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1、兰花组织培养技术研究,植物激素的配制,1）IAA IBA GA3先溶与少量95%酒精，再加水定容到一定浓度。1N NaoH 2）NAA可溶于热水或少量95的酒精中，再加水定溶到一定浓度。1N NaoH 3）2，4D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后，再加水定容至一定浓度。4）KT和BA先溶于少量1mol的HCl中，再加水定容。5）玉米素先溶于少量95酒精中，再加水至一定浓度。,”,组织培养,1外植体的选择2培养基的选择3培养方式的选择4植物生长调节剂的影响5附加物对根状茎增值与分化的影响6分割方式的影响7光照的影响8活性碳的影响9糖浓度的影响10其他影响因素,组织培养：就是分离植物体的一部
2、分，如茎类、芽、叶、花、幼胚等，在无菌试管，并配合一定的营养、激素、温度、光照等条件，使其产生完整植株。由于其条件可以严格控制，生长迅速，1-2个月即为一个周期，因此在花卉植物的生产上有重要应用价值。培养程序：外植体-诱导形成类原球茎-类原球茎大量增殖-分化出小植株-生根壮苗培养-温室栽培-室外栽培,1外植体的选择,Bernard（1899）年首次分离出兰花的根菌，并用其感染兰花的种子进行萌发试验，创立了兰花种子共生萌发的方法。孙志栋等（2006）用春兰的种荚成功诱导出原球茎。黄磊等（2004）用春兰和大花蕙兰（C.hybrids）的杂交种子，经非共生萌发得到了无菌试管苗。,种子消毒的方法,先
3、用镊子取出花粉块，轻轻放在柱头上。授粉成功后，子房逐渐膨大，结果。剪下果实。用75%浸泡30S,倒人次氯酸钠溶液消毒20MIN，蒸馏水洗净4次,切开果实,播在培养基上，进行无菌繁殖，3-4个月就可发芽。,种子成熟度对发芽的影响,郑 琪，赵虎等（2007年）用春兰（小打梅）春兰（绿壳素）、进行实验，发现未成熟种子的发芽速度最快，快的30 d发芽，最慢的60 d发芽均比同组合的成熟种子提早发芽。邢 海，褚剑峰等（2007年）用春兰（外碟）春兰（大富贵）组合的种子进行实验研究表明采集的未成熟种子的发芽率较高，最高的达到60，最低的也有20，均高于同组合的成熟的种子发芽率。,茎尖消毒方法,先在栽培2、
4、3年的兰株根部切取23 cm的生长芽。用流水冲洗20 min。在温度为2225的无菌组培室里。把最外面的l2片苞叶去掉，放在次氯酸钠溶液中浸泡l5 min，灭菌。然后剥离。切割成25 mm的茎尖，接种到准备好的培养基上，移至培养场所。34个月后发出根状茎。,2基本培养基的选择,中国兰组织培养的不同阶段对培养基要求不同，如用于原球茎诱导增殖的培养基，常用的是改良的MS、White、VW、Knudson C、Kyoto（王熊，1988）等。春兰需要无机盐含量低的培养基，其长期继代培养以1/2MS为宜，而蕙兰、墨兰则要求无机盐含量高的培养基。（张菊野等，1993；陈丽等，1999）,石乐娟（2006
5、）以茎尖诱导产生的春兰绿云(Cymbidium goeringiiLtiyun)腹轮艺品种的类原球茎为材料进行实验。,B5 培养基上的根状茎增殖较快，培养50 d后根状茎呈深绿色，部分开始褐化。12MS固体培养基上的根状茎直径较大，生长粗壮，颜色嫩绿，生长状况明显优于B5。B5培养基有利于根状茎短期的快速增殖，长期继代培养及保存宜选用12MS固体培养基。余道平（2005）在春兰离体培养时，采用了MS、1/2MS和改良MS三种培养基，结果发现以1/2MS为基本培养基效果最好，改良MS次之，最差的是MS。,3培养方式的选择,兰花的培养方式有固体培养、液体培养和液固培养等3种 傅向东等（1997）；
