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1、干扰素基因研究进展及其在抗病育种中的应用展望干扰素是动物机体最重要细胞因子之一，目前计有5种猪干扰素（I型干扰素、和II型干扰素）被发现。本文列举了主要猪干扰素（INF、）的基因结构、抗病毒和免疫调节功能，概述了干扰素在机体中以JAK-STAT信号转导通路方式为主的抗病毒机理，同时分析了猪干扰素基因可能存在与猪综合抗病力密切相关的遗传多态性及其在猪抗病育种中的应用前景。1957年Isaacs和Lindenman在进行鸡胚细胞流感病毒感染试验中首次发现一类能干扰和抑制病毒复制的可溶性细胞分泌物，故取名为干扰素（interferon）。Wheelock与Green分别于1965年和1969年相继发
2、现免疫活性细胞经丝裂原或抗原刺激后，产生一类对酸敏感的干扰素，称为免疫干扰素。目前依据干扰素对酸的敏感性通常分为I型干扰素（酸敏感型）和II型干扰素（耐酸型）两类。几乎所有脊椎动物均可产生这两类干扰素，根据产生干扰素细胞种类不同，I型干扰素至今已发现INF-、等6种类型，而II型干扰素迄今为止仅发现INF-一种（Domeika, 2003）。由于干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫系统起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学和分子生物学研究最为活跃的领域之一2、猪干扰素及其基因结构目前所发现的猪干扰素包括INF-、和INF-，并且INF-未在其它物种中发现（Domeika, 2003）。
3、猪INF-、分别是由12个和5个以上的相关功能基因编码的蛋白质家族，这些两种干扰素的各亚型之间同源性很高，天然INF-常常是INF-、功能基因表达产物的混合体，而INF-、和INF-仅由单一基因编码（Bonnardiere, et al., 1994）。现在已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包括INF-、和INF-，汇总如下：3、干扰素作用机理3.1、干扰素主要生物学功能3.1.1、干扰素作用特点 ：作为机体最重要的细胞因子之一，干扰素主要生物学功能体现为广谱的抗病毒活性和免疫调节功能，其作用特点可概括为（杨业华主编，2000；周光炎主编，2000）： 1、干扰素属诱生蛋白，正常细胞
4、一般不自发产生干扰素，在受诱生剂（包括病毒、细菌和某些化学合成物质）激发后，干扰素基因去抑制而表达； 2、干扰素系统是目前所知的发挥作用最快的第一病毒防御体系，可在很短时间（几分钟内）使机体处于抗病毒状态，并且机体在1-3周时间内对病毒的重复感染有抵抗作用； 3、干扰素的抗病毒效应是通过与靶细胞受体结合，诱导抗病毒蛋白（AVP）而间接发挥作用，对病毒起抑制作用而非杀灭； 4、干扰素具有种属特异性，并且不同病毒、不同细胞对干扰素敏感性不同； 5、I型和II型干扰素发挥不同效应，不能相互替代。3.1.2、干扰素主要生物学功能： 目前对INF-、生物学功能和作用机理研究报道较多，I型和II型干扰素来
5、源不同（INF-主要由单核巨噬细胞产生，INF-来源于成纤维细胞，而INF-主要产生于T细胞、T细胞和NK细胞），挥发的生物学效应存在一定差异。干扰素的主要生物学功能可概括为（Samuel,2001）： 1、广谱抗病毒功能：I型和II型干扰素基因均可经诱导剂激活而表达，表达产物通过特定信号转导通路，激活干扰素诱导基因的转录，机体合成多种具阻断病毒复制功能的抗病毒酶和蛋白质，抵抗病毒对机体细胞的感染； 2、免疫调节功能：I型干扰素可增强MHC-I类分子表达，而强烈抑制MHC-II类分子表达；II型干扰素可促进MHC-II类分子表达，两类干扰素的协同调节作用，使机体处于最佳免疫应答状态。此外INF
6、-的生成可促进Th0细胞向Th1分化，而抑制Th2的生成，由于Th1和Th2分别介导机体细胞免疫和体液免疫，因此INF-可根据不同病原感染，与其它细胞因子（如IL-4等）共同作用，对机体进行免疫干预，实现免疫系统防御功能。 3、免疫增强功能：I型和II型干扰素均可刺激NK细胞并增强其杀伤功能，有利于机体清除病毒感染；此外INF-是主要的巨噬细胞活化因子（macrophage-activating factor，MAF），促进巨噬细胞吞噬能力和炎症反应，并可直接促进T、B细胞分化和CTL成熟，刺激B细胞分泌抗体，从而增强机体免疫机能。3.2、干扰素抗病毒机理干扰素基因的激活和表达是机体第一道病毒
