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1、第三部分遗传信息的传递,杨笑菡 讲师北京大学医学部生物化学与分子生物学系,遗传信息 DNA是遗传信息的主要携带者 遗传信息：DNA分子中碱基的排列顺序 四种核苷酸：A、G、C、T,基因：DNA分子中的功能片段,Genethe fundamental unit of information in living system is the gene.A gene is defined biochemicallyas a segment of DNA that encodes the information required to produce a functional biological pr
2、oducts.,遗传信息传递的中心法则,复制,转录,翻译,DNA RNA 蛋白质,Central Dogma of genetic information transfer,1957年由Crick提出，依据：DNA双螺旋结构的阐明；DNA聚合酶与RNA聚合酶的发现,重大生物学意义：指出了基因的两个基本特性：自我复制和指导蛋白质合成。,DNA RNA 蛋白质,反转录,中心法则的补充,DNA复制,RNA复制,转录,翻译,DNA,DNA,DNA复制,转录,翻译,遗传信息,遗传信息,遗传信息,反转录,遗传信息,RNA复制,遗传信息,DNA,mRNA,mRNA,蛋白质,RNA,DNA,RNA,RNA,第
3、十二章 DNA生物合成 CHAPTER 12 DNA BIOSYNTHESIS,第一节 DNA的复制Section 1 DNA REPLICATION,DNA复制(DNA replication)在细胞分裂过程中,以亲代DNA为模板合成子代DNA分子的过程,一 DNA复制的特征 Features of DNA Replication,二 复制的过程 Process of DNA Replication,（一）DNA螺旋的构象变化和解链（二）原核生物DNA的复制（三）真核生物DNA的复制,（一）DNA的半保留复制（二）DNA复制的起始点和方向（三）DNA的半不连续复制,一 DNA复制的特征 Fe
4、atures of DNA Replication,(一)DNA的半保留复制？semi-conservative replication,It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.Watson&Crick 1953,Watson JD,Crick FHC(1953)Genetical implications of the structur
5、e of deoxyribonucleic acid.Nature 171:964-967.,11,亲代DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,+,Genetic information is stored in DNA;The base-pairing principle is the basis of correctly transferring the information;DNA(RNA)can be templates for replication.,Matthew Meselson馬修梅瑟生Franklin Stahl富蘭克林史達 mju:,Semi-conservativ
6、e DNA replication,Meselson M and Stahl FW(1958).The replication of DNA in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 44:67182.,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式复制 半保留式复制 混合式复制,Dispersive replication,semi-conservative replication,conservative replication,严谨可行的实验设计,亲代DNA要与子代DNA有所不同（15N,14N,自然界中99%是14N）要有检测这种不同的手段（氯
7、化铯密度梯度离心）3.合适的实验对象（噬菌体，大肠杆菌）,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,第一代,进一步验证了半保留复制的设想,变性前,变性后,Meselson M and Stahl FW(1958).The replication of DNA in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 44:67182.,半保留复制的意义,子代DNA保留了亲代DNA的全部遗传信息，体现了遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础 遗传的保守性并不是绝对的（突变与序列重排导致了物种的进化）,（二）DNA复制的起始点和方向
8、,1.复制的起始点(origin of replication),（1）原核生物通常只有一个ori,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,(2)真核生物每个染色体有多个ori,复制子(replicon)是独立完成复制的功能单位,2.复制的方向（Direction of replication）,复制眼（replication eye）,双向复制Bidirectional replication,单向复制unidirectional replication,复制叉（replication fork）,Direction of movement o
9、f replication fork,(三)DNA的半不连续复制 semi-discontinuous replication,5,5,3,3,5,？,生物体内已知的DNA聚合酶只能利用引物分子提供的3-OH 末端聚合脱氧核苷酸(dNTP),所以新生单链DNA 分子的延伸方向只能是5 到 3,实验证据,5,3,3,3,Leading strand,5,5,1968年在美国的日本学者冈崎用噬菌体DNA为研究对象采用电子显微镜，放射自显影密度梯度离心等技术发现了复制过程中存在DNA小片段，随着复制的进行小片段变为大片段,DNA的半不连续复制？,DNA的半不连续复制！,Mechanism of DN
10、A chain growth.I.Possible discontinuity and unusual secondary structure of newly synthesized chains.Okazaki R,Okazaki T,Sakabe K,Sugimoto K,Sugino A.Proc Natl Acad Sci U S A.1968 Feb;59(2):598-605.,Mechanism of DNA chain growth,II.Accumulation of newly synthesized short chains in E.coli infected wit
11、h ligase-defective T4 phages.Sugimoto K,Okazaki T,Okazaki R.Proc Natl Acad Sci U S A.1968 Aug;60(4):1356-62.,在DNA复制过程中，一条链是连续合成的，而另一条链是不连续合成的,连续合成，方向与复制叉一致,不连续合成，方向与复制叉相反,原核细胞1000-2000bp真核细胞100-200 bp,二 复制的过程,Process of DNA Replication,DNA螺旋的构象变化和解链,双链DNA复制:,1.复制的引发（Priming）,2.DNA链的延长（Elongation）,3.
