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1、第六章 第四节生物化学方法及其 在中医研究中的应用,作者和所在科室介绍。引言部分比较全面完整地介绍了生化的发展历程，及其灿烂的里程碑。仔细阅读，有利于我们更好地理解这门学科，及其技术。生物化学是运用化学理论和技术来研究组成生物体的基本成分及其在生物体内所进行的化学变化规律的一门学科，从而揭示生命现象的化学本质。,生物化学的发展可以分为静态生化、动态生化和功能生化三个阶段，这三个阶段并不是截然分开的，它反映了人们对生命活动认识的深入过程。静态生化，主要指以分离、制备、纯化和检测某物质。动态生化，主要指活体内的化学反应，及其动态平衡。功能生化，主要指研究某化学物质分子结构与功能的关系（P169）。
2、从发扬中医学角度来说，掌握生物化学理论和技术，不仅能更深刻理解人体的生长、发育、壮盛、衰老等问题，而且从蛋白质、核酸的分子结构变化来探讨疾病的诊断、治疗和预防，无疑会起到如虎添翼的作用。,一、生物化学的主要方法生物化学技术是研究生物内物质的化学组成、结构、功能以及在生命过程中化学物质代谢变化规律，调节控制等的实验方法。常用的生物化学技术主要有物质的分离、提纯法，离心法，层析法，电泳法，光谱法以及分子杂交技术等。,（一）生物大分子物质的分离和提纯生物大分子主要指蛋白质、核酸、糖类和脂类等物质。制备高度纯化的生物大分子是研究大分子结构与功能的前提，整个分离提纯过程可分为以下几个阶段：1）材料选择。
3、2）细胞破碎。3）亚细胞器的分离。4）提取。5）分离纯化。6）浓缩、干燥及保存。1材料选择。原则：选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、成本低廉的目的材料或组织。（这是指分离、纯化、制备某种物质而言的，具体中医药实验有具体要求）,2细胞破碎。常用的技术有：匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波破碎、自溶、酶消化、表面活性剂处理法等。,不同型号的超声波破碎仪,3亚细胞器的分离。一般采用不同密度梯度介质，经差速离心法制备。4提取。提取过程，首先要使生物大分子与其他物质分离开来，使大分子物质充分释放出来，在此过程中，特别要考虑溶剂性质、pH值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的
4、因素，然后可结合经验并根据具体实验条件灵活地选取某一试剂进行提取。5分离纯化。刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀、等电点沉淀、盐析、层析、电泳、超离心、吸附、结晶等方法。以下会详细介绍。,左图 真空冷凝干燥仪右图 超低温冰箱,6浓缩、干燥及保存。,（二）离心技术离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒（指悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等）发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。离心机转子高速旋转
5、时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。常用的离心机分类：“低速离心机”最高转速不超过6000rpm.“高速离心机”在25000rpm以下.“超速离心机”达30000rpm以上。,冷冻离心机构造图,左上：普通台式离心机。左下：冷冻台式离心机。右：超速离心机。,左图：不同离心机的不同转头右图：超速离心机的不同转头,离心方法主要有三大类型：差速离心、密度梯度离心、沉降平衡离心。1差速离心法。通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。2密度梯度离心法。离心前，离心管内先装入
6、分离介质（如蔗糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，具体又可分为：（1）速度区带离心法。离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。,（2）预制梯度等密度离心法。要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，
7、如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。（3）自成梯度等密度离心法。某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离。,3沉降平衡离心法。根据被分离物质的浮力密度差别进行分离，所用的介质起始
