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1、湿热灭菌湿热灭菌 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比(表2-1)；热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物：蒸汽存在潜热当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。 多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理15min后即可杀死，酵母菌和真菌的胞子要耐热些，要用80以上的温度处理才能杀死，而细菌的芽胞更耐热，一般要在120下处理15min才能杀死。湿热灭菌常用的方
2、法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。 表2-1 蛋白质含水量与其凝固温度的关系 蛋白质含水量/% 50 25 18 6 (一)常压蒸汽灭菌 (1)常压蒸汽灭菌是湿热灭菌的方法之一，在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。此外，不宜用高压蒸煮的物质如糖液、牛奶、明胶等，可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法所用的灭菌器有阿诺氏(Aruokd)灭菌器或特制的蒸锅，也可用普通的蒸笼。由于常压蒸汽的温度不超过100，压力为常压，大多数微生物的营养细胞能被杀死，但芽胞细菌却不能在短时间内死亡，因此必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，以杀死芽胞细菌，达到完全
3、灭菌。 1)巴氏消毒法 是用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中的无芽胞病原菌(如牛奶中的结核分枝杆菌或沙门氏菌)，而又不影响其特有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60-85下处理15-30min。具体的方 法可分两类，第一类是较老式的，称为低温维持法，例如在63下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，称为高温快速法，用于牛奶消毒时只要在85下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体-伯氏考克斯氏体(一种立克次氏体)。 2)间歇灭菌法 又称分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是
4、：将待灭菌的培养基在100下蒸煮30-60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20-30下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌的含硫培养基就应用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元素硫经常规的高压灭菌(12l)后会发生熔化，而在100的温度下则呈结晶状。 蛋白质凝固点/ 56 74-80 80-90 145 3)蒸汽持续灭菌法 微生物制品的土法生产或食用菌菌种制备时常用这种方法。在容量较大的蒸锅中进行。从蒸汽大量产生开始，继续加大火力保持充足蒸汽，待锅内温度达到100时，持续加热3-6h，杀死
5、绝大部分芽胞和全部营养体，达到灭菌目的。 以上三种方法通常是在无高压蒸汽灭菌条件的地方(如农村)使用。 (2)灭菌过程中应注意 1)使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100后开始计算灭菌时间，此时锅顶上应有大量蒸汽冒出。 2)为利于蒸汽穿透灭菌物，锅内或蒸笼上堆放物品不宜过满过挤，应留有空隙。固体曲料大量灭菌时，每袋以1.5-2.0kg为宜，料袋在锅内用蓖子分层隔开，不能堆压在一起。 3)火大水足才能保证蒸汽足，蒸锅里应先把水加足。一次持续灭菌时，如锅内盛水量不能维持到底应在蒸锅侧面安装加水口，以便在蒸煮过程中添水。添水应用开水，以防骤然降温。 4)间歇法灭菌时应在每次加热后，迅速
