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1、构建重组质粒基本方法构建重组质粒基本方法 1. cDNA编码区片段的PCR扩增 50ul 2 模版 1 5引物 1 3引物 1 dNTP 1 10buffer 5 Taq 1 Milliq H2O 40 2PCR产物纯化 1、 加5倍体积的PB 2、 将Spin柱放于2ml收集管上 3、 加样液，14Krpm，离心1min 4、 弃去排出液 5、 加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 6、 弃去排出液,14Krpm,离心1min 7、 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 8、 往Spin柱的膜中央加入50l的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离
2、心1min 3双酶切 载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切： 载体 10x buffer 100xBSA 酶1 酶2 MilliQ H2O 10ul 3ul 0.3ul 1ul 1ul 14.7ul PCR产物 10x buffer 100xBSA 酶1 酶2 MilliQ H2O 20ul 3ul 0.3ul 1ul 1ul 4.7ul 4双酶切后的载体用试剂盒割胶回收 1. 割胶并称重，加3倍体积的QG 2. 50，恒温10min，等到胶完全被溶解 3. 将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中 4. 加样液，14Krpm，离心1min 5. 弃去排出液 6. 加0.75ml PE,
3、14Krpm，离心1min 7. 弃去排出液,14Krpm,离心1min 8. 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 9. 往Spin柱的膜中央加入50l的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min 5 连接 上述双酶切产物经过纯化，在T4 DNA连接酶作用下16连接过夜。连接体系如下： 载体 2ul PCR 片段 6ul 10xT4 buffer 1ul T4 DNA ligase 1ul 6 转化 取上述连接液5l转化到预先制备的DH5化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37摇床45min，离心5000
4、rpm，1-5min，最后均匀涂布在含有100 ng/ml抗生素的LB平板上。将平板在37倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37倒置培养过夜。 7菌落原位PCR 挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2%凝胶上进行电泳分析。 8. QIAGEN试剂盒抽提质粒 1) 用1.5ml管离心收集细菌，两次，共3ml左右。 2) 加入250ul的预冷的P1，打匀后在震荡仪上高速震荡1min。 3) 加入250ul P2，温和颠倒数次混匀。 4
5、) 加入冰上预冷的溶液 N3 350ul，迅速温和颠倒混匀，至出现分散的絮状沉淀。 5) 冰上静置2min后离心，13，000rpm，10min。 6) 小心吸取上清于蓝色的spin柱中 7) 离心13，000rpm，1min，弃流出液 8) 加入750ul PE，离心13，000rpm，1min，弃流出液 9) 再离心一次，离心13，000rpm，1min，弃流出液。以让管内彻底干燥。 10) 将spin柱拿出，置于一干净的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入30ul MilliQ H2O，或者Elution Buffer，室温静置2min。 11) 离心13，000rpm，1min，收集质粒，测浓度，电泳检测。