7、防御体系，它先于机体的免疫应答反应。虽然干扰素还具其它多种生物学功能（如对免疫系统的调控、影响细胞生长、分化和凋亡等），但干扰素对入侵病毒的非特异性抑制功能，对于许多疾病的预防和治疗意义重大。根据对人和小鼠的相关研究，干扰素对病毒的防御反应主要是通过信号转导和转录激活通路，导致一系列受干扰素调控基因表达，生成多种直接作用于入侵病毒的酶和蛋白质，保护机体免受感染,其中JAK-STAT通路是干扰素介导的信号转导和转录激活的主要方式（Samuel,2001）。JAK为Janus家族的蛋白酪氨酸激酶，包括Jak-1、Jak-2、 Jak-3、 Tyk-2，STAT（signal transducer
8、and activator of transcription）即细胞转导与转录激活因子（包括STAT-1、STAT-2、STAT-3、STAT-4、STAT-5a、STAT-5b、STAT-6），其中Jak-1、Jak-2、Tyk-2与STAT-1、STAT-2直接参与了干扰素介导的JAK-STAT信号转导通路。JAK-STAT通路具体过程可表示为（周光炎主编，2000；Samuel,2001）：（1）首先从受诱导表达的INF-/和INF-分别与异构二聚体受体INFAR1-INFAR2和INFGR1-INFGR2的胞外区结合开始，由此激活与两种受体胞内区相连的蛋白酪氨酸激酶Jak-1、Tyk-
9、2与Jak-1、Jak-2； （2）STAT-1、STAT-2在Jak-1、Tyk-2催化作用下，使蛋白链特定位置的酪氨酸磷酸化并形成异二聚体，再与干扰素调节因子-9（INF-9）形成三聚体，而两分子的STAT-1在Jak-1、Jak-2作用下形成同源二聚体； （3）形成的三聚体和同源二聚体分别与染色体的ISRE元件和GAS元件结合，从而激活各种抗病毒基因启动子，生成多种抗病毒蛋白，参与机体的病毒防御快速反应。由干扰素诱导生成的抗病毒蛋白主要包括：（杨业华主编，2000；Samuel,2001） （1）双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR，常称为P1/eIF-2），主要功能为阻断宿主细胞mRNA合
10、成病毒蛋白质； （2）2，5腺苷酸合成酶（2,5-oligoadenylate synthetase，OAS），主要功能为激活内源性RNase L，活性RNase L可降解病毒mRNA；（3）腺苷脱氨酶I（adenosine deaminase 1，ADAR1），可将病毒RNA中碱基A修饰为I而阻止病毒蛋白质合成；（4）Mx蛋白（一种GTP结合蛋白），可与病毒核蛋白结合而损伤病毒衣壳蛋白；（5）氮氧化物合成酶（nitric oxide synthase，NOS），可使机体产生NO，NO在免疫防卫中可发挥重要作用。4、干扰素基因在猪抗病育种中的应用展望4.1、畜禽抗病力性状的遗传基础畜群对大多数
11、疾病的抗性与其他重要经济性状同属数量性状，受微效多基因与环境的共同影响（Axford et al.，2000）。研究表明畜禽对多数呼吸道、消化道类疾病的抗病力性状存在加性遗传方差：Lundheim通过估计公畜遗传方差组分，估计瑞典猪群对呼吸道疾病易感性h2为0.14，萎缩性鼻炎易感性h2为0.16（1979）；肠道疾病的h2为0.59（1988）。Pryztulski and Porzeczkowska (1980)估计了猪对螺旋体的抗病力h2为0.20-0.21；Bumstead et al.（1991）分析了8个不同鸡的近交系试验对7种不同种球虫、沙门氏杆菌、大肠杆菌、马立克氏病毒、传染性
12、支气管炎病毒以及5种禽白血病病毒的抗性，结果表明，各种近交系对病原的抗性均存在差异，结果表明畜禽抗病力大多受多基因及环境效应共同影响。尽管数量性状的多基因效应为开展猪特定病原抗病力选育奠定了理论基础，但在育种实践中至今仍存在待以解决的问题，具体表现为：（1）对特定疾病抗性的直接选择所耗费的成本和对生产造成的损失极其巨大；（2）选择对某种病原的抗性可能导致对其它病原的易感性；（3）对特定病原的抗性的间接选择，实质上导致对病原本身生存力的同步正向选择，进而阻碍了畜禽抗病力的选择效果（Gandon et al.,2001）。因此对畜禽先天的、无病原特异性的综合防御能力综合抗病力的选择成为畜禽抗病育种