6、降温，然后在室温放置24h，再第二次加热。如果降温慢，往往使未杀死的杂菌大量滋长，反面导致灭菌物变质，特别是固体曲料包装过大时，靠近中心部分更易发生这种情况。 5)从使用效果看，分装试管、三角瓶或其他容器的培养基，因其体积小，透热快以用间歇法为佳。固体曲料，因其包装较大，透热慢，用间歇法容易滋生杂菌变质或者水分蒸发过多，曲料变得不新鲜，影响培养效果，因此使用一次持续灭菌法较好。 (二)高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌法是微生物学研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌方法。 (1)灭菌原理 高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器(锅)中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内
7、。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121(压力为0.1MPa)，时间维持15-30min。也可采用在较低的温度(115，即0.075MPa)下维持35min的方法。此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物品的灭菌。蒸汽压力与温度的关系如表2-2所示。 在使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压；所以当水蒸汽中含有空气时，压力表所表示的压力是水蒸气压力和部分空
8、气压力的总和，不是水蒸气的实际压力它所相当的温度与高压灭菌周内的温度是不一致的。这是因为在同一压力下的实际温度，含空气的蒸汽低于饱和蒸汽。见表2-3所示。 表2-2 蒸汽压力与温度的关系 蒸汽压力 Kg/cm2 0.00 MPa 0.00 100 蒸汽温度 212 0.25 0.50 0.75 1.00 1.50 2.00 0.025 0.050 0.075 0.100 0.150 0.200 107.0 112.0 115.5 121.0 128.0 134.5 224 234 240 250 262 274 由上表看出：如不将灭菌锅中的空气排除干净，即达不到灭菌所需的实际温度。因此，必须将
9、灭菌器内的冷空气完全排除，才能达到完全灭菌的目的。 在空气完全排除的情况下，一般培养基只需在0.1MPa下灭菌30min即可。但对某些物体较大或蒸汽不易穿透的灭菌物品，如固体曲料、土壤和草炭等，则应适当延长灭菌时间，或将蒸汽压力升到0.15MPa保持1-2h。 (2)灭菌设备 高压蒸汽灭菌的主要设备是高压蒸汽灭菌锅，有立式、卧式(图2-5)及手提式(图2-6)等不同类型。实验室中以手提式最为常用。卧式灭菌锅常用于大批量物品的灭菌。不同类型的灭菌锅，虽大小外形各异。但其主要结构基本相同。 表2-3 空气排除程度与温度的关系 压力表读数/Pa 灭菌器内温度/ 未排除空气 排除1/3空气 排除1/2
10、空气 排除2/3空气 完全排除空气 35 70 105 140 175 210 72 90 100 109 115 121 90 100 109 115 121 126 94 105 112 118 124 128 100 109 115 121 126 130 109 115 121 126 130 135 高压蒸汽灭菌器的基本构造如下： 1)外锅 或称“套层”，供贮存蒸汽用，连有用电加热的蒸汽发生器，并有水位玻管以标志盛水量。外锅的外侧一般包有石棉或玻璃棉绝缘层以防止散热。如直接使用由锅炉接入的高压蒸汽，则外锅在使用时充满蒸汽，作为内锅保温之内锅 或称灭菌室，是放置灭菌物的空间可配制铁蓖架
11、以分放灭菌物 3)压力表 内外锅各装一只，老式的压力表上标明三种单位：公斤压力单位(kg/cm2)，英制压力单位(1b/in2)和温度单位()，便于灭菌时参照。现在的压力表用MPa表示。 4)温度计 可分为两种，一种是直接插入式的水银温度计，装在密闭的铜管内，焊插在内锅中另一种是感应式仪表温度计，其感应部分安装在内锅的排气管内，仪表安装于锅外顶部便于观察。 5)排气阀 一般外锅、内锅各一个，用于排除空气。新型的灭菌器多在排气阀外装有汽液分离器(或称疏水阀)内有由膨胀盒控制的活塞。利用空气、冷凝水与蒸汽之间的温差控制开关，在灭菌过程中，可不断地自动排出空气和冷凝水。 6)安全阀 或称保险阀利用可
12、调弹簧控制活塞，超过额定压力即自动放气减压。通常调在额定压力之下，略高于使用压力。安全阀只供超压时安全报警之用，不可在保温时用作自动减压装置。 7)热源 除直接引入锅炉蒸汽灭菌外，都具有加热装置。近年来的产品以电热为主，即底部装有调控电热管，使用比较方便。有些产品无电热装置，则附有打气煤油炉等。手提式灭菌器也可用煤炭炉作为热源。 (3)几种常用高压蒸汽灭菌锅的使用方法 1)立式灭菌锅使用要点： 加水 由漏斗处加水，加水量应在标定水位线以上，可在水位玻管刻度处观察。 装锅 将待灭菌物品装入锅内时，不要太紧太满，应留有间隙，以利蒸汽流通。盖好锅盖后。即可将螺旋柄旋紧。 加热和排冷空气 如果是电热高
