第13章免疫组织化学技术课件.ppt

《第13章免疫组织化学技术课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第13章免疫组织化学技术课件.ppt（96页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、13第13章免疫组织化学技术,第二节免疫荧光组织化学技术 一、组织处理 二、荧光抗体的标记及染色第三节 酶免疫组织化学技术 一、组织处理二、酶标记抗体免疫组化染色三、非标记抗体免疫酶组化染色四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物第四节 亲合组织化学染色一、生物素-亲合素法二、葡萄球菌A蛋白法三、凝集素法四、链霉亲合素-生物素法,二、抗 原 的 保 存 与 修 复,抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。所以，使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。常用的方法有：酶消化法 盐酸水解暴露抗原法 微

2、波炉恢复抗原法 高压锅恢复抗原法 煮沸恢复抗原法,无花果蛋白酶轻度消化酶胰蛋白酶中度消化酶胃蛋白酶强消化酶,掌握盐酸浓度、水解温度、时间、以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原,借助微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，已暴露掩盖的抗原决定簇。,经济简单，适用于大批切片,也是利用热效应恢复抗原性,三、抗 体 的 处 理 与 保 存,抗体的选择,注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低,抗体的稀释,抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度,抗体的保存,分装密封保存，避免对抗体的

3、污染并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低,四、结 果 判 断,必须设立对照,对照实验：阳性对照 阴性对照确证实验：空白实验 替代试验 吸收或阻断试验,设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体。,采用已知抗原阳性标本与待检标本同时进行,以排除假阳性,用缓冲液代替第一抗体，以排除组织细胞内所含的生物素或内源性酶。直接法常采用。,用与待测抗原同一种动物免疫前血清或非免疫血清代替第一抗体已确认阳性反应不是异嗜性抗原所致非特异性反应。直接法和间接法均可采用,先用已知过量抗原与第一抗体反应，离心后再进行组化染色，此时的阳性标本应呈阴

4、性，其目的在于确认阳性反应是与天然抗原相同的抗原抗体反应，间接法常采用。,阳性细胞显色分布类型 细胞质 细胞核 细胞膜表面,阳性细胞显色：抗原分布于细胞核,阳性显色深浅反映抗原存在的数量，可以作为 定性的依据 定位的依据 定量的依据,阳性细胞呈散在分布,阳性细胞分布分为 散在分布 灶性分布 弥散分布,阳性细胞呈灶性分布,阴性结果和抗原不表达,阴性结果:不能简单认为具有否定意义，阳性表达有强弱、多少之分，只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要视为阳性表达,不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。,特异性染色与非特异性染色,免疫组化结果与HE染色结果,当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时,应

5、再结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线等影像学及实验室结果综合分析,不能简单地推翻HE切片诊断。（HE，苏木精-伊红染色）,五、质 量 控 制,抗体特异性、敏感性测试 抗体最佳稀释度的选择 稀释剂 抗体孵育温度、时间,试剂的质量控制,包括第一抗体和第二抗体,预试验,质量,操作过程质量控制,操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作 人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型 质控品，可用于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差,仪器的质量控制,相关技术设备、仪器和器具定期校对、对试管、吸管、移液器等消毒。,第二节 免疫荧光组织化学技术,定义:

6、采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。,一、组 织 的 处 理,标本的类型：涂片和印片 组织切片 铺片 培养的粘附细胞 悬浮细胞 活细胞标本的保存：标本固定干燥后，最好立即检测 保持干燥、置4甚至-20 以下保存,二、荧光抗体的标记及染色,常用的荧光素：FITC黄绿色；RB200、TRITC橙红色；PE红色；AMC蓝色；Cy3橙红色；Cy5红色；德克萨斯红橙红色 标记方法

7、：搅拌法、透析法标记抗体的纯化：游离荧光素、未标记或过度标记 蛋白的去除标记抗体的质量鉴定：抗体特异性、效价、荧光素 与蛋白质结合比率F/P,荧光免疫组化染色,直接法：优点：操作简便、特异性高 缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦,间接法：优点：较直接法灵敏，标记一种抗 体可以鉴定多种抗原 缺点：非特异荧光、操作时间较长,补体法：优点：敏感度较高、标记一种抗体可以鉴定多种 抗原、适用于任何动物的抗原抗体系统 缺点：非特异荧光、需新鲜补体、操作麻烦,双标记荧光免疫染色法：用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本中的相应两种抗原同时显示,非特异性荧光产生,某些组织细胞、衰老细胞有自发荧光抗体不纯所出现的

