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1、2023/3/18,1,第十六章 药品质量控制中的现代 分析方法与技术,基本要求 毛细管气相色谱分析法 手性药物的液相色谱分析法 核磁共振光谱分析法 气相色谱-质谱联用技术,2023/3/18,2,基本要求,一、熟悉毛细管气相色谱法、手性药物的高效液相色谱法的基本内容及其在药物分析中的应用。二、熟悉核磁共振光谱分析法的定量方法及其在药物分析中的应用。三、了解毛细管电泳分析法、红外光谱法、联用技术在药物分析中的应用。,2023/3/18,3,毛细管气相色谱法使用的色谱柱是空心的毛细管柱，叫开管柱：固定液涂渍或固定化在柱管内壁上，而载气和其中的样品从中心的通道上通过。柱材料主要是熔融石英（FSOT
2、）。,一、高分辨气相色谱法,2023/3/18,4,（一）色谱柱1毛细管柱的类型：柱类型 柱内径 柱长 液膜厚度普通开管柱 0.20.53mm 560m 0.11.0m 壁涂开管柱 多孔层开管柱 担体涂渍开管柱 微内径开管柱 100m大内径开管柱 0.32mm 1m或5m,2023/3/18,5,2毛细管柱的选择常用的固定液有：SE-31、OV-1、SE-54、SE-52、OV-1701、Carbowax 20M。柱的选择：根据样品组分的沸点，一般地，相差2或2以上的组分，采用非极性毛细管柱分离；若沸点相差在2以内的组分，则需在极性较大的毛细管柱上分离。,2023/3/18,6,3毛细管柱的性
3、能评价评价指标：分离效率、表面惰性、热稳定性。评价方法：在一定的色谱条件下，分离各种测试物质，获得的特征性数据和峰对称性，以此来评价柱效和表面活性。在测定了柱效和表面活性之后，用流失速率试验来评价热稳定性。,2023/3/18,7,（二）进样方式 分流进样：使用方便，对分流比、进样温度 样品和载气的情况、进样体积和 浓度、进样重复性需要注意。不适于痕量分析和宽沸程样。适合大多数类型的样品，样品浓 浓高、各组分的浓度相近,2023/3/18,8,溶液直接进样 进样口温度应高于柱温3050；采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样，进样量一般不超过数微升，色谱柱越细，进样量应越少，毛细管
4、气相色谱法中，一般应分流以免过载。顶空进样 适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。供试液在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性组分在非气态和气态达到平衡后，由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱中。,2023/3/18,9,不分流进样：须利用溶剂效应或冷阱，操作较难 特别适用于痕量分析和宽沸程样品柱头进样：必须使用外径为0.17 0.23mm的 细针，柱内径必须大于0.32 mm,不能通过隔垫进样，缓慢进样 对热不稳定、稀的和宽沸程样品较 理想；能给出定量结果 非挥发物在柱的中积累导致柱变性 和柱效损失,2023/3/18,10,直接进样：样品无须事先浓缩，进样器温度可较 低，
5、载气消耗量小，分析所需样量小 适用于浓度范围要比不分流进样宽一个 数量级以上的样品，有利于对热不稳定 的样品；当样品中含有挥发性低的组分 时，难于定量分析,2023/3/18,11,（三）应用示例-人尿中劳拉西泮的检测1.测定意义：劳拉西泮(简称LRZ)上用为催眠、镇静和抗癫痫药物,常被犯罪分子作为麻醉药物用于麻醉抢劫等麻醉后犯罪。为了确证这类案件的性质,经常需要对受害人的血、尿等体液中麻醉药物或其代谢物进行检测。人体摄入该药后其血液中药物浓度较低,且犯罪分子所用药量一般不使受害人死亡,而且此类案件一般报案较迟，因此血中药物浓度较低,对其检测较为困难。该药主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。,
6、2023/3/18,12,2.色谱条件：HP-5毛细管柱(300.32mm,膜厚0.1)。氮磷检测器,不分流进样(阀关闭时间0.75min),进样口温度:280,柱温:200(1min)20/min280(15min),载气为高纯氮(2.2ml/min),尾吹气为高纯氮(10ml/min)。,2023/3/18,13,3.样品预处理-酶解及萃取 取检尿1ml,加10mg/L的羟乙基氟西泮(HEF)标准工作液10l,再加pH4.8的乙酸盐缓冲液 50l及-葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1l,置于55水浴中水解4冷至室温后加 pH10.8的碳酸盐缓冲液0.5ml及乙醚5ml,涡旋2min,离心,分取上层有
7、机相4ml置于经硅烷化处理的带尾管的鸡心瓶中,加甲醇0.4ml,于40水浴中挥发至约0.1ml,进样1l进行GC分析,2023/3/18,14,4.方法学评价（1)选择性:空白尿1ml及空白尿1ml加LRZ和HEF标准液,经酶解、萃取后进样分析所得色谱图表明尿中杂质不干扰检测.（2)线性试验:用空白尿配制不同浓度的LRZ标准液进行酶解、萃取、进样分析,将LRZ与HEF色谱峰面积的比值与LRZ在尿液中的质量浓度进行线性回归,得到工作曲线方程:Y=3.110-3X 3.010-3,=0.998。LRZ在尿中的浓度为50500g/L范围内呈良好的线性.,2023/3/18,15,（3)萃取液的选择及