8、密度约等于被分离物质的密度，介质在离心过程中形成密度梯度，被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。,（三）层析技术层析法又称色谱法，是目前广泛应用的一类分离分析技术。层析法利用混合物各组分理化性质上的差异，例如吸附力、溶解度、分配系数、带电性、分子大小、亲和力等，使各组分以不同程度分布在二个相中，其中一个为固定相，另一个为流动相，当混合物随流动相通过固定相时，由于各组分受固定相的阻力和流动相的推力不同，而使各组分移动速度各异，以达到分离的目的。,1根据分离的原理划分（1）吸附层析。是利用混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，因吸附剂对各组分的吸附能力的不同，而使各组
9、分流动速度不同，将各组分分离。吸附层析根据支持物装填方式的不同有柱层析和薄层层析类，前者常用于分离非极性或极性较小的有机物，后者用于分离氨基酸、类固醇激素等。（2）分配层析。利用混合物随流动相（非极性溶剂）通过含极性溶剂的载体组成的固定相时，由于各组分在二相中的分配系数的不同，而使混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开。分配层析应用最广泛的是纸层析。,（3）离子交换层析。离子交换层析是利用离子交换剂作为固定相，离子交换剂是一类具有酸性或碱性基团，能与溶液中的阳离子或阴离子发生交换的不溶性物质，流动相通常是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。将混合溶液加入离子交换柱，由于离子交换
10、剂对混合液中各种离子具有不同的亲和力而产生不同的吸附作用，当流动相流经离子交换柱时，可以降低离子交换剂对吸附离子的亲和力而被交换洗脱下来，从而达到分离的目的。（4）凝胶层析。以多孔性网状结构的凝胶（葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶等）为固定相装柱，将分子量大小不同的混合组分加入柱，用一种洗脱液作为流动相进行洗脱。小分子物质易进入凝胶颗粒内部使流程延长，大分子物质不能进入凝胶颗粒内而被排阻在外，流程较短，经过一定洗脱时间后，可将混合物按分子大小不同分离开来。,（5）亲和层析。亲和层析是根据生物大分子与其配基之间具有高度专一性的亲和力而设计的一种层析技术。具有专一亲和力的生物分子对主要有：酶
11、与底物（包括辅酶与辅基）、激素与受体、抗原与抗体、DNA与RNA、凝集素与糖蛋白等，由于结合双方是互配的，因此分子对任何一方均可作为配基，通过化学法连接到载体上作为固定相装柱，将欲分离的混合物（分子对另一方）加入柱，由于分子对双方有高度亲和力而被吸附结合在柱上，其它杂质首先随流动相被洗脱下来，然后改变流动相成分，将吸附结合在柱上的亲合分子洗脱下来。,2根据两相物理状态划分（1）液相层析。流动相为液体的层析，如上述各种层析。,低压液相层析仪,高效液相仪,（2）气相层析。流动相为气体的层析。固定相有固体或液体，故又分作气固层析或气液层析。3根据支持物的装填方式划分柱层析（将支持物装在管子中成柱形，
12、在柱中进行层析），薄层层析（支持物铺在玻璃板上成一薄层，在薄层上进行层析），纸层析（用纸做支持物的层析）。,（四）电泳技术原理：带电颗粒在电埸作用下，向着其电性相反方向移动的现象称为电泳。由于被分离物质各自的带电性、带电量、分子颗粒大小和形状等的不同，在同一电埸下它们的移动速度各异，经过一定时间电泳后可被分离开来。影响电泳的因素：在电泳过程中，带电颗粒的迁移率在一定条件下与其所带电量、颗粒半径和溶液的粘度相关。此外还有以下因素可以影响物质的电泳迁移率：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗作用等。,不同型号的毛细管电泳仪及其工作原理,电泳的分类：显微电泳（毛细管电泳）、自由界面电泳和区带
13、电泳三大类。,以上区带电泳应用较为广泛，其特点是在电埸作用下，被分离的各组分在支持物上相互分离为不同的区带。分类如下：（1）按支持物的物理性状不同可分为：1）滤纸及其他纤维纸电泳，2）粉末电泳，3）凝胶电泳、4）缘线电泳。（2）按支持物的装置形式不同可分为：1）平板式电泳，2）垂直板式电泳，3）垂直柱式电泳，4）连续液动电泳。（3）按pH的连续性不同可分为：1）连续pH电泳，2）非连续pH电泳。,左上：电泳结果左下：垂直电泳架右：双向电泳结果,凝胶成像系统,（五）光谱技术光谱技术是利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射辅射能的特性，对物质进行定性或定量的一类分析技术。它具有灵敏度高，测定简便
