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1、第三章核酸化学,Nucleic Acid chemistry,核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,核酸是遗传物质的载体,一、核酸的研究发现史1868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质，即现在被称为核酸的物质。,1944年，Avery的转换转化实验,or,and,可分离,1952年，Hexshey、Chase T2噬菌体（捣碎器实验）1953年，Watson、Crick DNA双螺旋模型核酶（Ribozyme）人类基因组计划,98核中（染色体中）真核 线粒体（mDNA）核外
2、 叶绿体（ctDNA）DNA 拟核 原核 核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒,二、核酸的种类和分布,核酸分为两大类：脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid（DNA）核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）,RNA主要存在于细胞质中,tRNA rRNA mRNA 其它 snRNA 反义RNA RNA病毒：SARS,核酸的基本化学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,元素组成：C H O N P,核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸
3、部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,二、碱基,1.嘌呤（Purine）,2.嘧啶（Pyrimidine）,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,三、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,假尿苷（）次黄苷（肌苷）I黄嘌呤核苷 X二氢尿嘧啶核苷 D取代核苷的表示方式7-甲基鸟苷 m5G,Adenosine Guanosine Cytidine Ur
4、idine,四、核苷酸（nucleotide）核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,五、核苷酸衍生物,1.继续磷酸化,2.环化磷酸化,cAMP,cGMP,3.肌苷酸及鸟苷酸(强力味精),4.辅酶 NAD、NADP、FMN,IMP GMP,六、多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PA
5、PCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,DNA的结构,一、DNA的一级结构脱氧核糖核酸的排列顺序可以用碱基排列顺序表示连接键：3，5-磷酸二酯键磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架碱基形成侧链多核苷酸链均有5-末端和3-末端 DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,2.基因与基因组,基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。,基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。包括：核基因
6、组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体DNA）,各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小,3.原核生物基因组特点 重复序列少，多位编码区 多为操纵子形式组织 有重叠基因存在,真核生物基因组特点 以染色体存在 重复序列多,基因组计划人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）酵母基因组计划（YGP）大肠杆菌（E.Coli）,二、DNA的二级结构 DNA的双螺旋模型,1953年，J.Watson和F.Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。在DNA分子中，嘌呤碱基的