6、张菊野等（1993）发现春兰原球茎生长与分化成苗在液体培养时有较好结果。周全，余平（2009)用素心春兰进行实验，先用液体培养后转入固体培养有利于春兰根状茎新生长点的产生，采用固体培养的重量增殖倍数最高，而用液体培养的效果最差。,4植物生长调节剂对兰花组培的影响,常用的外源生长物质主要是生长素类（IAA、IBA、NAA和2,4-D等）和细胞分裂素类（BA、KT和ZT等）。,4.1植物生长调节剂对根状茎增殖及分化的影响,4.1.1 增殖影响周全,余平（2009）优化筛选出适合根状茎增殖的培养基为：12MS+3 mg/L BA+蔗糖3+香蕉5+琼脂08.张士良等（2006）认为生长素浓度在03 m
7、g/L范围内，越高越利于根状茎的形成，但相对抑制了根状茎的增殖，IBA促进生长的效果显著优于NAA，以1.0 mg/L 浓度最好。,4.1.2 分化影响石乐娟（2006年）将长度超过10 mm，直径2 mm以上且生长粗壮的根状茎接种在12MS培养基上，添加不同浓度组合的6-BA与IBA，以促进分化。表明12 MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA 更利于根状茎的分化，植物生长调节剂浓度过高或过低均不利于分化。,4.2植物生长调节剂对芽增殖的影响,余道平(2005）提出当NAA浓度为0.2 mg/L、6-BA浓度为2.0 mg/L时，芽的增殖倍数最高（2.67）。当NAA浓度
8、为0.3 mg/L、6-BA浓度为3.0 mg/L时，芽的增殖倍数有所下降，芽生长不良且有明显的分泌物产生和一定频率的褐化。因此，综合起来看，适宜芽增殖的培养基配方为：1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA,4.2植物生长调节剂对原球茎增殖的影响,王莲辉等（2007）将初代培养的原球茎和芽分别在培养基：A MS+KT0.5+IBA 0.2+100 mll椰乳；B MS+KT 1.5+IBA 0.2+100 mll椰乳；C MS+6-BA 0.5+NAA 0.2+100 mll椰乳；D MS+6-BA 2.0+NAA 0.2+100 mll椰乳上继代增殖培养，培养基A、
9、B上原球茎大多形成植株，增殖速度慢；培养基C、D上原球茎增殖速度快，增殖效果好，6070d能继代增殖1次。由此可见，生长素NAA和细胞分裂素6-BA组合是原球茎增殖的主要因素；生长素IBA和细胞分裂素KT组合增殖效果不理想。,刘晓芳，黄闽敏等（2009）用春兰品种大富贵进行实验的结果表明原球茎增殖过程中，各激素都产生了明显的影响，其中6-BA影响最大，其次是NAA和活性炭，IBA、水质和蔗糖对其增殖系数影响较小。IBA处理6-BA 2.0 mg/l+NAA0.01 mg/l 的组合浓度对春兰原球茎的增殖具有较好的促进作用。,4.3植物生长调节剂对种子萌发的影响,王莲辉等（2007）发育180
10、d的种子分别接种到萌发培养基春兰种子萌发培养基：(1)12MS；(2)12MS+100 mlL椰乳；(3)MS；(4)MS+100 mlL椰乳；(5)l2MS+NAA 05 m gL+100 mlL椰乳；(6)MS+NAA 05 m gL+100 mlL椰乳。,原球茎继代增殖培养基上，暗培养2周后，可见白色原球体出现，转入光下培养，3周后原球茎转绿，之后原球茎上长芽。培养基(1)、(2)、(3)、(4)上的萌发率相差不大，都在40左右，且培养1个月后发现部分原球茎褐化死亡；培养基(5)、(6)上萌发速度和生长速度快，萌发率达60%以上，表明激素NAA对种子萌发有促进作用，MS培养基较12MS培