8、萃取率:作者进行了多种溶剂萃取 LRZ的研究,由经萃取与未经萃取所得色谱峰面积 比计算LRZ的萃取率,得(meanSD)为(83.43.1)%。（4）检出限:以3倍信噪比计算检出限,得本法的检出 限为5g/L。（5)回收率:由工作曲线计算LRZ的质量浓度及其回收 率,得(meanSD)为(103.35.1)%。,2023/3/18,16,5.尿液检测:志愿者口服LRZ 2后,于32小时内收集其排泄的尿液进行检测,LRZ于9h达尿中最高浓度为444/L,检测结果表明,本方法适合于麻醉后犯罪案件中的检测要求。,返 回,2023/3/18,17,建立和发展快速而灵敏的分离和测定对映体药物方法的重要性
9、和必要性 对某些手性药物进行对映体的纯度检查；生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；评价单个对映体的效价、毒性、不良反应以及药动学性质；必要时，可进行手性药物对映体的制备分离。,二、手性药物的高效液相色谱法,2023/3/18,18,（一）手性药物拆分机理 为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是“三点手性识别模式”。,2023/3/18,19,2023/3/18,20,（二）手性HPLC拆分法的类型直接法：柱前手
10、性衍生化法间接法：手性流动相拆分法、手性固定相拆分法1柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。,2023/3/18,21,2手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂,2023/3/18,22,3手性固定相拆分法：将手性选择器（如手性流动相添加剂）固
11、着于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。,2023/3/18,23,（三）应用1对某些手性药物进行对映体的纯度检查；2生物体液中药物对映体的分离分析研究可探 索血药浓度与临床疗效的关系；3在研制手性药物过程中，可分别评价单个对 映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；4必要时，可进行手性药物对映体的制备分离（或拆分）。,2023/3/18,24,示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯色谱条件
12、：色谱柱 NOVA-Pack C18（150mm3.9mm）流动相 甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾（pH2.8）（5149）该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离分析。,2023/3/18,25,示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）色谱条件：色谱柱 Zorbax ODS（250mm4.6mm），流动相 含有0.15%L-苯丙氨酸及0.11%硫酸铜（CuSO45H2O）水溶液（以0.05mol/L硫酸调pH至3.0）-甲醇（91）（流动相中L-苯丙氨酸及硫酸铜浓度分别为0.008mol/L和0.004m
13、ol/L）。流动相中L-苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫酸铜为二价金属螯离子，L-苯丙氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到色氨酸对映体，共同形成配位络合物对，然后在反相柱上拆分。,2023/3/18,26,示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）色谱条件：色谱柱 Chirex 3005手性色谱柱（R）-1-萘基甘氨酸和3，5-二硝基 苯甲酸以共价键结合流动相 正己烷-二氯乙烷-甲醇该法的拆分机理为“三点手性识别模式”。,返 回,2023/3/18,27,三、毛细管电泳分析法（一）简介 1高效 2高速 3微量 4低消耗（二）主要分离模式 1毛细管区带电泳（capillary zone
14、 electrophoresis，CZE）在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移，产生泳流。,2023/3/18,28,2胶束电动毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC）或MEKC）在缓冲液中加入离子型表面活性剂，形成胶束。被分离物质在水和胶束两相分配，各溶质在因分配系数存在差别而被分离。3.毛细管凝胶电泳（capollary gel electrophoresis,CGE）毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶作支持物进行的电泳。,2023/3/18,29,4.毛细管等速电
