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1、生物化学实验教案,生化小老师一组,生物化学实验室生化小老师团队,氨基酸的分离鉴定纸层析法,实验目的,实验原理,纸层析 纸层析法属于分配层析，层析滤纸为载体，流动相是指层析液，在毛细拉力作用下，层析液能不断由下向上流动。固定相是指被吸附在滤纸纤维之间的水分。由于纤维素上的羟基具亲水性使这部分水束缚在纤维素周围，不易扩散而成为固定相。,实验原理,在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经滤液滴点时，滴点上的氨基酸就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的氨基酸分子，随层析液向上移动得快，形成的斑点集
2、中在滤纸的上部；而分配系数小的氨基酸分子，随层析向上移动得慢，形成的斑点集中在滤纸的下面。,实验原理,分配系数 指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。在同一实验条件下，比移值Rf主要取决于分配系数，不同的物质分配系数不同，也就有不同的Rf。此外，溶剂的溶质的性质、滤纸的性质、展层的温度和p H值均会影响比移值Rf。在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经滤液滴点时，滴点上的氨基酸就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液
3、分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的氨基酸分子，随层析液向上移动得快，形成的斑点集中在滤纸的上部；而分配系数小的氨基酸分子，随层析向上移动得慢，形成的斑点集中在滤纸的下面。Rf=,原点到层析斑点中心的距离,原点到溶剂前沿的距离,实验原理,茚三酮的显色原理 氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemanns purple）。,实验试剂与仪器,试剂 纯净的赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸810E-3mol/L溶液；四种氨基
4、酸混合溶液（每种浓度与对应纯净溶液一致）；2.5%茚三酮丙酮溶液；酸性展层剂（正丁醇：88%甲酸：水=60：17：8）。仪器 钟罩1、培养皿1、小烧杯10ml1、层析柱1、小漏斗1、新华一号滤纸（14cm17cm）1、电吹风、烘箱、毛细管、订书机，及其他常用仪器。,实验步骤,点样 取洁净滤纸一张，在距底边2cm线上取五个点（每两点相隔距离2cm），分别用毛细管将各氨基酸样品点在五个点上，点样大小以直径3mm左右为宜，不要超过5mm，冷风吹干，重复点样一次，吹干。,实验步骤,实验步骤,平衡 将滤纸卷成柱状将两边缘对齐（注意不要让两端接触，造成层析液上升高度不一致），并用订书机订好，将滤纸竖直放置
5、在洁净的培养皿中（不要接触培养皿壁），旁边摆放一个内盛展开剂的小烧杯，盖上钟罩平衡30min。,实验步骤,层析 平衡结束后，打开钟罩上端塞子，通过已润洗的“漏斗层析柱”装置向培养皿内加入展层剂3040ml至液面达到培养皿2/3处为宜（层析柱不能碰到滤纸），小心抽出装置（不要让层析液滴落在滤纸上），盖上塞子开始层析，直到前沿达到距滤纸上端1cm刻线处（此过程23小时）。,实验步骤,显色 取出层析好的滤纸（需带手套），拆开订书钉，用电吹风冷风吹干。将滤纸放入烘箱烘烤5min左右，待显色后取出。用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，找到中心点，测出中心点与原点水平线的距离，计算各种氨基酸的比移值Rf，判断混
6、合点上端各点是什么氨基酸。,注意事项,1.整个操作过程需带手套进行，不要对着滤纸说话，以免滤纸被污染。2.点样时应注意毛细管的取放，以免污染试剂。3.点样吹干时不宜吹得过干。4.柱状滤纸边缘尽量保持竖直，边缘的坡度会 影响层展的速率及效果。订的钉子上下各两颗为宜。,实验结果及分析,图像实例,各氨基酸比移值Rf,实验结果及分析,在同一实验条件下，比移值Rf主要取决于分配系数，不同的物质分配系数不同，也就有不同的Rf。此外，溶剂的溶质的性质、滤纸的性质、展层的温度和p H值均会影响比移值Rf。实验中，Rf值与个人操作及具体实验条件息息相关，存在一定波动，但总体趋势相同。,思考问题,实验结果及分析,
7、3，5二硝基水杨酸比色法测还原糖和总糖含量,实验目的,实验原理,还原糖在碱性条件下加热被3，5二硝基水杨酸（DNS）氧化成糖酸及其他产物，3，5二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3氨基5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖与棕红色物质颜色的深浅成正比例关系，利用分光度计，在540nm波长下测定光密度值，测绘并查对标准曲线，计算还原糖及总糖含量,实验原理,实验试剂与仪器,小麦面粉3，5二硝基水杨酸（DNS试剂）：将6.3g DNS 和262mL 2mol/L NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL
8、，贮于棕色瓶中备用。1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4冰箱中保存备用。碘-碘化钾溶液、酚酞试剂、6mol/L HCL及6mol/L NaOH溶液,主要试剂：,实验试剂与仪器,具塞玻璃刻度试管：20mL10、普通小试管2只、离心管：10mL2、容量瓶：50mL1，100ml1、吸量管：1mL1；2mL2、点滴板、恒温水浴锅、离心机、电子天平、分光光度计、胶头滴管、玻璃棒等其他常规仪器。,主要仪器：,实验步骤,还原糖的提取：,实验步骤,总糖的提取：,实验步骤,标准曲线的测绘及还原糖和总糖含量的测定：,将上表中各溶液用分光光度计测量吸光度，用16号试管数据绘制标准曲线，将7、8、9、10号试管所得吸光度和绘制的标准曲线比对，计算还原糖和总糖的平均含量。,实验结果及分析,计算公式：,实验结果及分析,参考实例,还原糖：5.13%总糖：82.7%,实验结果及分析,思考问题,注意事项,离心管盖子应盖紧，管中液体不超过4/5，离心管应对称摆放操作过程中所有洗涤操作应多次少量皮肤沾到HCL、NaOH、DNS等有毒或腐蚀性试剂应立即用大量水冲洗，注意实验安全,生化一组祝大家实验成功,Thank you!,
