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1、大家好,利用RAPD技术研究柳属种间亲缘关系,研究背景,仪器、材料,研究方法,结果分析,可行性分析及展望,本世纪 60年代以来，分子标记（molecular marker）技术作为一种新型的遗传标记形式在生物的遗传育种和遗传研究等方面发挥了越来越大的作用，在众多的 分子标记中，由 Williims和 Welsh等建立起来的 RAPD技术以快速、准确、灵敏等特点，受到了生物学领域研究者的重视和广泛应用。,研究背景,RAPD(random amplified polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA标记。其以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10 个碱基对
2、)为引物,在热稳定的DNA聚合酶作用下,进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。,技术简介,作为PCR技术的延伸，RAPD区别于PCR表现在：RAPD使用随机引物，引物具通用性；引物在每个反应中加一种而不是一对；退火温度较低，一般为36；此外，较常规PCR更适宜程序化。,柳属Salix L.全世界约520种,我国有275种柳属是分类极为困难的植物类群之一,其原因是:柳属为柔荑花序,花部形态简单,能提供的用于分类的特征少;柳属的
3、种间或居群间特征变异大,而普遍的自然杂交现象使得种间的形态界限更加模糊;柳属为雌雄异株,而且雌、雄花开放、叶长出的时间往往不一致,因而很难在同一个植株或个体上看到一个种的所有特征。因此,仅有外部形态性状常难以很好地解决其分类学问题,仪,试,器,剂,模板DNA（10100ng）寡核苷酸引物（20mmol/L贮存液）0.2 mmol/L dNTPs Taq DNA聚合酶10PCR缓冲液 电泳所需试剂等,PCR扩增仪 电泳装置 微量离心机 微量移液器0.5 ml Eppendorf管 紫外线观察装置及照相设备,仪器材料,RAPD标记的操作步骤,选择材料,技术的基本步骤,模板DNA的制备与调整采用CT
4、AB法提取DNA的方法提取基因组总DNA（gDNA）DNA沉淀经溶解稀释后琼脂糖凝胶电泳检测OD值，确定提取的质量和浓度，最后将合格的提取液浓度调整一致，保存备用。,CTAB法提取DNA,加入样品，离心，取除去上清,加入PBS震荡离心,加入CTAB buffer震荡,培养20分钟然后离心,取上清液加入RNA酶培养,加入等体积苯酚,离心，取上清,加入异丙醇,放置使DNA沉淀,倒出上清，风干DNA,加入TE buffer溶液在在70度条件下5分钟,用Nanodrop检测DNA,各组分的混配,DNA扩增将盛放以上各组分的离心管放在PCR仪上，按反应程序设定进行DNA扩增，设置:94 预变性2min,
5、94 变性1 min,36 退火1min,72 延伸1.5 min,72 终延伸5 min,40 次循环;4 保存。,PCR 扩增产物的检测以大、小Marker(DNA/H ind III和D2000)为标准分子量,1.0%的琼脂糖凝胶电泳,其中含有浓度为0.5g/ml 溴化乙锭,取 2l 的 loading buffer 与扩增产物混匀,10l 点样,电压为100V,电泳2h,最后用成像系统照相保存引物的筛选用上述方法对约120个随机引物进行筛选,最后挑选出稳定、分辨率较好的若干个引物。,数据的记录RAPD扩增重复2次独立的试验得到稳定的电泳 图谱RAPD扩增产物以1、0统计建立二维矩 阵在
6、相 同迁 移位置上(相 同分子 量片段)有带记为“1”，无带记为“0”根 据 Nei Li(Czekanowski(1913)公式计算遗传相异系数 Sxy相似性系数 Sxy2Nxy(N+N)，N代表在材料 X中某一引物扩增的条带数，N代表在材料 Y中同一引物扩增出的条数，Nxy代表在 X和Y中扩增出片段长度相同的条带数遗传距离 GD(geneticdistance)1一Sxy,结果与分析,利用 RAPD 分子标记分析东北地区杂草稻的亲缘关系,利用 RAPD 分子标记分析东北地区杂草稻的亲缘关系,可行性分析及前景展望,随机扩增多态性(RAPD)具有可行性：DNA可通过柳属植物细胞核酸提取PCR扩
7、增技术可以实现随机扩增多态性(RAPD)更具有优越性：所需DNA样品少；无需专门设计RAPD 扩增引物；能直接对基因组进行检测；扩增无特异性；退火温度低；RAPD 技术简便易行、省时省力；操作安全，对人一般不构成危害等。,前景展望,.将分类学与分子生物学结合起来，从分子水平上区别种属差异。.分类学进入分子研究时代。.分子标记技术与DNA 提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息(数据)处理计算机化的结合,必将加速遗传图谱的构建、基因的定位及克隆、物种亲缘关系鉴别及与人类相关的致病基因的诊断和分析等。,不足之处,.实验的稳定性和重复性差.RAPD 对反应条件相当敏感.基因组太大，筛选基因间的差异工作量大.凝胶电泳的分辨率不够高，可能有区带重叠现象，使得观察到的条带偏少,谢谢！,
