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1、噻二唑二酮对分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性和生长的抑制作用摘要：分枝杆菌属，包括非致病性物种如耻垢分枝杆菌，和致病物种如结核的病原体（TB）结核分枝杆菌。结核病的治疗需要多种抗生素，但其有效性已经由于耐药菌株的出现而遭到破坏。我们十分需要新的抗生素是由于它们可以缩短治疗过程，而且它们的有效性尚未由于耐药菌株的出现而遭到破坏。在这项研究中，我们介绍了一个相对较少的深入研究的杂环类，即噻二唑二酮，它可以抑制分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性，是一个在肽聚糖合成过程中L-丙氨酸向D-丙氨酸转化所必需的酶。研究人员对该噻二唑二酮家族的十二名成员进行了抑制结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌丙氨酸消旋酶活性和细菌生长的评估。
2、在不同程度上用50 抑制浓度（ IC50）的噻二唑二酮，范围在 150毫米内分别抑制结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性。这些化合物也抑制这些细菌的生长，包括结核分枝杆菌的耐药株。用于对药物敏感的结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的最小抑菌浓度（MIC）介于6.25毫克/毫升到100毫克/毫升，耐药结核分枝杆菌的介于1.56毫克/毫升至6.25毫克/毫升。噻二唑二酮的体外活性表明这个家族的化合物可能代表的是药物化学开发新型抗分枝杆菌药物的努力起点。1、 引言分枝杆菌属，包括超过70种的革兰氏阳性需氧型腐生菌和致病菌物种1。依据一些特性，如酸牢度和霉菌酸细胞壁，富含GC基因组的种属被分为两组在固
3、体培养基上生长，其基础的生长率的不同。缓慢地生长的分枝杆菌（SGM），如结核分枝杆菌在培养超过七天后可以形成菌落，而快速生长的分枝杆菌（RGM），如耻垢分枝杆菌少于七天则可以形成菌落2。SGM和RGM都包括医学上的重要病原体。具有显著的医疗负担的SGM是结核病原体（TB）结核分枝杆菌，它每年折磨近九万人，死亡超过百万人3。，分枝杆菌的感染是难以治疗的，这是由于富含脂质的细胞被膜，往往赋予在这些细菌内在耐药性4。标准治疗包括一个使用抗生素的鸡尾酒含有的漫长的疗程，这虽然往往可以治愈，但是由于耐药性的出现，患病患者的依从性差和有效性减弱。目前有超过500000例的耐多药结核病（MDR-TB），其标
4、准的治疗是没有效果的，需要第二线药物，但这些药物往往是有毒的，而且其疗效是值得商榷的6。在抗分枝杆菌药物开发方面的进展缓慢。ATP酶抑制剂bedaquiline，最近被FDA批准用于治疗耐药结核病，它是近半个世纪以来的第一种抗结核的新药物7-9。其他一些化合物用于临床上的开发10。为确保新的药物，能够有效对抗耐药菌株的产生，并能缩短治疗的连续管线，必须作出更多努力，以确定新的细菌的药物靶点或重新评估旧目标。具有显著历史价值之一的分枝杆菌靶点是丙氨酸消旋酶11-13，它是一种含有磷酸吡哆醛的同型二聚体酶，能够催化细菌细胞壁合成中L丙氨酸的肽聚糖层向D丙氨酸的转化14。在分枝杆菌中，丙氨酸消旋酶的
5、约41 kDa的单体是由一个唯一的ALR基因编码的，这个基因的失活导致了D-丙氨酸营养缺陷型表型的产生，这种现象抑制了细胞的生长和存活1517。在ALR基因加上缺乏在人类已知的同源基因的必要性使丙氨酸消旋酶成为抗分枝杆菌药的吸引力的目标。众所周知，由链霉菌产生的一种天然抗生素环丝氨酸可以定位这种酶。虽然在过去曾成功地用于治疗耐药结核病，但是由于药物产生的神经毒性，环丝氨酸在结核病治疗的效用是有限的。环丝氨酸是丙氨酸的环状类似物，它的酶失活的作用机制是通过与PLP的辅因子形成共价加合物而使丙氨酸消旋酶失活22。由于环丝氨酸和其它底物类似物的脱靶效应而导致的潜在毒性，促使人们努力查明丙氨酸消旋酶抑
6、制剂与丙氨酸在结构上无关。我们最近报道说通过高通量筛选发现了一些新的具有抗菌活性的类丙氨酸消旋酶抑制剂 23,24。我们在这里介绍的噻二唑二酮是一类新的丙氨酸消旋酶的抑制剂，它能针对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的酶，以及它们对这些细菌的生长效果，并讨论这类化合物作为代替抗分支杆菌的潜在可能性。2材料与方法2.1。菌种和培养基用于质粒传播的大肠杆菌菌株DH5（New England Biolabs公司，伊普斯维奇，MA）和常规用于蛋白质表达的大肠杆菌菌株罗塞塔-2（plys中）DE3（EMD Millipore公司，罗克兰，MA）都生长在含有100 mg / ml的氨苄青霉素的LB培养基中2.2。
7、化学制品噻二唑二酮源于Maybridge公司库筛选和飞世尔科技（宾夕法尼亚州匹兹堡）购买。氨苄青霉素，链霉素，D-和L-丙氨酸，PLP，和b-NAD钠盐，和环丝氨酸均从Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州）购得。2.3。克隆，表达及重组耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶的纯化2.4。丙氨酸消旋酶测定和IC50值的测定2.5。互补分析实验2.6。电喷雾电离质谱研究（ESMS）和对照MALDI质谱分析2.7。体外抗分枝杆菌的最小抑菌浓度（MIC）的研究2.8。化合物诱导的细胞毒性测定法3。结果3.1。耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的丙氨酸消旋酶具有高度同源性与显著不同的催化活性。3.
8、2。耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的丙氨酸消旋酶的活性被噻二唑二酮差异性抑制。.3.3。噻二唑二酮抑制耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的生长。3.4。噻二唑二酮对哺乳动物细胞的毒性。3.5。噻二唑二酮的初步构效关系（SAR）。4讨论作为分枝杆菌细胞壁合成中必不可少的一种酶，丙氨酸消旋酶是抗分枝杆菌药物开发中的一个有吸引力的和验证目标。此处我们报告的噻二唑二酮家族对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的同源酶活性的抑制，并且还检测他们对细菌的抗分支杆菌活性的抑制。我们的研究揭示了一个令人惊讶的发现，即噻二唑二酮差异性的抑制两个分枝杆菌的丙氨酸消旋酶的活性。而噻二唑二酮家族显示了有前途的抗分支杆菌活性，抑制生长没有出现是抑制细胞丙氨酸消旋酶的直接后果。丙氨酸消旋酶抗菌剂的发展受到缺乏安全和高度特异性抑制剂的阻碍。这种酶如噻二唑二酮家族在本研究报告的非底物抑制剂最近才被揭露出来。噻二唑二酮与环丝氨酸的活性位点粘结剂的结构不同，可能揭示了抑制丙氨酸消旋酶的新的战略，而为更多的选择性抑制剂的合理设计铺平道路。