12、复制的终止（Termination）,（一）DNA螺旋的构象变化和解链,参与松弛螺旋、解链的酶和蛋白质主要包括：拓扑异构酶（topoisomerase,tpsmrez Topo）解链酶（DNA helicase helkez）DNA单链结合蛋白（single strand binding protein,SSB）,1.拓扑异构酶（Topoisomerase,Topo）,A B C,DNA分子拓扑异构体,解链前方形成正超螺旋,定义：能催化DNA拓扑异构体互变的一类酶称为拓扑异构酶,拓扑异构酶,分类：拓扑异构酶拓扑异构酶,功能：拓扑异构酶既能水解、又能连接磷酸二酯键,Cut and pass st
13、rand through gap,Reseal gap,Separate strands length-wise,Two turns,拓扑异构酶(又称旋转酶 gyrasedares),拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链使DNA超螺旋松弛反应不需ATP,拓扑异构酶,切断环状DNA分子两股链使DNA超螺旋松弛；也可利用ATP稳定负超螺旋环连和解环连;打结和解结,作用机制,2.DNA解链酶（DNA helicase）,功能：利用ATP作用于氢键，解开DNA双链,特点：解链沿复制叉行进方向,种类：E.coli解链酶、E.coli Rep蛋白,Electron microscopy images of
14、hexameric helicases（六聚体解旋酶）,Patel SS,Picha KM.Structure and function of hexameric helicases.Annu Rev Biochem.2000;69:651-97.,各种原核和真核生物体内的DNA解链酶（helicases）,3.单链结合蛋白（single strand binding protein,SSB）又称DNA结合蛋白（DNA binding protein，DBP）,功能：在复制中维持模板处于单链状态 保护复制新生单链的完整性,（二）原核生物DNA的复制,引发：,形成引发体，合成RNA引物,DNA链
15、的延长：,DNA复制的终止：,DNA聚合酶 DNA连接酶,终止区结构,原核生物DNA的复制从固定的复制起始点 ori C 开始,1.引发,引发体形成过程:,理顺,DNA,链,拓扑异构酶,(,gyrA,B),稳定已解开的单链,单链,DNA,结合蛋白,SSB,催化,RNA,引物生成,引物酶,DnaG,(,dnaG,),运送和协同,DnaB,DnaC,(,dnaC,),解开,DNA,双链,解螺旋酶,DnaB,(,dnaB,),辨认起始点,DnaA,(,dnaA,),蛋白质（基因）,通用名,功能,原核生物复制起始的相关蛋白质,参与DNA链延长的物质,DNA聚合酶(polymerase):依赖DNA的D
16、NA聚合酶底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子:如DNA连接酶,2.DNA链的延长,DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应,特点：,不能从头合成，DNA 新链生成需引物和模板,新链的延长只可沿5 3方向进行,DNA聚合酶种类,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,原核生物,真核生物
17、,DNA聚合酶 I,第一个被发现，目前研究的最清楚的DNA聚合酶,1.53 的聚合活性,作用1：形成3,5-磷酸二酯键，使DNA链沿53方向延伸,2.35 外切酶活性,?,A,C,作用3：去除RNA引物及修正错误碱基 在DNA损伤修复中起作用,3.53 外切酶活性,1969年Delucia 和Cairns分离出DNA pol I大肠杆菌突变株，其DNA pol I的活性仅为正常大肠杆菌的1%，这株突变菌的生长速度与正常菌无明显差别，但是在紫外线照射后，突变菌极易死亡。因此推测突变菌的DNA复制功能正常，但是DNA损伤后的修复机制缺失。这就意味着DNA pol I在DNA复制中不起主要作用。这样
18、的发现随后导致了DNA聚合酶II和III的发现。,DNA聚合酶 I负责原核生物复制的延长？,功能：,DNA-pol（109kD）,对复制中的错误进行校读 切除引物、填补冈崎片段间空缺DNA损伤修复,323aa,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604aa,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究的常用工具酶,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 它参与DNA损伤的应急状态修复,功能:是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶（DNA-pol III 缺
19、失的细菌是不能生长的）,DNA-pol(250kD),:5 3聚合酶活性:35外切酶活性：装配必需,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA-pol,沿模板连续移动,可加入5000个以上核苷酸(150bp/秒),DNA pol 以不对称二聚体形式协同催化前导链和随从链的合成,Pol I Pol II Pol III酶活性 5 3聚合作用+3 5外切酶活性+5 3外切酶活性+-构成（亚基数）单体 单体 多亚基分子大小（x 103）109 90 900体外链延长速度（核苷酸/分）600 30 9000分子数/细胞 400 10-20功能
