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1、RNA的生物合成RNA的生物合成包括转录和RNA的复制。转录（transcription）：以一段DNA的遗传信息为模板，在RNA聚合酶作用下，合成出对应的RNA的过程(DNA指导的RNA合成）。转录产物：mRNA、rRNA、tRNA、小RNA除某些病毒基因组RNA外，绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。,转录研究的主要问题RNA聚合酶 转录过程 转录后加工 转录的调控是基本内容，是目前研究的焦点，转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。转录水平的调控是基因调控的核心。,转录,一、RNA聚合酶,1、E.coli RNA聚合酶（原核）E.coli和其它原核细胞只有一种RNA聚合酶，合成各
2、种RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。E.coli RNA聚合酶全酶（holoenzyme）分子量46万Da，由六个亚基组成，2，另有两个Zn2+。不同的细菌，、亚基分子量变化不大，亚基分子量变化较大，44KD92KD。亚基的功能：无亚基的酶叫核心酶，核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，而不具备起始合成活性，加入亚基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，亚基称为起始因子。核心酶在DNA上滑动，亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使聚合酶迅速找到启动子并与之结合，亚基本身无催化活性。不同的因子识别不同的启动子，从而表达不同的基因。不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但亚
3、基有所差别，这决定了原核基因表达的选择性。,E.coli RNA聚合酶各亚基的大小与功能：,一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，在任一时刻，大部分聚合酶（5000左右）正在参与RNA的合成，具体数量依生长条件而定。,RNA聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。P360 图20-1RNA聚合酶的活性中心,核心酶覆盖60bp的DNA区域，其中解链部分17bp左右，RNA-DNA杂合链约12bp。,纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链DNA，但在体内，DNA的两条链中只有一条可用于转录，这可能是由
4、于RNA聚合酶在分离时丢失了亚基引起的。解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化，活体状况中，可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。37时，RNA聚合酶的聚合速度可达40100个核苷酸/秒,2、真核生物RNA聚合酶三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右，亚基数分别为6-15。线粒体和叶绿体RNA聚合酶，它们的结构简单，能转录所有种类的RNA，类似于细菌RNA聚合酶。,动物、植物、昆虫等不同来源的细胞，R
5、NApol 对-鹅膏蕈碱不敏感，RNApol对-鹅膏蕈碱最敏感，可被低浓度的-鹅膏蕈碱抑制，RNApol受高浓度的-鹅膏蕈碱抑制，而酵母、昆虫的RNApol不受抑制。,3、噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶仅为一条分子量11KD的多肽链，这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子，并无选择地与其作用，37时的聚合速度200nt/秒。,二、RNA聚合酶催化的转录过程P219,RNA转录过程,下一页,上一页,RNA转录由起始、延伸、终止三个阶段组成 起始：RNA聚合酶在亚基的引导下结合于启动子；DNA双链局部解开；在模板链上通过碱基配对合成最初RNA链 延伸：核心酶沿着DNA链由3 5 的方向移
6、动，转录区间的DNA双链解螺旋，而转录完的区间DNA又恢复双螺旋结构 终止：核心酶到达终止子，RNA与核心酶从DNA上脱落,章首,节首,1、起始RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部位（启动子区），局部解开双螺旋，第一个核苷酸掺入转录起始位点，从此开始RNA链的延伸。在新合成的RNA链的5末端，通常为pppG或pppA，即合成的第一个底物是GTP或ATP。起始过程中，因子起关键作用，它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合，亚基与结合时，亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合，。正链（有意义链）：与mRNA序列相同的DNA链。负链（反意义链）：模板链。转录起点是+1，上游是-1。转录的起点核苷酸为