8、交叉反应标记抗体质量差，游离荧光素干扰 标记抗体浓度过高免疫荧光染色时间过长洗涤时间不够,非特异性荧光消除,用非免疫血清或10%牛血清白蛋白温育切片封闭非特异抗原位点动物肝粉吸收荧光抗体中非特异性成分层析或透析去除游离荧光素，纯化荧光抗体将抗体的浓度调整到高稀释度选择适合的切片方法封固剂、镜油必须无自发荧光用高渗盐浸洗，降低非特异性染色背景伊文氏蓝衬染法,第三节 酶免疫组织化学技术,定义:是在一定条件下，应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原(抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。,一、组织处理,常用的

9、标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，其固定及标本制作方法见第一、二节。与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点。,二、酶标记抗体免疫组化染色,定义:借助交联剂的共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作用，生成不溶性有色产物，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。常用的方法:直接法 间接法,三、非标记抗体酶免疫组化染色,特点:用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体结合，最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测避免了酶标记抗

10、体对抗体的损伤，提高了方法的敏感性,技术类型,酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物，底物显色,优点：敏感性较酶标法有所提高 缺点：操作分四步，较复杂 如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉 如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题 如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗酶 抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的 敏感性,PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物),+,+,+,Ag,Ag,特点:操作只需三步 PAP复合物稳

11、定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端 桥连抗体存在的非特异性抗体，不能与抗酶抗体结合 抗酶抗体中存在的非抗酶抗体不能与酶结合，不会有酶活性，因而大大减弱背景着色,双桥PAP法基本原理:是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。这种放大方式由于重复使用桥抗体，使桥抗与PAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的Fc段结合，或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。,APAAP法：有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色时就不宜使用HRP体系。用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-

12、抗碱性磷酶(AAP)法，简称APAAP法,四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物,常用种类:辣根过氧化物酶/HRP 底物显色棕色或灰蓝色 最常用 碱性磷酸酶/AP 底物显色玫瑰红色或深蓝色 最敏感 葡萄糖氧化酶/GO 底物显色蓝色 敏感性较低，显色底物不易保存-半乳糖酶等酶的选择:HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰,第四节 亲合组织化学染色,亲和组织化学（Affinity histochemistry）是利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝

13、集素、生物素和葡萄球菌A蛋白等，都对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,可采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。,一、生物素-亲合素法,生物素/Biotin:即维生素H，是一种碱性蛋白。亲合素/Avidin:也被称为抗生物素，它是由4个相同亚基组成的大分子糖蛋白，具有4个与生物素亲和力极高的结合点，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性它们都具有与其它示踪剂结合的能力。,亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术Avidin Biotin Peroxidase Complex t

14、echnique，ABC,原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。,缺点：有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理ABC复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合,优点：敏感性高 特异性高 一抗和二抗工作浓度低 操作时间缩短 可以多重标记,桥联亲合素-生物素技术Bridged

15、Avidin-Biotin technique，BRAB,原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。,标记生物素-抗生物素技术Labelled Avidin-biotin technique，LAB,原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。特点:相当高的灵敏度，省略了加标记生物素步骤，操作较

16、BRAB法简便。间接LAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高 检测灵敏度,二、葡萄球菌A蛋白法,定义:葡萄球菌蛋白A/SPA是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物IgG的Fc段结合，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验,SPA可以和人及多种动物的IgG结合，解决不同动物检测时，需分别标记相应二抗的问题SPA结合部位是Fc段，因此不会影响抗体的活性 SPA具有双价结合力SPA对IgG亚型的结合有选择性，可能出现的假阴性结果,三、凝集素法,凝集素/lectin 是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖

17、的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素凝集素具有与特定糖基专一结合的特性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具凝集素法就是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲合反应,直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应-凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”的结合物。,四、链霉亲合素-生物素法(LSAB）,链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的

18、一种纯蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法,LSAB法具有几大特点：可结合更多的生物素化的二抗，放大效应远远超过ABC法低背景着色操作时间缩短,第五节 免疫电镜技术,一、免疫标记电镜技术的原理,免疫电子显微镜（Immunoelectron Microscope，IEM）技术是利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物，在电子显微镜下对高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。特点:定位更为精确，可