20、修复合成 切除引物 不详 复制 填补空缺,原核生物DNA聚合酶,DNA连接酶（DNA Ligase）,能催化相邻DNA片段的3OH与5P形成磷酸二酯键,作用方式,First nick:DNA pol 填补Second nick：Ligase 接合,随从链：,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用在DNA修复最后起缝合缺口作用是基因工程的重组及剪接中重要工具酶之一,DNA连接酶的功能,DNA replication and recombinationBruce AlbertsNature 421,431-435(23 January 2003),3.DNA复制的终止,原核生物基因是环状DNA，
21、双向复制的复制片段在复制的终止区(ter)处汇合,E.Coli 基因图,环状DNA终止区（termination region,ter）,Ter序列中都含有一个共有序列：GTGTGGTGT,Tus蛋白识别并结合Ter共有序列，具有反解旋酶活性，抑制复制叉前进,(Terminator utilization substance),（三）真核生物染色体DNA的复制,真核生物DNA结构特点 DNA分子大，108bp DNA与组蛋白结合，以核小体形式存在真核生物DNA复制过程特点 1.DNA复制与细胞周期 2.复制的起始 3.复制的延长：DNA聚合酶 4.复制终止：末端复制与端粒酶,DNA合成期,1.
22、真核生物DNA复制与细胞周期,DNA复制只发生在S期每个细胞周期只进行一次DNA复制,特点：,细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,2.复制的起始,3.复制的延长,真核生物DNA聚合酶,填补引物,空隙，切,除修复，,重组,延长子,链的主,要酶，,解螺旋,酶活性,线粒体,DNA,复,制,低保,真度,的复,制,起始引,发，引,物酶活,性,+,+,+,-,-,3,5,核酸外切,酶活性,高,高,高,？,中,5,3,聚合活性,25.5,12.5,14.0,4.0,16.5,分子量（,kD,）,DNA,-,pol,填补引物,空隙，切,除修复，,重组,延长
23、子,链的主,要酶，,解螺旋,酶活性,线粒体,DNA,复,制,低保,真度,的复,制,起始引,发，引,物酶活,性,功能,+,+,+,-,-,3,5,核酸外切,酶活性,高,高,高,？,中,5,3,聚合活性,25.5,12.5,14.0,4.0,16.5,分子量（,kD,）,DNA,-,pol,真核染色体DNA呈线状，复制在末端停止 DNA子链末端RNA引物去除后留下的空隙由端粒酶(telomerase)参与填补复制,4.复制的终止,线性DNA末端复制,端粒的发现史,1938年，美国遗传学家Hermann Joseph Muller观察到果蝇染色体末端有保护结构，命名为terminal gene，后改
24、为telomere。1978年，测序技术大大加快了对端粒的认识，在四膜虫中发现端粒结构，重复的TTGGGG1982年，Blackburn实验室的研究生Carol W.Greider在四膜虫裂解液中发现端粒酶活性,功能,人的端粒重复序列是5-TTAGGG-3,防止染色体DNA降解、末端融合、非正常重组，从而保证了染色体的完整性和稳定性，使真正的遗传信息得到完整复制,组成：RNA+蛋白质作用：作为反转录酶，以RNA作模板，合成端粒DNA片段作用机制：爬行模型,端粒酶（Telomerase）,(1)TG strand synthesis,(2)AC strand synthesis,原核 真核复制速
25、度 快 慢起始点 少 多引物 几十 10个冈琦片段 10002000 nt 100200 nt主要复制酶 Pol III Pol,真核与原核生物DNA复制的比较,第二节 反转录作用Section 2 REVERSE TRANSCRIPTION,反转录作用（reverse transcription）又称为反向转录、逆转录以RNA为模板，利用4种dNTP为原料，在引物的3端以53方向合成与RNA互补的DNA链的过程,79,The observation of reverse transcriptionThe discovery of reverse transcriptase,80,The di
26、scovery of RSV(Rous Sarcoma Virus)(Published on J.Exp.Med.in 1911)RSV is RNA virusTemins observation:the blockage of RSV propagation by DNA synthesis inhibitors;Proposed“provirus”(1963).The isolation of reverse transcriptase,1970(by Temin and Baltimore,independently),81,Peyton Rous 1966 Nobel prize
