生物技术制药期末.docx

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1、生物技术制药期末第四章抗体制药 1Ig分子是由 二硫键 连接起来的 4条 条多肽链构成的。 2单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为 体内免疫 和 体外免疫 。 3一般来说PEG的 相对分子质量 和 浓度 越大，细胞的融合率越高。 1.Ig分子的抗原结合部位是由共同构成。 2.制备单克隆抗体时一般采用与供体同一品系的动物进行免疫。 3. 生物药物检验要求。 4.下列不属于基因产品液态保存的方法是 5.前预防乙型肝炎使用的生物制品属于。 单克隆抗体 ： 由单一的B淋巴细胞克隆产生的，这种抗体是针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 双功能抗体：就是双特异性单链抗体，将抗A抗原抗体的轻链可变区基

2、因与抗B抗原抗体的重链可变区通过短肽链接子连接构建成双链抗体的表达质粒，表达后形成双特异性抗体。 多克隆抗体： 病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。 抗体 ： 是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。 克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。 免疫球蛋白： 将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。 类型 基本结构 人- 鼠嵌和抗体 人IgC-小鼠IgV 改型抗体 小鼠CDR替换人CDR Fab 完整L链和Fd Fv VH和VL 单链抗体 VH-或-VL 单域抗体 VH或 VL 最小识别单位

3、 一个CDR 人- 鼠嵌和抗体：由于抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区，同种性免疫原决定于抗体分子的稳定区,如果在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的重链和轻链可变区分离出来，分别与人Ig的重链的稳定区基因连接成人-鼠嵌合体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人-鼠嵌合抗体。 Fab抗体：用胃蛋白可将IgG的重链在铰链区的C端处裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段，在Fab片段之间仍保留有铰链区与二硫键，为Fab双体，具有完整的双价抗体活性，但相对分子质量减少了1/3，为10000，在人体内产生的抗鼠蛋白的排斥反应也相应降低30%，由于仍保持抗体分子的立体构型，因此在人体任然

4、很稳定，成为小分子抗体的锥形。 单链抗体：是由一段弹性链接肽把抗体可变区重链与轻链相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能单位。 单域抗体：抗体的VH-或-VL是具有结合抗原特异性的小抗体片段。 改形抗体 ：Ig 分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区，而不是整个可变区。 H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。又称CDR移植抗体。 免疫导向疗法障碍有：1，单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，难以维持有效药

5、物作用靶组织时间；2，完整的抗体分子，即Ig的相对分子质量过大，难以透穿肿瘤组织。 改造：1，降低单克隆抗体的免疫原性；2，降低单克隆抗体的相对分子质量。 免疫学的三大类抗体诊断药物：血清学鉴定用的抗体制剂、免疫标记技术用的抗体制剂和体内导向诊断药物。 第五章 植物细胞工程制药 1与动物细胞和微生物细胞相比，植物细胞具有 细胞壁 、液泡 和 质体 。 2植物细胞的悬浮培养分为 静止 和 振荡 。 3植物组织和细胞培养物的生长主要取决于 生长素和 分裂素 的比例。 4大多数植物细胞的培养基中的氮都是以 NH4 和 NO3 形式提供的。 5常用的对植物组织培养的表面灭菌剂是 次氯酸钙 、 次氯酸钠

6、 和 氯化汞 。 6植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期 ，而次级代谢产物的累积则主要在 稳定期 。 次级代谢作用 ： 由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成,代谢及分解作用的综合过程. 初级代谢物：核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类。次级：生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。 次级代谢产物：除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类以外，具有如下特征的成分成为次级代谢产物：有明显的分类学区域界限；其合成需在一定的条件下才能发生；缺乏明确的生理功能；是生命的多余成分。 植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，应用于细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在立体条件下进行培养、繁殖或人为的

7、惊细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意思发生改变，从而改良品种、制造新品种、加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术。 植物细胞全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核的细胞，在一定条件下都可以重新再分化成原来的个体。 分化：可以分为胚胎发生和器官发生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚，进而发育为成熟胚和种子。种子在适宜的条件下分化过程，形成根、茎、叶、花和果实。 脱分化：已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞和组织的过程。 再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。 细胞培养：指利用单个细胞进行液

8、体或固体培养，诱导其增殖及分化的培养试验。目的：得到单细胞无性繁殖系。 外植体：指用于植物组织培养的器官或组织，植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。 继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”，连续多代的培养就称为继代培养。 植物激素：是植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度、生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；、物理条件：温度、光、通气、酸度和渗透压；、化学条件：无机盐、碳源、物质生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然+-物质和前体等；、工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方式。 2.各