19、定位至细胞膜、细胞器 在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点,二、免疫标记电镜技术标本的制备要求,标本制备的要求是保存良好的细胞超微结构，注意保持组织的抗原性，因此在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强。在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。,三、常用的免疫标记电镜技术,免疫胶体金染色法,免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。它在弱碱环境下可与蛋白质分子形成牢固的静电结合而不影响蛋白质的生物特性。,分类：按染色

20、步骤 直接法 间接法按标记与包埋的关系 包埋前标记法：抗原活性保存较好，标记率较高 包埋后标记法：可对一个材料反复进行标记，试剂用量少,前列腺内分泌-旁分泌细胞免疫胶体金染色显示有降钙素的沉积,应用：细胞表面成份的研究胶体金技术与冷冻蚀刻技术结合-细胞膜蛋白颗粒或其它膜成份进行精细定位电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基因位点,免疫胶体铁细胞化学染色法,胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。,酶免疫电镜技术,酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度

21、，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。,第六节 免疫组化技术的应用,一、免疫组织化学技术的临床应用,荧光免疫组织化学技术的应用,HEP-2细胞抗着丝粒抗体的阳性显色,肾小球抗基底膜抗体的阳性显色,藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌,猴胚肾细胞内弓形虫繁殖 吖啶橙染色绿色-DNA 红色-RNA,恶变组织中肿瘤抗原的检测,人肝癌细胞吖啶橙染色,其他：免疫荧光技术也应用于血液中B细胞和T细胞及其亚群的鉴定、特殊染色体的鉴定、激素和酶的局部组织定位等方面。,酶免疫组织化学技术的应用,提高病理诊断准确性（HE可观察到炎性细胞浸润，ED1染色可观察到巨噬细胞浸润）,Survivin在肝

22、癌细胞核的表达,癌基因蛋白的临床应用,Ki67在小肝癌组织中的表达,辅助诊断免疫性疾病和感染性疾病，观察免疫复合物沉积状况,二、免疫组织化学技术的拓展,荧光激活细胞分类仪（FACS）,FACS是将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、激光和微机信息处理系统等多学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与应用研究的一种先进仪器,共聚焦显微镜技术的应用,激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM),工 作 原 理,共轭光路使非焦平面的光线被抑制，减少了干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率更高增加了激光扫描部分，可连续、固定范

23、围内小功率扫描，记录动态变化光学结构为共轭聚焦结构，此结构可使样品中间固定层面被激光扫描，通过调节参数可实现样品的多层扫描，俗称“细胞CT”,一般荧光显微镜（左）与激光共聚焦显微镜（右）的区别,LSCM 应用广泛,罗丹明123染细胞线粒体,鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝,检测人类癌细胞表皮生长因子,分层扫描、光学切片,较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞,较厚层面(平滑肌损伤可见)较薄层面 兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞,植 物 切 片 三 维 重 建,随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值,细胞胞浆胞核同时动态测量Ca离子,其他：

24、随着新软件的不断开发及各个学科的不短发展和相互渗透，LSCM还将会有更广阔的发展前景，并将生命科学的基础研究引向深入。,三、显微切割技术,显微切割技术是在显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞，细胞内组分等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。根据研究的需要可在显微切割前应用免疫组织化学、原位杂交等方法对需要切割的组织内成分进行标记。,显微切割仪,思考题,免疫组织化学技术有几个主要步骤？免疫组织化学技术操作中的主要注意事项？何为直接法、间接法、补体结合法荧光免疫组化技术？其各自优缺点如何？何为直接法、间接法、酶免组化技术？其各自优缺点如何？何为酶桥法、PAP、APPAP法技术

25、？其各自优缺点如何？何为生物素亲合素法？常用的技术类型及特点如何？何为葡萄球菌A蛋白法、凝集素法、链霉生物素亲合素法？何为免疫电镜技术的原理？胶体金技术特点如何？免疫组织化学技术的临床应用如何？共聚焦显微镜技术的原理和临床应用？,小 结,免疫组织化学技术采用了标记抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定。该技术的应用便于在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。免疫组化技术进入了一个全新的发展阶段，图像分析、流式细胞技术的运用，使免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。免疫组织化学技术已成为现代生物医学研究和实际工作特别是临床检验工作中不可缺少的工具。,96,结束语,谢谢大家聆听！,