27、winnerfor his discovery of tumour inducing viruses,82,RNA templateRNA-DNA hybridDNA templateDNA-DNA hybrid,RNA指导的DNA合成（Reverse transcriptase）需引物提供3-OH，Zn2，方向5 3 RNA水解（RNase H）DNA指导的DNA合成（DNA polymerase）5末端位点切割RNA（nulease）整合作用（integrase）特点：无外切酶活性，转录错误率高（2X104）,反转录酶的功能：,补充了中心法则，说明RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能加深了
28、对RNA病毒致癌、致病的认识利用反转录酶，进行基因操作，制备 cDNA,反转录作用的研究意义,反转录病毒（Retroviruses）,人类免疫缺陷病毒（human immuno-deficiency virus,HIV）,可引起艾滋病（获得性免疫缺陷综合症）（acquired immuno-deficiency syndrome,AIDS）HIV基因结构临床治疗艾滋病的药物 AZT(3-叠氮-2,3-双脱氧胸苷),89,治疗原理（鸡尾酒疗法）,阻止逆转录DNA阻止病毒蛋白原切割,第三节 DNA的损伤及修复Section 3 DNA DAMAGE AND REPAIR,在内外环境因素作用下，或生
29、物体DNA复制功能异常均可引起DNA损伤(DNA damage)。损伤如不能正确修复，即可发生突变,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变(mutation),（一）突变的意义,突变是进化、分化的分子基础突变导致基因型改变突变导致死亡突变是某些疾病的发病基础,一 DNA损伤、突变的意义和类型（Significance and Type of DNA Damage and Mutation）,（二）突变的类型,点突变（point mutation）单个碱基的改变：如镰刀型红细胞贫血 转换（transition）和颠换（transversion）移码突变（frame shift mu
30、tation）插入（insertion）或缺失（deletion）嘧啶二聚体的形成（pyrimidine dimer）,点突变 point mutation,缺失 框移突变,G C A G U A C A U G U C 丙 缬 组 缬 CG A G U A C A U G U C.谷 酪 蛋 丝,Deletion frame shift mutaion,二 DNA损伤、突变的引发因素Factors Involved in DNA Damage and Mutation,（一）DNA的自发性损伤 DNA复制错误：碱基错配（mismatch）DNA的修复合成障碍 碱基的自发突变：脱氨基或碱基丢失
31、 正常代谢产物对DNA的损伤：DNA链断裂（二）环境造成的DNA损伤 物理因素:紫外线、电离辐射 化学因素：各种诱变剂,物理因素 如 紫外线(ultra violet,UV),常见的化学诱变剂,化合物类别,作,用,点,分子改变,碱基类似物,如：,5,-,BU,A,5,-,BU,G,-,A,-,-,T,-,-,G,-,-,C,-,羟胺类（,NH,2,OH,）,T,C,-,T,-,-,A,-,-,C,-,-,G,-,亚硝酸盐（,NO,2,）,C,U,-,G,-,-,C,-,-,A,-,-,T,-,烷化剂,如：氮芥类，,Nitromins,G,m,G,G,m,G,DNA,缺失,G,三 DNA损伤修复
32、 DNA Damage Repair,修复(repairing)：是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态,光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型,（一）光修复 Light repairing,（二）切除修复 Excision repairing,是细胞内最重要和有效的修复机制,种类 碱基切除修复（base excision repair,BER）核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）,碱基切除修复（BER）
33、,糖基化酶起始的切除修复机制,UvrABC介导的切除修复机制,核苷酸切除修复（NER）,（三）重组修复 recombination repairing,子链,模板链,子链,模板链,损伤DNA片段,关键酶：RecA基因编码的RecA蛋白,（四）SOS修复,DNA损伤后，应急诱导产生的一系列复杂 的修复反应，称SOS修复 修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差,四 DNA损伤、修复与人类疾病 DNA Damage,Repair and Human Diseases,DNA 损伤修复机制的缺陷与衰老、肿瘤发生密切相关 着色性干皮病（xeroderma pigmentosum,XP）对UV造成的皮肤损伤无法修复,107,简述中心法则内容简述参与DNA复制的酶和蛋白质因子，以及其在复制中的作用。比较真核和原核生物DNA复制异同点。何为逆转录？讨论RNA病毒致癌的分子过程。,思考题,摘自生物情诗（网络）思念是基因般多彩的书卷，寂寞犹如病毒一样蔓延。我把爱写进核酸探针，深埋在你的复制起点。就算紫外源在我们身边出现，世间的一切都发生着基因突变，我们的心依然像肽键一样紧紧相连。而现在的你却为什么不在我身边？纵然我的心碎成了冈崎片段，也不能改变我对你的爱恋。,谢 谢！,