9、种植物细胞培养的生物反应器的特点是什么？ 机械搅拌式生物反应器；优点是：反应器内的温度、PH值、溶氧及营养物浓度较其他反应器更易控制；缺点是：搅拌产生的剪切力对细胞造成伤害、抑制植物细胞生长和次级代谢物产生。 鼓泡塔生物反应器；优点：操作不易染菌，提供了较高的热量和质量传递，放大相对容易；缺点是：流体流动形式难以确定，混合不均，缺乏有关反应器内的非牛顿流体的流动与传递的数据。 气升式生物反应器；优点：在低剪切力下达到较好的混合和较高的氧传递效果，运动部件不易染菌，操作费用低；缺点：高密度培养时混合不够均匀； 转鼓式生物反应器；优点：在高密度培养时有较高的氧传递效率，缺点：难于大规模操作，放大困

10、难。 固定化细胞生物反应器；优点：在一定程度上克服了植物细胞遗传和生理特性的不稳定，细胞大小的不一致性、高产细胞系的低产率等植物细胞培养中的突出难题，提高产物的产率。缺点：固定化细胞培养的先决条件是细胞代谢产物必须分泌到胞外， 3.植物组织的固体培养有何缺点？外植体或愈伤组织仅有一部分与培养基接触，造成培养基中营养物质的浓度差，导致生长的不平衡；外植体的基部插入培养基中，因此该处呈现气体交换不畅，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，同时也堆积生长过程中排出的有害物质。容易出现极化现象，导致细胞群体的不均匀。在培养过程中需要检测的一些生理特殊化指标不方便。 4植物细胞大规模培养的主要方法及其特点是什么

11、？成批培养法： 最适于植物细胞培养的是气升式反应器。两步培养法，使用两个反应器第一个用于细胞生物量的累积，第二个用于次级代谢产物的生产。半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。是一种具有定时进出装置的成批培养系统。连续培养法 ： 生产能力较高，但技术条件要求苛刻。固定化培养法 ：固定化的优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体和维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得次级代谢产物。 5植物细胞培养的培养基由哪些主要成分组成？ 植物细胞或组织培养基常含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等成分。 无机盐 有

12、大量元素和微量元素，30毫克每升为界限，大量有氮、硫、磷、钾、镁、钙、氯、钠。微量有铁、锰、碘、钼、铜、锌、碘。 碳源 常用碳源为碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖和半乳糖。天然提取物如椰子乳、对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义。 植物生长调节剂 常见的植物激素有生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯。 有机氮源 常用蛋白质水解物或各种氨基酸，有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的加入是为了代替或增加氮源的供应。 维生素 通常是维生素自养型，但大多数不能满足需要。B族维生素还需加入生物素和肌醇。 植物组织和细胞培养的生长过程主要取决于：生长素和分裂素的比例； 植物细胞大规模培养：成批培养、半连续和连续

13、培养及固定化培养。 成批培养：将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。 半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。 连续培养法：利用连续反应培养器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以及使细胞生长环境长期维持恒定的方法。 如上，植物次级代谢产物的积累主要在细胞生长的稳定期，表明细胞成块而趋于分化时，细胞块中各个细胞处于一定理化梯度之下此现象与完整植株相似，由此提出固定化培养技术。 固定化培养采用的固定化反应器有：网状多孔板、尼龙网套和中孔纤维膜；也可通过净化空气代

14、替搅拌。 固定化培养法： 将细胞固定在尼龙网套内或固定于中空纤维膜反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放在培养液中进行培养，或连续通入新鲜培养基，进行连续培养又连续收集培养产物，可通入净化空气代替搅拌。 常用的灭菌剂有：氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。 三、培养条件的影响 可分为培养环境的内在因素和培养环境的外部因素等的影响。 接种和诱导：培养基的组成：磷、氮、铜、碳源、植物生长调节剂、O2和pH等。2.两步培养法 第一步使用适合细胞生长的培养，营养丰富，称为生长培养基；第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基，较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或少量的碳源，称为生产培养基。 3、培养环境的

15、外部因素温度：搅拌频率培养容器的影响：光的影响： 第六章 酶工程制药 1酶的固定化方法为 载体结合法 、 交联法 和 包埋法 。 2酶的载体结合法根据结合形式的不同分为物理吸附法、离子结合法和 共价结合法 。 3目前工业常的酶一般是以 微生物 为主要来源。 4筛选产酶菌的方法主要包括以下菌样采集 菌种的初筛、纯化 复筛和生产性能鉴定等步骤 5酶在医药领域有应用主要包括 疾病诊断、疾病治疗、药物生产和 分析检测 四个方面的 6在固定化细胞中应用最多，最有效的方法是 包埋法 。 7酶和细胞的固定化载体主要有 吸附载体 、 包埋载体和 交联载体 三类。 8选择酶和细胞固定化方法时应考虑 应用的安全性