7、总数与嘧啶碱基的总数相等。,DNA双螺旋模型要点,B型结构 两条链反向平行，右手螺旋 碱基在内（AT，GC）碱基平面垂直于螺旋轴 戊糖在外，双螺旋每转一周 为10碱基对（bp）A型结构 碱基平面倾斜20，螺旋变粗变短，螺距23nm。Z型结构 左手螺旋，只有小沟,双螺旋DNA的结构参数P187,双螺旋稳定的力 氢键 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）离子键等 则DNA变性剂（热、pH、脲/酰胺、有机溶剂）,DNA的三级结构,DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构，超螺旋 原核 双链环状DNA（dcDNA）病毒 单链环状DNA（scDNA）单链线性DNA（ssDNA）,DNA的三级结构-超螺旋,超
8、螺旋是指双螺旋进一步扭曲或再螺旋的构象正超螺旋（变紧）和负超螺旋（变松）人类46条染色体的DNA总长可达1.7m，经过螺旋化压缩，实际总长只有200nm如线粒体DNA、细菌质粒DNA、病毒DNA,DNA的存在形式-核小体,真核生物中DNA双螺旋沿着组蛋白八聚体核心的短轴绕1.75圈，形成左手超螺旋，称核小体。染色质的基本结构单位是核小体。串珠状结构进一步卷曲形成螺线管，后者再进一步卷曲形成超螺旋管，形成染色单体。,组蛋白八聚体,核小体,H1组蛋白,RNA的结构特点,碱基组成 A、G、C、U（AU/GC）稀有碱基较多，稳定性较差，易水解多为单链结构，少数局部形成螺旋分子较小分类mRNAtRNA
9、rRNA,tRNA:P198,占RNA总量的15一种氨基酸对应最少一种RNA,分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3-末端都具有CpCpAOH的结构。,tRNA的三级结构,tRNA的三级结构-倒L型,指tRNA的三叶草型结构进一步扭曲折叠形成一种形状象倒L型字母的三维结构。,第三节 核酸的性质及研究技术,0.14摩尔法：P200,二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性
10、、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光,三、核酸的变性、复性与分子杂交,1.变性稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素 pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度 加热,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定T
11、m值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,2.热变性和Tm,3.核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度Tm25复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度,4.分子杂交,DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂
12、交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southern 杂交（Southern bolting）P204Northern 杂交（Northern bolting）Western 杂交（Western bolting）,四、核酸的含量与纯度测定P202,定磷、定糖2.凝胶电脉,五、核酸的序列测定,双脱氧链终止法（Sanger酶法）2.Gilbert化学降解法,第四节 核酸的降解与核苷酸代谢,核苷酸(nucleotide)是构成核酸(nucleic acid)的基本单位，人体所需的核苷酸都是由机体自身合成的。食物中的核酸或核苷酸类物质基本上不能被人体所利用。在核酸类物质
13、的水解产物中，只有磷酸和戊糖可被吸收利用。,食物中核酸的消化,核苷酸起着重要的作用：P204,一、核酸的酶促降解：P2041.核酸酶2.酶降解产物,核酸的酶促降解：,A 核酸外切酶（exonulease）从核酸链的末端开始逐个顺次水解下核苷酸的酶称之。产物为单核苷酸。,B、核酸内切酶（endonuclease）,能够水解核酸分子内磷酸二酯键的酶称核酸内切酶。一般的核酸内切酶专一性不强（专一性强的不多），限制性内切酶具有很强的碱基专一性。,牛脾磷酸二脂酶：作用5/-端，产物3/-核苷酸蛇毒磷酸二脂酶：作用3/-端，产物5/-核苷酸,C、限制性内切酶（reestrietion endonuclea
14、se）,在原核生物体内一类能识别双链DNA上 特定的一段核苷酸序列并在特定的一段核苷酸序列并在特定位点切断DNA两条链的核酸内切酶。平头末端：切口齐的；粘性末端；切口交错。,1、限制性内切酶的酶切点：,酶 限制和修饰部位 来源产生平头末端 Hin d 5GTPyPuAC3 流感嗜血菌 3CAPuPyTG5 产生粘性末端 大肠杆菌EcoR 5GAATTG3 3GTTAAG5,二、核苷酸的分解代谢：P2051.核苷酸的分解2.核苷的分解,嘌呤和嘧啶的分解,嘌呤核苷酸的分解代谢,嘌呤核苷酸的分解首先是在核苷酸酶的催化下，脱去磷酸生成嘌呤核苷，然后再在核苷酶的催化下分解生成嘌呤碱，最后在黄嘌呤氧化酶的