14、、快速，试样不被破坏等优点，是一类最常用的生化测定技术。1比色分析法。比色法是利用有色物质对一定波长的光的吸收特性来进行定量的一种分析方法。在一定浓度范围内，溶液中有色物质的浓度与溶液颜色的深度成正比，用可见光（400-760nm）作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法，叫做比色法。常用的有：,（1）标准对照法。将样品和标准样品溶液在相同条件下分别测定它们的吸光度，计算出试样溶液的浓度。（2）标准曲线法。配制一系列浓度不同的标准品溶液，按一定操作方法显色，在选定波长条件下分别测定它们的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标，作一条标准曲线或工作曲线。以后只需在相同条
15、件下实验，测定未知样品溶液的吸光度，从标准曲线上求得相对应的浓度值，即为未知样品液的浓度，一条标准曲线，如测定条件不变，可供多次使用，否则应重新绘制。,2分光光度法。分光光度是根据被测物质对各种波长光的吸收能力（吸光度或光密度），绘制吸收光谱曲线，不同的物质，分子结构不同，其吸收曲线各有特殊形式，根据曲线的特征，用于物质的定性定量。分光光度法波长范围较大（200-1000nm），因此，既可用于可见光，也可用于紫外光和红外光的分光测定，故测定物质既可是有色物，也可是无色物，扩大了应用范围。由于分光光法采用单色光器（棱镜），得到单色光，其波长范围比滤光片波长更狭窄，提高了分析的灵敏度、准确度和选择
16、性。所用的仪器721分光光度计、752紫外分光光度计等。,比色试验和不同的可见光和紫外分析仪,3荧光光度法。某些物质经紫外光照射能发出比原激发光的频率低，波长长的可见光，这种光称为荧光。各种物质经紫外光激发后能发出的荧光特性与物质的化学性有关。在激发光强度和所通过的溶液厚度不变时，在一定浓度范围内该物质所产生的荧光强度与其浓度成正比。因此，可以用已知浓度的标准与待测样品同样操作，通过测定荧光强度（F），按前述的标准曲线法和标准对照法，求得待测物质的浓度。所用的仪器如国产930型、910型等荧光光度计。,4比浊法。比浊法是利用混悬溶液中颗粒对光线产生散射特性进行测定。其测定的理论、方法和计算等类
17、似于比色分析法，因此基本上任何一种光电比色计或分光光度计都能用于比浊测定。以上这些技术，被称为生化的四大技术，很传统的。大体可以满足静态生化、动态生化的检测，而机能生化则首先有赖于对化学物质的结构认识，这样的研究目前十分热门，自然杂志专门有关于蛋白质三级机构图的专刊，目前积累迅速。而研究则是一条长链，有许多环节构成，投入成本高。,全自动生化检测仪,（六）分子杂交技术（详见有关章节）二、用生物化学方法研究中医的现状该章节引用了大量的国内研究进展资料，值得仔细阅读。（一）物质代谢介绍了：阴虚、阳虚、心气虚、肝气虚、脾虚、肺虚、肾虚、体质学说与物质代谢（其中：毛良、顾文聪（我校教师）,1阴虚、阳虚与
18、物质代谢毛良是我校的生化专业的老教师。2心气虚与物质代谢心气虚证患者红细胞SOD活性明显下降、血清LPO含量显著升高，推测由于红细胞SOD活性下降不能保护心肌免受超氧自由基的攻击，以致产生心气虚的临床症状。心气虚患者血浆核酸总量及DNA、RNA含量均低于正常对照组，提示心气虚患者蛋白质合成功能有一定的障碍。3肝气虚证与物质代谢,4脾虚与物质代谢脾虚患者：柠檬酸刺激后唾液淀粉酶活性下降。血清胃泌素和胰淀粉酶活性低下，胃肠蠕动紊乱，小肠吸收功能低下。说明脾虚患者的胃肠功能确有紊乱。木糖排泄率较正常人显著降低，而且食少、腹胀满、大便不调、神疲气短等脾虚四大主症与木糖排泄率下降有一致性的规律。血清淀粉
19、酶及其同功酶和胰脂肪酶均显著下降，且食欲减退、食后腹胀与大便溏泄等脾气虚的三个主症与之呈正相关，表明胰腺外分泌功能的降低可视为脾气虚证的特异性诊断指标之一，且淀粉酶总活性的降低取决于胰淀粉酶同功酶的下降，而与唾液淀粉酶无关，为脾气虚证诊断提供了一个更准确有效的实验指标。,5肺虚与物质代谢6肾虚与物质代谢7体质学说与物质代谢（二）能量代谢介绍了：心气虚、肝血虚、脾虚证、体质学说与能量代谢（其中匡调元为我校教师）1心气虚证与能量代谢2肝血虚证与能量代谢,3脾虚证与能量代谢脾气虚患者肌纤维的肌酸磷酸激酶（CPK）、琥珀酸脱氢酶、辅酶1-四氮唑还原酶（NADH-TR）活性、肌球蛋白腺苷三磷酸酶（M-A
