其他同学结果进行比较分析），结果表示需要附照片。通过试验，说明营养缺陷型筛选过程中，每一环节所体现的试验思想和目的。,