7、+1，起点右边为下游（转录区），用正数表示，起点左侧为上游，用负数表示：-1，-2，-3。,下一页,上一页,RNA转录起始,章首,节首,2、延伸转录起始后，亚基释放，离开核心酶，使核心酶的亚基构象变化，与DNA模板亲和力下降，在DNA上移动速度加快，使RNA链不断延长。转录起始后，亚基便从全酶中解离出来，然后nusA亚基结合到核心酶上，由nusA亚基识别序列序列。,RNA转录的延伸,上一页,下一页,节首,3.RNA转录的终止,上一页,下一页,转录终止信号有两种：弱终止子：依赖因子的终止，NusA蛋白识别DNA链上的终止信号，在因子帮助终止。强终止子：（1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区
8、域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U连续6个）。,节首,RNA合成的基本特征底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）RNA链生长方向：53不需引物需DNA模板转录的起始由DNA上的启动子区控制，转录的终止由DNA上的终止子控制，转录是通过DNA指导的RNA聚合酶来实现的。RNA链的转录，起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因（真核），也可以是多个基因（原核）。基因的转录是有选择性的，细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变，将转录不同的基因。,转录与DNA复制的异同：相同
9、：要有模板，新链延伸方向53，碱基的加入严格遵循碱基配对原则。相异：复制需要引物，转录不需引物。转录时，模板DNA的信息全保留，复制时模板信息是半保留。转录时，RNA聚合酶只有53聚合作用，无53及35外切活性。,RNA的复制有些RNA病毒，进入寄主细胞后，借助复制酶而进行RNA病毒的复制。RNA病毒的RNA复制酶具有很强的模板特异性，只识别病毒自身的RNA，它以病毒RNA为模板，合成与模板性质相同的RNA。,一、噬菌体QRNA的复制噬菌体Q：直径20nm，正十二面体，含30%RNA，其余为蛋白质，单链RNA，4500个核苷酸，编码3-4个蛋白质。基因组结构：5端成熟蛋白（A或A2蛋白）基因外
10、壳蛋白（或A1蛋白）基因复制酶亚基基因3端Q复制酶：四个亚基，只有是自己编码，其余三个亚基来自寄主细胞。,噬菌体QRNA的复制过程：进入E.coli细胞后，其RNA即作为mRNA，首先直接合成与病毒繁殖有关的蛋白质（包括复制酶亚基）。然后在Q特异的复制酶合成并装备好后开始病毒RNA的复制。,二、病毒RNA复制的主要方式1、正链RNA病毒（mRNA）：噬菌体Q、灰质炎病毒等。进入寄主细胞后，利用寄主的翻译系统，首先合成复制酶及有关的蛋白质，然后进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA和蛋白质装配成病毒颗粒。2、负链RNA病毒（带有复制酶）：狂犬病毒等此类病毒带有复制酶，侵入后，复制酶首先合成出正链
11、RNA（mRNA），再以正链RNA为模板，合成负链RNA及蛋白质，然后装配。,3、双链RNA病毒（带有复制酶）：呼肠孤病毒等以双链RNA为模板，在复制酶作用下先转录正链RNA（mRNA），从而翻译出蛋白质，然后合成负链RNA，形成双链RNA，再包装。4、反转录病毒（含反转录酶）：白血病病毒、肉瘤病毒等致癌RNA病毒正链RNA病毒，它们的复制需要经过DNA前病毒阶段。,不同RNA病毒合成mRNA的途径可以分4类：,RNA合成不同于DNA合成之处主要有：,1.RNA聚合酶不需要引物。2.RNA聚合酶没有核酸酶的活性，在RNA合成过程 不起校对作用。3转录是不对称的，即仅用DNA双链中某一条链作 为
12、模板进行转录。有时是这条链的某区段，有时是 另一条链的某区域具有模板作用。通常将模板链称 为有意义链，将其互补链称为反意义链或编码链。4转录后DNA模板成分无改变。5.对于一个基因组来讲，转录只发生在一部分基因，而且每一个基因的转录都受到相对独立的控制。,基因转录的方式P222,对称转录不对称转录反向转录,转录产物的加工修饰P222,几乎所有真核生物RNA转录的初级产物都需经过一系列变化后才能生成具有生物活性的RNA分子。这一系列变化过程称为转录后的RNA加工(RNA processing)。加工过程包括核苷酸部分水解、连接反应、末端核苷酸“戴帽”、“接尾”，以及核苷的修饰。,下一页,上一页,
13、原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。,章首,节首,（1）信使RNA的加工,真核生物mRNA的前体是核不均一RNA（heterogenous nuclear RNA,hnRNA），其核苷酸顺序中约有5075%不出现在成熟的mRNA中。此部分在转录产物的加工过程中被切除。被切除的部分称为内含子（intron）。内含子是不编码蛋白质的核苷酸序列。未被切除的部分称外显子(exon)，是编码蛋白质的部分。,图13-7 mRNA的剪接机制 一些小核核蛋白（snRNP）与RNA前体形成剪接体（spliceosome）。U1 RNA和U2 RNA 分别为snRNP的组份。