11、养基更有利于春兰种子生长发育。(陈光禄1983)0.1 mg/LNAA与0.01 mg/LKT配比对春兰的种子萌发有促进作用。,5 附加物对根状茎增殖与分化的影响,周全等（2009）用素心春兰对培养基中添加附加物的研究表明：添加附加物比未添加附加物的对照有促进根状茎增殖的作用；在使用100 g/L 香蕉作为附加物时，春兰根状茎在培养30 d后，重量可达初重的21倍。,石乐娟等（2006）研究发现，在1/2MS培养基中加入椰子汁、芋艿糊、香蕉泥3种附加物均促进了根状茎的增殖。芋艿糊显著促进根状茎的增殖和伸长，生长粗壮，80d后可以明显促进芽的分化。春兰、建兰原球茎在补加椰乳的培养基培养时，均可促
12、进原球茎生长，使其顶部伸长而有利于分化形成芽。但与建兰不同的是，春兰原球茎在补加椰乳的培养基中长期培养时，增殖反而不如不加椰乳的显著（张菊野等，1993）。,6 分割方式的影响,石乐娟等（2006）发现分割方式对根状茎增殖影响较大，纵切易导致死亡横切可以少量存活但生长较慢，以掰开方式为最好。此外掰开时接种团快带有35条根状茎适宜，过少则增殖较慢，这表现出兰属植物喜群居而恶独生的生理特性，同时也表现出自然界生物普遍具有的一种群体生长效应。,7光照的影响,陈 锵（2008）认为全光对根状茎增殖更有利。在增殖数上，光照越强增殖数越多。在根状茎分枝的平均长度上，光照越强长度越长。周全，余平（2009）
13、暗培养根状茎将不会分化成苗光照是根状茎分化的必需条件。,8活性碳的影响,Lee（1990）认为由于活性炭吸附了培养基中的生长调节物质，使培养基中的外源激素含量低至不足以启动和引发芽分化的水平。陈锵（2008）认为活性炭对根状茎的增殖有促进作用。从诱芽率看，活性炭对发芽具有强烈的抑制作用。浓度越高，抑制性越强。刘晓芳等（2009）实验表明加人活性炭有利于原球茎的增殖，但其浓度必须控制得当，当浓度增大到3.0 mg/L 时对其增殖产生抑制作用。,9糖浓度的影响,Kusumoto（1980）认为2%的蔗糖下兰属原球茎生长最好 陈锵（2008）固体培养基中糖浓度梯度对根状茎增殖率没有显著的影响，而糖浓
14、度对生长量(鲜重)有比较大影响，l0gL增至20gL时生长量增加明显，重量增至原来的4.374.72倍左右，20gL增至30gL时生长量增加小。无论是增殖率还是增重率，食用白糖均优于蔗糖。根状茎诱芽糖处理影响：白糖代替蔗糖是可行的，浓度l0gL最经济。,10其他影响因素,培养温度253最好，温度过高杂菌容易发生，培养物生长受阻。培养室相对湿度一般保持在70%75%最适。pH影响细胞的透性、代谢和培养物生长、分化。兰花所用的培养基一般呈弱酸性，pH在5.06.0，不同的种类对pH的要求不同。中国兰比较敏感，pH以5.15.4为宜。孔凡龙（2008）在实验中发现，春兰pH以5.6为佳。,石戈和吴婷
15、婷（2006）发现高压静电场促进舟山春兰愈伤组织的生长。有研究测试了二氧化碳对兰属类原球茎增殖的效果，发现高浓度二氧化碳只有在低浓度蔗糖中才产生有益作用（吴应祥，1992）。何篙等（1994）观察到乙烯抑制剂硝酸银可大大加快春兰和墨兰杂交种根状茎的分化频率。,蕙兰组织培养的主要步骤,原球茎诱导：培养基为MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L+椰子汁100mg/L+蔗糖20g/L+琼6g/L脂.弱光下25摄氏度培养，3-4个月可见原球茎生长，初期为白色，置培养架上每天12小时，光强1500-2000lx，原球茎迅速转绿，不久伸长形成根状茎。花径和花器官也可以作为外植体，花芽分化形成在生长