16、 、 操作中的稳定性 及 固定化成本 。 9根据固定化酶的反应系统，其活力的测定可以分为 分批测定法和 连续测定法 两种。 10固定化酶的偶联率 小于1 ，扩散限制对酶活力有影响；偶联率 大于1 ，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。 11酶化学修饰的方法有 表面化学修饰、 酶分子内部修饰和 结合定点突变的化学修饰 。 固定化酶 固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 模拟酶 ：根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂。 酶化学修饰：通过主链有切割、剪切和侧链基团有化学修饰对

17、酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质和生物活性。这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶分子的化学修饰。 固定化细胞： 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。 人工模拟酶：根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂。 酶化学修饰：通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。 有机相酶反应：指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反应。 分子印迹：指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程。 生物印迹：是分子印迹的一种形式，它是以天然的生物材料，如蛋白质

18、和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。 1 作为一个优良的产酶菌种：繁殖快、产酶高，最好是产生胞内酶的菌株 2 酶经固定化后，其最适pH值一般都：升高或下降 3 抗体酶是具有催化活性的：免疫球蛋白 4 载体结合法是酶和细胞固定化的主要方法之一，下列那种方法不属于载体结合固定化方法：交联法 5 模拟酶的分类，按属性分为：主-客体酶、胶束酶、肽酶、半合成酶、分子印迹酶。 6 按Kirby分类：单纯酶模型、机制酶模型、单纯合成的酶样化合物。 7 核酶是具有催化活性的：核糖核酸 8 分子印迹方法：共价分子印迹和非共价分子印迹。 9 酶化学修饰的目的 提高酶的生物

19、活性； 增强在不良环境中的稳定性； 降低或消除其免疫原性 10、酶化学修饰的方法 . 酶的表面化学修饰包括：大分子修饰、小分子修饰、交联修饰、固定化修饰。 . 酶分子内部修饰包括：非催化活性基团的修饰、蛋白主链的修饰、催化活性基团的修饰、与辅因子有关的修饰、肽链伸展后的修饰。3. 结合定点突变的化学修饰 分子印迹有两种方法：共价分子印迹，(如染料、二胺类、维生素、氨基酸衍生物、肽) 和非共价分子印迹(如游离糖及其衍生物、甘油酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、芳香酮、转铁蛋白、苦杏仁酸、二醛等）。 1作为一个优良的产酶菌种，应具备条件有那些？ (1) 繁殖快、产酶高，酶的性质应符合使用要求，而且最

20、好是产生胞外酶的菌株。 (2) 不是致病菌，在系统发育上与病原菌无关，也不产生有毒物质。 (3) 产酶性能稳定、不易变异退化，不易感染噬菌体。 (4) 所需原料稳定，来源广泛，价格低廉。 发酵周期短，易于培养。 2试比较物理吸附法和共价结合法两种酶固定方法的优缺点。 物理吸附法优点：制作条件温和、简便，成本低，载体再生、可反复使用。缺点：结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落。 共价结合法优点：酶与载体结合力强，稳定性好。缺点：条件激烈，易引起酶失活；成本高。 3固定化酶和固定化细胞的特点和优点各是什么？ 固定化酶的特点： 具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。 主要优点如

21、下：可多次使用 反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。反应条件易控制。酶的利用效率高。比水溶性酶更适合于多酶反应。 4，为什么要对酶进行化学修饰？提高生物活性；增强在不良环境中的稳定性； 针对异体反应，降低生物识别能力 四、从现代观点来看， 酶工程主要有哪些方面的研究内容： 1、酶的分离、提纯、大批量生产及应用开发。2、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。3、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究。3、酶的分子改造与化学修饰以及酶的结构与功能之间关系的研究。4、有机相中酶反应的研究。5、酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究。6抗体酶、核酸酶的研究。7模拟酶、合成酶及酶

22、分子的人工设计、合成的研究。 2、固定化酶的特点：具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。 可多次使用，在多数情况下，酶的稳定性提高 反应后，酶、底物、产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。 反应条件易控制，可实现转化反应的连续化和自动控制。 酶的利用效率高。单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。 比水溶性酶更适合于多酶反应。 酶固定化方法：1，载体结合法2，交联法3，包埋法4，热处理 固定化细胞的特点：既有细胞特性，也有生物催化剂功能，又有固相催化剂特点。 优点：无须进行酶的分离纯化 保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高细胞内酶比固定化酶稳定性高 细胞内酶的辅助因子可自动再

