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1、ABO血型反定型梯形微板法的建立?284?论着中国输血杂志2007年8月第2O卷第4期ChinJBloodTransfusion,August,2007,Vo1.20,No.4ABO血型反定型梯形微板法的建立孙立平韩璐张庆武陈虹许婷婷(武汉血液中心,湖北武汉430030)摘要:目的建立梯形微板ABO血型反定型检测方法.方法随机选用常规A,B,0,AB型血样各8份.运用正交设计原理选择血浆稀释度,红细胞浓度,反应温度,静止时间4个参数的最佳条件;采用混合血样倍比稀释,确定凝集与非凝集灰区值.根据已确定的最佳条件和灰区值,进行重复性试验,灵敏度试验,准确性试验,脂血干扰试验,溶血干扰试验,并检测6
2、份ABO亚型血样A,A,A.B,A.B,AB,BM和5份含不规则抗体血样抗M,抗一N,抗一P1,抗一Le,抗一HI,以评价对特殊血样的检出能力.结果重复性符合率100%.灵敏度可达到与试管法相同效价的检出能力.准确性达99.99.47份不同脂血程度血样抗干扰试验一次判读正确率100.溶血干扰试验在Hb20g/L时,对梯形微板法试验结果无明显影响,在严重溶血情况下(Hb>20g/L),对凝集端无影响,对非凝集端有影响.对ll份特殊血样均有较好的检出能力.结论梯形微板法不仅能够很好地完成普通血样AB0反定型的检测,还具有提高对弱凝集血样检测灵敏度的优势,进而提高试验的准确性.关键词:AB0反
3、定型;梯形微板法;U型微板法中图分类号:R457.11R446.61文献标识码:A文章编号:1004549X(2007)04028403Establishingatrapezoidmicro-platemethodtodetectABObloodgroupinserumSUNLiping,HANLu.zHANGQingwu,eta1.WuhanBloodCenter,Wuhan,Hubei430030,ChinaAbstract:ObjectiveEstablishingatrapezoidmicroplatemethodtodetectABObloodgroupinserum.Methods
4、Select32bloodsamplescontainingA,B,OorABtypesrandomly.Useorthogonaldesignprincipletoselecttheoptimumconditionsofthebloodplasmadilution,erythrocytesdensity,temperatureandstatictime.Themixbloodsamplesareseriallydiluted.Theagglutinatingandnonagglutinatinggrayzonesarealsodefined.Basedontheopti-mumconditi
5、onsandcriterions,thereproducibditytest,sensitivenesstest,accuracytest,lipaemiainterferencetestandhaemolysisinterferencetestarecarriedOUt.6ABOsubgroup(AM,AX,A2B,A3B,AXB,BM)and5irregularantibody(anti-M.antiN.antiP1,antiLeb,antiHI)aredetectedtoevaluatetheabilityofthetrapezoidmicroplatemethodtodetectspe
6、cialsamples.ResultsThetrapezoidmicroplatemethodsrepetitivenesstestscoincidenceis1OO.Itssensitivityisidenticaltothetesttubemethod.Theaccuracyis99.99.Inthe47variouskindsoflipaemiabloodsamplesantiinterferencetests.thecorrectinterpretationatonetimeis1OO.Inthehaemolysisinterferencetests.whenhemoglobincon
7、tentarebelow20g/L.therearenoobviousinfluencesfound.Whenseverhaemolysisappears(bloodplasmahemoglobincontentareabove20g/L),thereisnoeffectontheagglutination,butmakeadifferencetothenonagglutinating.Theabilitytodectect6ABObloodsubgroupsand5irregularantibodybloodsamplesisgreat.ConclusionThetrapezoidmicro
