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1、第五章 药物定量分析与分析方法验证,第五章 药物定量分析与分析方法验证,第一节 定量分析样品的前处理方法第二节 定量分析方法的特点第三节 药品分析方法的验证第四节 生物样品分析方法的基本要求,第五章 药物定量分析与分析方法验证,生物样品分析的特点1干扰物质多生物样品中含有大量的内源性物，如质蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分析样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析2样品量少、不能重复取样生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样3被测成分浓度低对分析方法的灵敏度及专属性要求较高,第五章 药物定量分析与分析方法验证,1.检测方法的高灵敏度最低检测量10-910-7g或10-1510-1
2、2g2.分离方法的高选择性、高专属性为满足各项要求，最常用的分析方法有1）色谱法GC、HPLC、HPCE（high-performance capillary electrophoresis）2）免疫分析法RIA、EIA3）联用技术GC-MS、LC-MS,体内分析方法要求,（1）去除蛋白质(血样),加与水混溶的有机溶剂蛋白质分子内和分子间氢键发生改变.(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加中性盐蛋白质脱水.(饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等)加强酸与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀(10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等)加含锌盐及铜盐的沉淀剂与蛋白质阴离 子形成不溶性盐沉淀.(CuSO4
3、-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)酶解法枯草菌溶素.适用于酸不稳定及蛋白结合牢固药物.,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,（2）缀合物的水解(尿样),含羟基、羧基、氨基和巯基药物+葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸苷缀合物含酚羟基、芳胺和醇类药物+硫酸 硫酸酯缀合物,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,常用方法:酸水解:盐酸酶水解:葡萄糖醛酸苷酶 硫酸酯酶 葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,（3）分离纯化与富集,液-液萃取法水相pH值是萃取成功的关键水相最佳pH值 碱性药物：高于
4、pKa值12个pH单位 酸性药物：低于pKa值12个pH单位,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,但生物样品宜在碱性或近中性提取生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取 空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱性(pH13)下提取液的杂质峰最少,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,液-固提取法（固相萃取法）,原理：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通
5、过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,(4)化学衍生化,化学衍生化目的使药物变成具有能被分离的特性提高对样品的检则灵敏度增加药物的稳定性提高对光学异构体的分离能力,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,（5）有机破坏,方法：湿法破坏 干法破坏 氧瓶燃烧法,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,湿法破坏,常用试剂：硝酸或硝酸-高氯酸.特点：破坏能力强、反应激烈，无机 金属离子为高价态.
6、应用：适用于血、尿、组织等生物样 品的破坏.,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,高温炉高温破坏应用适合人发样品的破坏,干法破坏,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,生物样品的处理方法,氧瓶燃烧法,应用血浆、人发中卤素、硫、硒等 血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上60 烘干,按规定折叠后固定.人发：洗净、干燥（60 80）剪碎,称取0.1 0.3g置无灰滤纸,按规定 折叠固定.,生物样品的处理方法,第五章 药物定量分析与分析方法验证-样品前处理,第五章 药物定量分析与分析方法验证,生物样品定量分析方法验证内容与基本要求,1特异性避免干扰2标准曲线与线
7、性范围覆盖所有浓度范围3准确度与实际状况相符4精密度结果可重现5定量限达到峰浓度的1/101/206稳定性确保所有样品准确测定7提取回收率确保准确度,18,一、方法特异性,方法的特异性(specificity)又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力专属性表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力特异性涵盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性考察一个分析方法是否具有特异性。,第五章 药物定量分析与分析方法验证,19,二、标准曲线与线性范围,标准
8、曲线（standard curve）calibration curve or working curve生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度）通常用回归分析方法所得的回归方程来评价除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式回归分析法为最小二乘法（least squares）或加权最小二乘法（weighted least squares）线性范围（linear rang）标准曲线的最高与最低浓度的区间模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度,第五章 药物定量分析与分析方法验证,20,二、标准曲线与线性范围(续),标准曲线用模拟生物样品建立 线性范围(不包括零点)
9、应能覆盖全部生物样品中的药物浓度 不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度建立标准曲线所使用的模拟生物样品 应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备,第五章 药物定量分析与分析方法验证,21,标准曲线的限度要求,药代动力学或生物利用度研究标准曲线至少包括5个浓度(通常为58个浓度,不包括零点)最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%5%，并应为方法的LOQ(非LOD)回归方程的截距应接近于零相关系数要求 0.99(色谱法)或0.98(生物学方法)若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归如1、2、5、10、20和10、20、50
10、、100、200,第五章 药物定量分析与分析方法验证,22,三、准确度,方法准确度(accuracy)系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定一般用相对回收率(relative recovery，RR)或 相对误差(relative error，RE)表示,第五章 药物定量分析与分析方法验证,23,1.测定法,取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算在标准曲线范围内制备质控(quality control，QC)样品高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3个浓度每
11、一浓度至少5个样本与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次,第五章 药物定量分析与分析方法验证,24,2.结果计算与限度要求,计算测定值M(measured)平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值相对回收率相对误差限度要求相对回收率应在85%115%(LOQ附近80%120%)RE在15%(LOQ附近为20%),第五章 药物定量分析与分析方法验证,2023/3/24,体内药物分析,25,四、精密度,方法精密度(precision)系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度表示该分析方法的可重复性(reproducibility)反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点
12、之一实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.52ml)使用模拟生物样品测定,第五章 药物定量分析与分析方法验证,26,1.表示方法,方法精密度一般用标准偏差(standard deviation，SD)或相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD=RSD=包括批内(within-run或intra-assay)RSD日内(within-day)批间(between-run或inter-assay)RSD日间(between-day，day-to-day),第五章 药物定量分析与分析方法验证,27,2.测定法分别测定法(),照准确度项下方法，取空白生
13、物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的QC样品，并分析测定批内RSD每一浓度56个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD批间RSD每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度56个分析批数据)的RSD,第五章 药物定量分析与分析方法验证,28,2.测定法连续测定法(),若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的每1批次为56个样本)方差分析法 批间RSD=批内RSD=,第五章 药物定量分析与分析方法验证,2023/3/24,体内药物分析,29,3.限
14、度要求,在药代动力学和生物利用度研究中对g/ml级水平的RSD一般应10%ng/ml级水平的RSD一般应15%在LOQ附近RSD应20%。,第五章 药物定量分析与分析方法验证,30,五、定量限,方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度又称为方法灵敏度(sensitivity)标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点LOQ)要求应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度准确度在80%120%(或RE在20%的范围内)RSD20%,第五章 药物定量分析与分析方法验证,31,六、稳定
15、性与质量控制,稳定性包括方法稳定性和样品稳定性方法稳定性方法的耐用性样品稳定性生物样品的存放条件和时间、冻-融循环测定法QC样品穿插于实际样品测定全过程模拟(或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察要求准确度85%115%(RE在15%范围内)，RSD15%,第五章 药物定量分析与分析方法验证,32,七、提取回收率,生物样品的预处理方法重点考虑方法准确度(或相对回收率)，操作简便、快速提取回收率(绝对回收率，absolute recovery)，70%萃取回收率与相对回收率的意义不同提取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失相对回收率采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度,第
16、五章 药物定量分析与分析方法验证,33,1.测定法,取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定AT经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法)AS未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法),第五章 药物定量分析与分析方法验证,2023/3/24,体内药物分析,34,2.限度要求,萃取回收率一般应50%高、中浓度的RSD应15%低浓度的RSD应20%。,第五章 药物定量分析与分析方法验证,35,常用分析方法的特点,返回 分析方法的选择,第五章 药物定量分析与分析方法验证,