15、泳（capillary isotachor-phoresis,CITP）采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。5.毛细管电色谱（capillary electrochromatography,CEC）将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液进行分离。,2023/3/18,30,6.毛细管等电聚焦电泳（capillary isoelectric focusing,CIEF）将毛细管内壁涂覆聚合物减少电渗流，再将供试品和两性电解质混合进样，两个电极
16、槽中分别加入酸液和碱液，施加压力后毛细管中操作电解质溶液逐步形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自的等电点时变为中性形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值得方法使溶质通过检测器。,2023/3/18,31,第二节 药物现代光谱法及其应用一、近红外分光光度法（一）方法特点 1可获得一系列的物理性质的信息 2样品无需预处理 3分析速度快,3毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis，CGE）4毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）（三）HPCE 在药物分析中的应用,2023/3/18,32,4
17、灵敏度高 5运用范围广 6便于在线分析和控制（二）常见的NIR吸收波长及其结构归属（三）应用 1鉴别 2纯度检查 3含量测定二、核磁共振光谱分析法（一）简述（二）定量分析方法,2023/3/18,33,1方法特点 2测定方法（三）应用示列 1盐酸普鲁卡因的结构坚鉴定 2植物中药及其伪品的区别 3亚硝酸戊酯（amyl nitrite）及其吸入剂（amyl nitriteinhalant）的含量测定（USP24）三、x 射线粉末衍射法（一）x 射线简介（二）布拉格方程（三）x 射线衍射仪的工作原理（四）应用,2023/3/18,34,第三节 色谱联用技术及其应用一、气相色谱-红外光谱联用技术（一）
18、简介（二）GC-FTIR 系统组成与光谱检索（三）应用示列二、气相色谱-质谱联用技术（一）简述（二）色谱柱（三）接口,2023/3/18,35,（四）定量分析方法 1总离子流色谱法 2质量碎片图质谱法（五）应用示列 1固相萃取结合GC-MS 系统分离生 物体液中常见毒物药物 2GC-MS测定冰片的川芎嗪血药浓度三、液相色谱-质谱联用技术（一）概述,2023/3/18,36,（二）接口装置 1粒子束（partical beam）接口 2热喷雾（TSP）接口 3大气压离子化（API）接口 4动态快原子轰击法（FAB）（三）应用示列 1区安奈德中特殊杂质的检查 2血样和尿样中秋水仙碱的 LC-ISP
19、-MS 定性定量分析,2023/3/18,37,四、液相色谱-核磁共振联用技术（一）方法特点（二）基本操作模式 1连续流动（on-flow）操作模式 2停流（stop flow）操作模式 3峰存贮藏操作模式（三）应用示列,2023/3/18,38,三、核磁共振光谱分析法,核磁共振光谱广泛用于化合物的结构分析，而其在化合物的定量分析中的应用则是比较新的内容，日益受到重视。1定量参数：峰面积或峰高。,2023/3/18,39,2定量的特点：1）对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。2）利用内标法或相对比较法分析混合物中某一化合物时，物需该化合物
20、的纯品作为对照标准。3）峰很窄，远小于各化合物之间的化学位移的差值，因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。4）方法简单快速、准确、专属性高，不破坏被测样品，可选择性的测定混合药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体。,2023/3/18,40,3测定方法：选择一个合适的峰作为测量峰。（1）内标法（绝对测量法）内标法为NMR定量分析最常用的方法，它与GC的内标法相似，在样品溶液中，直接加入一定量内标物质后，NMR光谱测定，将样品指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对重量（Wu）可由下式求得：,百分含量,2023/3/18,41,（2）相对测量法 当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以指定基团上一个质子引起的吸收峰面积（A1/n1）和杂质基团上一个质子引起的吸收峰面积（A2/n2）进行比较，按下式计算：,样品相对百分含量,返 回,