16、停顿前采取最佳，NAA5-10mg/L，2,4-D0.2-1 mg/L,增殖：根状茎切割转入MS+NAA0.5-1mg/L+BA0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼6g/L脂.置培养架上每天12-16小时，光强1500-2000lx，25摄氏度培养,30-40天继代培养1次,分化：把粗壮的根状茎切割1cm长段，MS+NAA0.1-0.5mg/L+BA2.5-3g/L+蔗糖30g/L+琼6g/L脂.置培养架上每天16小时，光强1500-2000lx，25摄氏度培养,20天陆续分化成芽,成苗：当芽高2cm左右时切割，转入壮苗生根培养基，未分化的根状茎转入增殖培养基继续继代培养，壮苗生根培养基
17、为1/2MS+NAA2-3mg/L+BA0.2-1mg/L+香蕉泥100g/L+蔗糖20g/L+琼5g/L脂+AC 3-5g/L.25摄氏度培养，置培养架上每天16小时，光强2500-3000lx，幼芽不久分化生根，当试管苗高15cm以上，根3-5条时，可以炼苗移栽。,蝴蝶兰花梗培育过程,一、花梗腋芽培养1、采用连花梗组织采芽法2、采用不带花梗组织的采芽法二、花梗节间培养消毒后，将花梗节斜切成1-1.5mm的薄片，将薄片平置于VW+BA1-3mg/L+蔗糖20g/L的固体培养基中培养，进行原球茎诱导,1、先将整枝花梗用75%酒精棉球擦拭，切成约5cm的每节带芽小段，仔细除去苞片，以防伤及嫩芽，
18、然后用2%次氯酸钠溶液消毒20min，其间不停的摇动，消毒后用无菌水冲洗3-5次，放在培养皿中。用解剖刀将两端被次氯酸钠漂白部分各1.5cm，将其插入培养基中，芽体朝上插接在 1/2MS+BA3g/L+蔗糖20g/L+水解乳蛋白1 g/L+琼8g/L脂+活性炭1g/L，pH为5.6的培养基上。无菌苗可按以下方法切离：一种将小芽切离花梗茎段，并横切为上下两段，分别接种培养。一种是将芽切离茎段，作为种苗接种增殖培养，,分切花梗,灭菌消毒,接种到培养基,诱导出试管苗,去掉花梗,将试管苗植入试管,分化更多苗芽苗,分切植入更大管器,增殖分化更多苗芽,部分用于继代培养,部分用于育苗,采用不带花梗组织的采芽
19、剥离的腋芽首先接种在Hyponex 3g/L+NAA1-2 mg/L培养基中，自然增殖成团块，并分化出许多原球茎状芽，分割后可在Hyponex 3g/L+NAA1 mg/L+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L，MS+NAA1 mg/L+BA5-10mg/L+液乳10%培养基中进行继带增值，生根成苗培养基：MS+BA0.1 mg/L+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L,建兰的组织培养,1花芽的采取和预处理：采用花枝茎节切断进行组织培养获得无性系。取当年生2-6cm长的幼嫩花茎，经流水冲洗，用0.1%Hgcl2消毒液浸泡8-10min，在超净工作台内仔细剥去外层包叶，将花枝切成1cm长的小段，每段带一茎节，然后浸入3%双氧水中浸泡消毒10min左右，无菌水冲洗3-5次，分别接种于培养基。2花芽诱导原球茎或试管内开花：将花枝茎段接种在MS+NAA0.1-0.2mg/L+BA5mg/L+GA1mg/L+蔗糖20g/L+琼6g/L脂,腋芽继代在MS+NAA0.2mg/L+BA2mg/L+蔗糖20g/L+琼6g/L脂，,大花蕙兰嫩芽的离体培养,采用连花梗组织采芽法,采用不带花梗组织的采芽法,花梗节间培养,