8、platemethodnotonlyhasgoodabilitytodetecttheAB0bloodgroupbothintheredcelltypingandserumtyping,butalsoenhancestheaccuracyindetectingtheagglutinatingbloodsamplesandimprovestheexactitudeofthetests.KeyWords:RedcelltypingandserumABObloodgrouptyping;Trapezoidmicroplatemethod;Umicroplatemethod经典的试管离心法目前仍被认为
9、是最可信赖的ABO定型方法,但是它操作费时,且易出现人为差错,故不适合采供血系统大批量样本的检测.日本Olympus公司于上世纪8O年代研制开发了自动血型检测仪,该仪器核心技术为梯形微板法,其技术先进但价格十分昂贵,国内仅有极少数采供血机构在使用,目前难以普及.我们利用现有的设备资源TECANRSP一200全自动加样仪,配合AK03A型数字血型仪,整合了一套新的梯形微板法血型检测系统.该系统不仅能完成ABO正反定型试验,且Ballele,HLAB4068,identifiedinanEquatorianindividua1.JTissueAntigens,2006,68(6):5285301-
10、93DanzerM,PolinH,SchroderS,eta1.HLA-Cw0740:a.newallelemistypedbygenericsequencingandidentifiedbyallelicseparationJ.TissueAntigens,2007,69(1):100102(20070323收稿,o8一o1修回)本文编辑:蔡辉闻欣中国输血杂志2007年8月第2o卷第4期hin堡!an!垒!:!:!检测反定型弱凝集状态样本的灵敏度较高.我们主要就血型反定型梯形微板法的建立报告如下.1材料与方法1.1样本与材料本中心于2004年l2月一2005年3月采集的无偿献血者全血样本25
11、554份,5ml/份,均用1:4枸橼酸一枸橼酸钠抗凝剂抗凝.标准红细胞悬液由本实验室自制,生理盐水市售;RSP一200全自动加样仪(瑞士TECAN公司),AK03A型数字血型分析仪及Poseidon判读软件(深圳爱康公司),XK96型微量振荡器(姜堰市新康医疗器械有限公司).1.2梯形微板法试验条件的优化我们根据血型判读仪已设定的凝集与非凝集临界值,随机选用常规A,B,O,AB型血样各8份,5ml/份,对红细胞浓度,血浆稀释度,环境温度和反应静置时间采用正交实验优化试验参数,记录在各种参数条件下正确判读血型的血样数,再通过综合分析得出试验最佳条件.1)确定血浆稀释度:根据梯形微板的结构及其试验
12、原理的特性,要求在保证一定血清抗体效价的基础上,降低血样中的蛋白粘度,以利于非凝集反应中细胞的滚落,因此,进行原倍血样和2个稀释度血样的优化试验,即血浆与生理盐水之比为:原倍,1:1,0.7:1.2)红细胞浓度选择:由于血样被稀释,为保证抗原抗体的适当比例,红细胞浓度须作相应调整.分别取A,B型红细胞各5份,O型3份,配制成1.5,2.0,2.5的红细胞悬液.3)孵育温度和静止时间的选择:选择15,20,25C孵育温度和40,60,80min静止时间.优化试验结果表明,在2红细胞悬液,l:1血浆稀释度,60-80min静止时间,1525条件下,血型正确判读血样数均为32(正确率100),故确定
13、上述条件为最佳.1.3凝集和非凝集反应灰区值的设定基于血型仪结果判断原理,在仪器固定的凝集和非凝集反应临界值的基础上,我们须确定凝集与非凝集反应的灰区值,以便检出亚型和含不规则抗体的弱凝集样本.其原则是:非凝集灰区值选择试管法的非凝集血样只显示且不产生?的最小取值;凝集灰区值选择试管法的1+和w+血样均能判为?,且>1+凝集强度的血样均不产生?的最大取值.根据该原则,经大量常规血样试验,我们将凝集灰区值缩小在36,4O,46范围,非凝集灰区值在6O,62,65范围.然后,将1O人份O型样本的血浆(2ml/份)分别倍比稀释至无凝集状态,选取试管法凝集度2+,l+,w+,一稀释样本各1O份(
14、2ml/份),作不同凝集强度血样在不同凝集和非凝集灰区值组合下的试验.在梯形微板法中,AK03A型数字血型仪扫描以+对应于试管法2+以上的凝集状态,以?对应于试管法1+和w+,以一表示非凝集状态.记录反应呈+,?,显示的血样数,以确定最适灰区值.试验结果显示,4O和62符合灰区值确定原则,1O份2+均判为+,非凝集血样均判为一,l+和w+血样均判为?.1.4试验步骤在RSP一200全自动加样仪上,将待检血样1:1稀释,每份血样于梯形微板上加注3孔,25ffl/L,每孔加注2A,B,O红细胞悬液25ffl,置微板振荡仪中混均(<3Os),室温(1825)静置6Omin,置数字血型仪扫描读板