15、作用下氧化生成尿酸(uric acid)，再经尿液排出体外。,尿酸是嘌呤核苷酸在人体内分解代谢的终产物。但在鸟类，尿酸则可继续分解产生尿囊素。正常人血浆中尿酸含量约为0.120.36mmol/L(26mg%)。尿酸水溶性较差，当血浆中尿酸含量超过8mg%时，即可形成尿酸盐晶体。,痛风症患者由于体内嘌呤核苷酸分解代谢异常，可致血中尿酸水平升高，以尿酸钠晶体沉积于软骨、关节、软组织及肾，临床上表现为皮下结节，关节疼痛等。临床上常用别嘌呤醇（allopurinol）治疗痛风症。,黄嘌呤氧化酶,黄嘌呤氧化酶,别嘌呤醇,痛风症的治疗机制,别嘌呤醇的分子结构与次黄嘌呤类似，可竞争性抑制黄嘌呤氧化酶的活性，
16、从而减少体内尿酸的生成。同时，别嘌呤与PRPP反应生成的别嘌呤核苷酸，可反馈抑制嘌呤核苷酸从头合成途径的关键酶。,嘧啶的分解,包括脱氨、还原、水解开环等反应，产物：CO2+NH3+丙氨酸 氨基异丁酸,核苷酸的合成代谢P208,嘌呤核苷酸的合成代谢,通过利用一些简单的前体物，如5-磷酸核糖，氨基酸，一碳单位及CO2等，逐步合成嘌呤核苷酸的过程称为从头合成途径(de novo synthesis)。这一途径主要见于肝，其次为小肠和胸腺。所有合成反应在胞液中进行。,（一）嘌呤核苷酸的从头合成：,嘌呤碱合成的元素来源,次黄苷酸的合成：首先在磷酸核糖焦磷酸合成酶的催化下，消耗ATP，由5-磷酸核糖合成P
17、RPP(1-焦磷酸-5-磷酸核糖)。PRPP再经过大约10步反应，合成第一个嘌呤核苷酸次黄苷酸（IMP）。,1从头合成途径：,次黄苷酸（IMP）的合成,腺苷酸及鸟苷酸的合成：IMP在腺苷酸代琥珀酸合成酶的催化下，由天冬氨酸提供氨基合成腺苷酸代琥珀酸（AMP-S），然后裂解产生腺苷酸（AMP）。IMP也可在IMP脱氢酶的催化下，以NAD+为受氢体，脱氢氧化为黄苷酸（XMP），后者再在鸟苷酸合成酶催化下，由谷氨酰胺提供氨基合成鸟苷酸（GMP）。,腺苷酸（AMP）与鸟苷酸（GMP）的合成P210,三磷酸嘌呤核苷的合成：,核糖核苷酸还原酶的作用机制,2.从头合成的调节：,PRPP合成酶,调节方式：反馈
18、调节和交叉调节,PRPP酰胺转移酶,腺苷酸代琥珀酸合成酶,IMP脱氢酶,GMP合成酶,从头合成的调节,+,+,GTP,又称再利用合成途径(salvage pathway)。指利用分解代谢产生的自由嘌呤碱合成嘌呤核苷酸的过程。这一途径可在大多数组织细胞中进行。,（二）嘌呤核苷酸的补救合成：,嘌呤核苷酸的补救合成过程,能够抑制嘌呤核苷酸合成的一些抗代谢药物，通常是属于嘌呤、氨基酸或叶酸的类似物，主要通过对代谢酶的竞争性抑制作用，来干扰或抑制嘌呤核苷酸的合成，因而具有抗肿瘤治疗作用。,（三）抗代谢药物对嘌呤核苷酸合成的抑制：,1.嘌呤类似物：临床上应用较多的嘌呤类似物包括6-巯基嘌呤（6-merca
19、ptopurine，6-MP）、6-巯基鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤等。6-MP的化学结构与次黄嘌呤类似，因而可以抑制IMP转变为AMP或GMP，从而干扰嘌呤核苷酸的合成。,6-巯基嘌呤的分子结构,次黄嘌呤(hypoxanthine,H),6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP),2.氨基酸类似物：临床上应用较多的氨基酸类似物包括氮杂丝氨酸（azaserine）和6-重氮-5-氧正亮氨酸（diazonorleucine）。这些氨基酸类似物的分子结构与谷氨酰胺类似，因而可干扰谷氨酰胺在嘌呤核苷酸合成中的作用，抑制嘌呤核苷酸的合成。,3.叶酸类似物：临床上应用较多的叶酸类似物包括氨蝶呤
20、（aminopterin）及甲氨蝶呤（methotrexate，MTX），这些叶酸类似物能竞争性抑制二氢叶酸还原酶，减少体内四氢叶酸的生成，使嘌呤核苷酸合成过程中所需一碳单位的供应受阻而抑制其合成。,嘧啶类核苷酸的从头合成,（1）嘧啶环上原子来源 嘧啶环的前体是氨甲酰磷酸和天冬氨酸,氨甲酰磷酸,天冬氨酸,下一页,上一页,章首,节首,（2）嘧啶核苷酸合成特点,合成场所：主要在肝细胞胞浆 其合成与嘌呤核苷酸的合成不同，先由氨甲酰磷酸与天冬氨酸形成嘧啶环，再与核糖磷酸（PRPP）结合形成 UMP，其关键的中间产物是乳清酸。胞苷酸则由尿苷酸在三磷酸的水平上转变而来。,下一页,上一页,章首,节首,下一页,上一页,章首,节首,上页 下页 章首 节首,（3）嘧啶核苷酸的合成与相互转变,下一页,上一页,章首,节首,嘧啶核苷酸合成的补救途径,尿苷激酶途径 尿苷+ATP 尿苷酸+ADP 胞苷+ATP 胞苷酸+ADP,胸苷激酶途径 T+1磷酸脱氧核糖 脱氧胸苷+Pi 脱氧胸苷酸（dTMP）,TK,磷酸化酶,胸苷激酶,下一页,上一页,章首,节首,脱氧核苷酸的合成P212,大多数脱氧核苷酸的合成是在NDP的基础上进行的但脱氧胸苷酸的合成是个例外,NDP,dNDP,下一页,上一页,章首,节首,