13、压蒸汽灭菌锅，则合上电闸通电加热。如届非电热装置，可点燃煤气炉或煤油喷灯加温。同时打开排气阀及下部排冷气余水阀，继续加热到锅中水沸腾，待排气阀冒出大量蒸汽后，关闭盖顶排气活塞，使冷空气由下部疏水阀排出。此时如有少量冷凝水排出是正常现象。待下部疏水阀有大量蒸汽冒出时，证明锅中已充满蒸汽，应继续排汽，使锅中及灭菌容器中的冷空气完全排除干净。一般不应少于5min。 升压保压 排气完毕后关小下部疏水阀，锅内压力即逐渐升高，注意升压不要过猛。当压力升高到0.lMPa时，调节火力，使压力保持稳定。压力选择应视具体灭菌物品而定，如草炭、土壤等则可在压力升至0.14MPa-0.15MPa后定时保压。 降压与排
14、汽 保压时间(一般为30min)结束后，即应停止加热，使其自然冷却。此时切勿急于打开排气塞，因为压力骤然降低，将导致培养基剧烈沸腾而冲掉或污染棉塞。待压力降至0.025MPa以下可打开排气阀使余汽排出，同时打开下部疏水阀，排出锅内冷凝水。 出锅 排气完毕后，即可扭松螺旋柄使锅盖松动。先将锅盖打开5-10cm，不必完全推开锅盖， 目的是借锅中余热将棉塞及包装纸烘干。烘烤30min后，即可推开锅盖，取出已灭菌的物品。 2)卧式灭菌锅使用要点： 加水 先将排水阀关闭，调整总阀至“全排”。然后，开启进水阀，放蒸馏水至蒸汽发生器内，待水进至距水表顶端大约1-2cm处时，关闭进水阀，并将总阀调至“关闭”。
15、 装锅 将待灭菌物品装入锅内，注意不要塞得过紧过满，盛有培养基的三角瓶和试管应立放或适度倾斜以免灭菌过程中培养基污染棉塞。 关门 按顺时针方向转动紧锁手柄至红箭头处，使撑挡进入门圈内。然后旋动八角转盘，使门和垫圈密合，以灭菌时不漏气为度，不宜太紧，以免损坏垫圈。 通电加温 待电源控制开关的旋钮旋至“开”处，电源指示灯亮，表示已通电，然后再按灭菌物品所需灭菌汽压将旋切旋至0.07MPa、0.1mPa或0.14MPs处。此时电热指示灯亮，表示已通电加热。 保温保压 当蒸汽套层内的蒸汽随加热达到自动控制压力时，电热指示灯会白动熄灭，表示停止加热。随着热力散发压力降低，电热指示灯再亮，表示继续加热，这
16、表明压力控制器工作正常。当套层内的蒸汽加热到所选择的控制压力时，即可将套层内的蒸汽导入消毒室进行灭菌。此时应先将汽液分离器前的冷凝阀开放少许，然后将总阀调至“消毒”，套层内的蒸汽即通过总阀进入消毒室进行消毒，冷凝水则通过汽液分离器自动排出。这时蒸汽套层内蒸汽压力迅速下降，而消毒室内的蒸汽压力逐渐上升，消毒室内的温度表也随着物品被蒸汽加热而上升。当表卜温度升到所需消毒温度(一般为121)时，开始计算灭菌时间，维持温度至灭菌完毕。 出锅 灭菌完毕后，立即切断电源，按灭菌物品性质和要求，决定消毒室内的蒸汽是自然冷却还是采取“慢排”或“快排”，例如，器械、器皿、固体曲料、土壤、草炭等不致因压力骤然下降
17、而受影响的物品，可直接将总阀调至“慢排”和“快排”，使消毒室内蒸汽迅速排出。当消毒室内压力下降至“0”时，方可缓慢转动锅门转盘并拨动紧锁手柄将门开启5-10 cm。20一30min后将灭菌物品取出，此时灭菌物品即较干燥。溶液及培养基等物品灭菌完毕时，只能将总阀调至“慢排”，使消毒室内蒸汽慢慢排出，以免突然降低压力导致培养基剧烈沸腾。也可在灭菌完毕后，关闭总阀，让灭菌物品自然冷却。消毒宝压力表降至“0”时、再将总阀调至“慢排”数分钟取出灭菌物品。 连续操作 如灭菌物品较多需连续操作时，应先检查水位。有足够水量时，可连续使用。如需加水、应把总阀调至“全排”，打开进水阀加水后继续操作。 保养 每次灭
18、菌完毕后，关闭电源，停止加热，随后将总阀调至“全排”，排出套层内的蒸汽。开启铂门少许，散发剩余蒸汽，使消毒室内壁经常保持干燥，同时排除蒸汽发生器内的余水。 3)手提式灭菌锅使用要点： 加水 使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物积水。 装锅 将灭菌物品放在灭菌捅中，不要装得过满。盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气阀。 加热排汽 加热后待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时维持2-3min以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气，应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气阀关闭。 保温保压 当压力升至0.1MPa时，温度达12l，此时应控制热源。保持压力，维持30min后，切断热源。 出锅 当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋开盖，取出灭菌物。注意：切勿在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在100以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。 保养 灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。