14、U1 RNA的核苷酸序列与 mRNA前体内含子中的GU顺序（称连接供体位点）相配对。U2 RNA识别内含子3端连接受体位点。拼接体利用ATP做能量，除去内含子。,图13-8 mRNA 5帽端的结构5端第一个核苷酸是7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸,第二个和第三个核苷酸的核糖2羟基甲基化。,mRNA加工:5端帽子结构,图13-9 mRNA的加工过程示意图,（2）.rRNA的加工P223,rRNA前体的加工,下一页,上一页,加工过程：1、剪切作用：需核酸酶参与。2、甲基化修饰：修饰在碱基上。3、自我剪接：一种核酶的作用。,章首,节首,真核rRNA前体的加工真核生物核糖体的小亚基含：16-18S rRNA，
15、大亚基含：26-28S r RNA、5S rRNA、5.8S rRNA（特有）。真核rRNA基因拷贝数较多，几十至几千个之间。真核rRNA基因也成簇排列在一起，18S、5.8S、28S rRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。5SrRNA基因也成簇排列，间隔区不被转录，由RNA聚合酶III转录后经适当加工。哺乳动物：45SrRNA前体，含18S、5.8S、28S rRNA 果蝇：38SrRNA前体，含18S、5.8S、28S rRNA 酵母：37SrRNA 前体，17S、5.8S、26S rRNArRNA在成熟过程中可被甲基化，位点主要在核
16、糖2-OH上。真核rRNA甲基化程度比原核的高，约1-2%的核苷酸被甲基化。真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所，大、小亚基分别组装后，通过核孔转移到胞质中参与核糖体循环。,（3）.tRNA的加工P223,真核tRNA前体的加工真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。例如，E.coli有60个tRNA基因，啤酒酵母250个，果蝇850个，爪蟾1150个，人1300个。真核tRNA基因也成簇排列，被间隔区分开，tRNA基因由RNA聚合酶转录。真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似。,转录,图13-12 tRNA的加工示意图tRNA的初级转录物被RNase P 和3外
17、切核酸酶切除部分核苷酸。CCA末端是由tRNA核苷酸转移酶催化加入的。内含子被内切酶除去后，经连接酶连接为成熟的tRNA。,tRNA的加工,RNA生物合成的抑制剂某些核酸代谢的拮抗物和抗生素可抑制核苷酸或核酸的合成，因而可以用于抗病毒或抗肿瘤药物，也可以用于核酸的研究一、嘌呤和嘧啶类似物抑制核苷酸的合成，还能掺入核酸分子中去，形成异常DNA、RNA，影响核酸功能。主要有：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6二氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶碱基类似物进入体内后需转变成相应的核苷酸，才表现出抑制作用。,二、DNA模板功能的抑制剂此类化合物能与DNA结合，使DNA失去模板功能，从而抑制
18、其复制与转录。1、烷化剂氮芥（二（氯乙基）胺的衍生物）、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺类。它们带有活性烷基，使DNA烷基化。烷化位点：鸟嘌呤N7，腺嘌呤N1、N3、N7，胞嘧啶N1烷基化后，碱基易被水解下来，留下的空隙可干扰DNA复制或引起错误碱基掺入。带有双功能基团的烷化剂，可同时与DNA两条链结合，使双链DNA交联，从而失去模板功能。环磷酰胺：肿瘤细胞中磷酰胺酶活化，生成活性氮芥。苯丁酸氮芥：癌细胞酵解作用强，乳酸多，pH低，苯丁酸氮芥易进入。,2、放线菌素D（对真核、原核细胞都起作用）有抗菌和抗癌作用。它可与DNA形成非共价复合物，使其多肽部分在DNA的“浅沟”上如同阻遏蛋白一样，抑制DNA的转录和复制。此类机理的放线菌素还有色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素。3、嵌入染料扁平芳香族染料，可插入双链DNA相邻碱基对之间。溴化乙锭插入后，使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸，从而导致移码突变，并能抑制RNA链的起始及质粒的复制。此外还有原黄素、吖啶黄、吖啶橙等。,三、RNA聚合酶的抑制物1、利福霉素包括其衍生物利福平，特异地抑制细菌RNA聚合酶的活性。强烈抑制革兰氏阳性菌和结核杆菌，它主要抑制RNA合成的起始。2、利链菌素与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中链的延长。3、-鹅膏蕈碱主要抑制真核RNA聚合酶和，对细菌的RNA聚合酶作用极小。,