20、TPase）活性，以及肌糖原含量均减少，线粒体发生改变，骨骼肌有氧氧化效率降低，糖酵解供能途径障碍，能量代谢受阻；实验还发现CPK和肌型肌酸磷酸激酶（CPK-MM）活性的降低与脾气虚的轻重程度有量的相关性。脾气虚大鼠骨骼肌细胞ATP含量和能荷值显著减小，与无氧酵解相关的乳酸脱氢酶（LDH）以及有氧氧化相关的琥珀酸脱氢酶（SDH）活性显著升高，提示能量代谢异常，与之相关的微量元素锌和铁含量也相应升高，而与肌肉收缩有关的元素铜、砷、钠减少而钙增多。红细胞膜Na+-K+-ATPase活性也显著低于正常组。,4体质学说与能量代谢（三）神经内分泌介绍了：阴虚、阳虚、心气虚、肝、脾虚、肺虚、肾虚、与神经内
21、分泌（其中赵伟康、金国琴、为我校教师，沈自尹、王文健华山医院藏象研究室，在肾虚证研究方面全国领先）1阴虚阳虚与神经内分泌2心气虚与神经内分泌3肝与神经内分泌4脾虚证与神经内分泌5肺虚证与神经内分泌,6肾虚证与神经内分泌沈自尹等从1959年，在“肾”本质的研究中，得到肾阳虚证具有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能紊乱的结论，这一结论经历了全国七个省市和日本京都病院的重复验证。他们从1979年起，通过选择符合典型肾阳虚证患者与正常组、同病无特殊见证组下丘脑-垂体及其所属三个靶腺轴功能的全套测定的对比研究，结果显示肾阳虚证不仅表现为肾上腺皮质轴功能紊乱，而且在不同的靶腺轴、不同环节、不同程度上呈现隐潜性
22、变化。采用了温补肾阳法治疗后，靶腺功能明显恢复。由于累及三个靶腺轴，由此可以推论肾阳虚证主要发病环节是下丘脑（或更高中枢）的调节紊乱。（1）下丘脑-垂体-性腺轴与肾虚,（2）下丘脑-垂体-肾上腺轴与肾虚沈自尹等实验发现，35例肾阳虚证患者尿17羟均值治疗后显著高于治疗前，24例肾阳虚证患者ACTH滴注试验呈延迟反应，治疗后复查其值均恢复至正常；6例肾阳虚证患者血浆ACTH浓度治疗后显著高于治疗前；7例肾阳虚者血皮质醇昼夜节律呈异常曲线者，有4例治疗后得以恢复。赵伟康等经动物试验发现补肾益精方药固真方能明显提高老年大鼠（肾虚衰老）海马细胞降低的糖皮质激素受体（GCR）数，提高下丘脑降低的NE、D
23、A和5-HT含量，降低老年大鼠异常升高的血浆皮质酮，使之趋于正常青年对照组。,（3）下丘脑-垂体-甲状腺轴与肾虚沈自尹等观察了8例肾阳虚者血清总T3含量，与治疗前相比较，发现治疗后血清总T3含量显著增高，4例肾阳虚者TRH兴奋试验呈延迟反应，经治疗后有2例得以恢复。李晓玲等观察了27例肾虚型恶性肿瘤患者的甲状腺功能，其肾阴虚、肾阳虚两组的血清T3、T4含量均显著低于健康对照组，肾虚两组间T3相接近，T4则以肾阳虚组更低下，肾阳虚组代偿率仅9.0%，两组有显著差异。因此认为，甲状腺功能变化可作为临床判断肾虚型肿瘤患者病情和疗效的参考指标。赵伟康等动物实验发现，老年大鼠（肾虚衰老）血清T3、T4、
24、F T3、F T4和L-EK含量明显下降，rT3显著增加，血清TRH和TSH呈代偿性增高，揭示老年大鼠血清T3下降与T4转化为rT3反应增高及甲状腺对TSH的反应性降低有关；L-EK具有降低TSH水平的作用，推测血清TSH的增高可能也与L-EK下降有关。,固真方能明显提高老年大鼠血清T3、T4、F T3和F T4含量，降低血清TRH、TSH和rT3含量，推测可能与提高甲状腺对TSH反应的敏感性，促进甲状腺合成和分泌T3、T4，抑制T4转变为rT3作用有关，从而改善老年肾虚大鼠甲状腺功能低下状态。,三、用生物化学方法研究中医药的范例四、展望综上所述，将中医基础理论与生物化学技术结合起来进行研究，
25、初步取得了一定的成果和经验，但仍不够深入与广泛。例如，绝大多数研究停留在一般物质指标变化的分析上，尤其对于基因水平研究大多还处于起步阶段，其主要原因可能是由于中药成分的复杂性，难以建立合适的动物模型，缺乏现代生化实验技术与设备等；其次从各地科研研究成果来看，大多是根据中医药理论，自己拟订的检测指标，缺乏统一的标准，影响了对临床疗效的评估，难以推广。以上这些问题的解决，在技术上有待于现代实验技术的引进，适宜的实验方法的创立和突破；在设备上必须更新现有的仪器、设备以及引进微量、快速、重复性能好的先进仪器设备；并组织全国专家讨论，统一检测标准，将实验研究成果推向临床和生产实践，创造更大的社会效益和经济效益。,存在问题：1）绝大多数研究停留在一般物质指标变化的分析上，尤其对于基因水平研究大多还处于起步阶段，其主要原因可能是由于中药成分的复杂性，难以建立合适的动物模型，缺乏现代生化实验技术与设备等。2）其次从各地科研研究成果来看，大多是根据中医药理论，自己拟订的检测指标，缺乏统一的标准，影响了对临床疗效的评估，难以推广。3）此外，我们自然会问，其他脏腑气虚证患者红细胞SOD活性是否象心气虚一样下降，其他脏腑的其它虚证患者如何？,