23、生 细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 抗污染能力强 第七章 发酵工程技术概论 发酵的基本过程：菌种、种子制备、发酵、发酵液预处理、提取精制 发酵工业的生产水平取决于三个要素，分别是 生产菌种 、 发酵工艺 和 发酵设备。 2.发酵工程产品开发的关键是筛选到高效菌株，一般优良菌种的选育方法主要有 自然选育 、 诱变育种 和 原生质体融合 。 3.微生物诱变育种导致遗传物质DNA结构上发生变化，通常用物理、化学 、生物 等因素进行对微生物的诱变。 4.发酵产物的提取方法一般有 吸附法 、 沉淀法 、 溶剂萃取法 、离子交换法 5.在发酵工业生产中使用的碳源有 糖类 、 脂肪 、 有机酸 、 碳

24、水化合物 . 2. 简述培养基对发酵的影响 微生物的生长需要一定的营养，不同的微生物对营养的要求有很大的差异，培养基的成分和配比合适与否，对产生菌的生长发育，发酵单位的增长，有相当大的影响，同时还会影响到提取工艺和产品质量。 微生物的生长需要较多供给有机碳架的碳源，构成含氮物质的氮源，还有无机盐类，微量元素和水分等。1.碳源是构成微生物细胞和各种代谢产物碳架的营养物质，同时碳源在微生物的代谢过程中被氧化、释放出能量，并以ATP的形式贮存于细胞内，供给微生物生命活动所需的能量。2.无机盐和微量元素是构成菌体原生质的成分，可维持酶的活性，可调节细胞的渗透压和PH，参与产物的合成等。3.水是必需的物

25、质，它既是构成菌体细胞的主要成分，又是营养物质传递的介质，对微生物的生长繁殖和产物合成有很重要的作用。 3. 简述温度对发酵的影响，如何控制温度可提高目标产物的产率？ 影响：1.影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质，温度对菌体生长的酶反应和代谢产物合成的影响往往不同，温度能改变菌体代谢产物的合成方向，对多组分次级代谢产物的组分比例影响2.影响发酵液的物理性质，如发酵液黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等。 在理论上，整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应该根据发酵的不同阶段选择不同的培养温度。在生长阶段，应选择最适生长温度；在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。

26、这样变温发酵所得产物的产量是比较理想的。但在工业发酵过程中，由于发酵液的体积很大，升降温度都比较的困难，所以在整个发酵过程中，往往采用一个比较适合的培养温度，使得到的产物产率最高。 发酵温度：生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热 .最适温度的选择 在生长阶段，应选择最适生长温度；在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。发酵温度可根据不同菌种、不同产品进行选择。 .温度的控制 一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多。 用夹套或蛇形管，通冷却水。 如果气温太高，可采用冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适温度 3、溶氧对发酵的影响及其控制 溶氧浓度的控制 溶氧浓度决定因素：供氧和需氧

27、两方面。 . 供氧方面： 调节通气速率 调节搅拌转速 . 需氧方面：控制方法：控制基质浓度、 控制菌的比生长速率。 4、pH对发酵的影响及其控制 (1)调节好基础培养基的pH。 (2)通过加酸碱和中间补料来控制。 a.过去直接加酸或碱，现常用： 生理酸性物质：(NH4)2SO4 生理碱性物质：氨水 b.补料既调节了pH值，又补充了营养 如：味精厂普遍采用流加尿素，有两个作用: 调节pH值 补充氮源 5. 简述PH对发酵的影响，如何控制PH可提高目标产物的产率 发酵培养基的PH对微生物的生长具有非常明显的影响，也是影响发酵过程中各种酶活的重要因素，由于PH不当，可能严重影响微生物的生长和产物的合

28、成，因此对微生物发酵来讲，有最适生长PH和最适生产PH。 1、分批式：分批式培养是指将全部物料一次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的操作过程。 2、流加式：流加式培养是指将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时候后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 3、连续式：连续式培养是指将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养，发酵反应器中的细胞总数和总体积均保持不变，发酵体系处于平衡状态，发酵中的各个变量都能达到恒定值而区别于瞬间状态的分批培养 连续培养的优缺点：优点：1.高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗、发酵等许多的单元操作从而减少了非生产时间提高设备利用率，2.自控，可使用各种自动化装置进行控制； 缺点：菌种易退化、易染菌、营养利用率低。