15、,仪器自动分析反应图象并判读出血型结果,结果以数码成像贮存并打印.1.5灵敏度检测取A,B型血浆各3O份(O.1ml/份)混合,倍比稀释至1:256稀释梯度,分别用梯形微板法与试管法作灵敏度比较试验;试管法操作按参考文献E23方法.1.6重复性试验取A,B,O,AB型血样各12份(1ml/份),1次/周,连续3周用梯形微板法重复试验,并计算符合率.选取梯形微板试验反应灰区样本1O份(1ml/份),连续重复试验3次,并计算符合率.1.7脂血干扰试验分别取轻度,中度和重度脂血血样47份(1ml/份),作脂血干扰性试验.1.8溶血干扰试验将O型血球置一2O冰箱中使之完全溶血,形成血红蛋白液,再分别用
16、O型和AB型血浆与之混合,配制成不同浓度O型和AB型血浆血红蛋白混合液,测得混合液内血红蛋白含量分别为3,5,7,12,2O,36,67和125g/L,其中Hb含量为7g/L的混合液肉眼可见轻度溶血,Hb>20g/L可见明显严重溶血.分别于O型和AB型混合液中加注A型和B型血球,观察凝集与非凝集反应现象.1.9亚型及不规则抗体的检测分别检测A,A,AB,A.B,AxB,B亚型血样6份和含抗一M,一N,一P1,一Le,一HI不规则抗体的血样5份(均lml/份),评价梯形微板法对特殊血样的检出能力.2结果2.1准确性试验25554份血样除冷凝集,亚型和溶血血样各1例被判读灰区结果外,其余均一
17、次判读出结果,一次判读正确率为99.99(25SSl/皇虽检血杂志2007年8月第20卷第4期ChinJBloodTransfusion,August,2007,Vo1.2O,No.425554).:64中均呈?状态,提示此方法至少可达到与试2.2灵敏度比较试验梯形微板法在1:32和1管法1:32相同效价的检出能力(表1).表1梯形微板法与试管法的灵敏度比较(一30)试管法梯形微板法A型+B型+A型+B型+2.3重复性试验A,B,O,AB型各12份样本重复试验的符合率100;反应灰区血样1O份均判读为灰区,符合率1OO%.2.4脂血干扰试验47份脂血血样的一次判读正确率1009,5.2.5溶血
18、干扰试验溶血对梯形微板法的凝集端无影响;非凝集端:当血样Hb<12g/L时,均显示非凝集,对结果无影响;当Hb一12g/L时,显示?,无明显影响;当Hb>20g/L时,均显示凝集,对结果有明显影响.2.6亚型及不规则抗体的检测见表2,3.3讨论目前,大多数采供血机构采用U形微板法鉴定血型,相比过去手工检测法,该方法已向前迈了一大步.但是,我们在使用过程中发现该方法的检测灵敏度有一定的局限性.通常正定型使用市售标准血清,抗体效价能够得到控制和保障;而在反定型试验中,当抗原强度一定时,凝集反应的强弱主要取决于抗体的效价.ABO亚型和不规则抗体在反定型试验中较为复杂,被检血清抗体效价存在
19、较大差异,其试验难度远远大于正定型.表2梯形微板法对6份亚型血样及5份含不规则抗体血样的检测结果梯形微板技术是利用孔壁呈阶梯状的特殊V字型微孔板(1012孔),阶梯级宽和级高分别相当于和大于1个红细胞的直径.当相应的抗原(血球),抗体(血浆)发生凝集反应时,彼此粘挂在阶梯上,均匀分布于孔壁,未发生抗原抗体反应的红细胞则沿阶梯滚落于孔底中央,形成实心圆点,经AK03A型数字血型分析仪扫描,Poseidon软件将每个反应孔分解成6300个像素点,并且按其白度,灰度和黑度3个区域进行分类,分别计算出相关区域的像素数量,再运用模糊数学的方法分析判断,经CCD系统图像数字化处理后,得出血型鉴定结果.而普
20、通酶标仪仅在U形板微孔直径的一个或两个方向上读取3O一4O个值,再通过计算相对透光率来判断血型,相比之下,梯形微板法更为精确直观.而且,整个试验操作只需分为加样,混匀,静置和判读4个步骤,混匀之后无需再振荡,使抗原抗体的结合,凝集与非凝集反应的区分在静置过程中一步完成,避免了U形微板法第2步振荡过程对弱凝集状态的破坏.因此,该方法不仅对常规血样有很好的检测效果,更重要的是提高了对弱凝集血样的检出率,进而提高了试验的准确性.此外,我们发现,此方法要求血样不能有严重溶血,否则会对结果产生一定影响;试验完成后,清洗梯形微板并定期用超声清洗仪清洗并干燥;读板时要保持微板底部洁净,不能有划痕和污渍.参考文献1刘达庄.免疫血液学M/高峰.输血与输血技术.北京:人民卫生出版社,2003,9092z中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程(血站部分)rM.天津:科学技术出版社,1997,6062(200612-o4收稿,20070423修回)本文编辑:夏玲