13、研究的重要内容，而寻找控制综合抗病力主效基因（QTL）或遗传标记，是开展畜禽综合抗病力选育重要手段。4.2、干扰素与抗病力的关系干扰素强大的抗病毒和多种免疫调节功能，使得干扰素基因有可能成为猪抗病力选育的理想侯选基因。迄今为止，有关猪干扰素基因的遗传多态性与综合抗病力的相关分析的研究仍未见报导。但有关人类疾病与干扰素基因多态性相关分析的研究报道对今后开展猪抗病力选育的研究具一定借鉴作用：如不同IFN-基因型与日本国内肾病的易感性显著相关（Masutani et al.,2003）；IFN-基因存在一与人肺炎易感群有关的单核苷酸标记（Lopez-Maderuelo et al，2003）；人对乙
14、肝病毒的易感性与IFN-基因表达量差异有关（Ben-Ari et al.，2003）；Lio et al.（2002）、Stassen et al.（2002）、Lu et al（2002）也报导了类似研究结果。此外，大量体内和体外试验表明，猪干扰素对生产具重大威胁的传染病病毒均具有防御和抑制作用。一系列体外试验表明：用IFN-处理感染PRRSV(繁殖与呼吸综合征病毒)的猪巨噬细胞，可抑制PRRSV增殖（Bautista & Molitor，1999)；用重组interferon-处理Marc-145细胞后，可抑制PRRSV野毒株和细胞适应性毒株增殖（Rowland ，2001)；猪IFN-/
15、能有效抑制口蹄疫病毒的活力（Chinsangaram et al.，1999）；:猪重组IFN-可抑制感染传染性胃肠炎冠状病毒的猪上皮细胞和肺巨噬细胞中病毒复制（Charley B, et al，1988)；猪INF-可抑制感染猪瘟病毒的单核细胞和肺巨噬细胞的病毒复制（Esparza et al,1988）。动物体内试验表明，同时注射猪瘟疫苗和干扰素，可增强对猪瘟病毒的防御能力（Suradhat，et al. 2001）；感染TGEV的仔猪，可在肠道上皮组织中迅速产生抗TGEV的IFN-（Riffault et al.，2001)。干扰素(IFN)根据其产生细胞不同和理化性质、犐z物学特性的差
16、异可分为干扰素(IFN-)、干扰素(IFN-)和-干扰素(IFN-)。它们在机体免疫调节、抗病毒感染中具有重要作用。检测IFN的方法主要分为定量测定(常用ELISA)和生物学活性的检测，后者较为常用。(一)原理干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2以及人胚肌皮或肺单层细胞)产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。(二)操作步骤96孔培养板中加入不同稀释度的IFN和标准IFN，每个稀释度设3孔，每孔50l，病毒对照不加IFN。每孔加入100l 1.5210 ml Wish或H
17、ep-2细胞悬液，37、CO?孵箱培养612h，使细胞贴壁为单层 。每孔加入50l含100个TCID50 VSV, 细胞对照不加病毒。根据细胞病变状态，终止培养前34h。加入5mgml MTT, 15L。加入适量生理盐水，用滴管轻轻吹吸。弃去悬浮病变细胞和死细胞。200l孔 二甲亚砜(DMSO)，作用10min。测OD(570nm),表示活细胞中含甲的量，也可用刚果红摄入法、结晶紫染色法测定IFN对活细胞的保护水平计算:以保护半数(50)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。也可从标准曲线中求得待测样品的IFN活性单位。(三)试剂和器材1.VSV2.WISH、HeP-2细胞株
18、或人胚肌皮或肺单层培养物。3.MTT3-(4,5二甲噻唑-2-yl)-2,5-2苯基-四唑溴盐，二甲亚砜(DMSO)，刚果红，结晶紫等。4.10FCS RPMI1640, 培养板、培养瓶、CO?孵箱、超净台、酶联检测仪。(四)注意事项1.实验时先加IFN，后加指示细胞，以使细胞均匀分布于培养板底部。2.本法对天然培养上清或重组IFN-、IFN-和IFN-均可检测其活性单位。干扰素(IFN)在诱导细胞的抗病毒和抗生长反应及调节免疫反应中起关键作用。尤其是抗病毒反应是干扰素的基本功能，其分子机制正逐步被揭示。IFN诱导的过程实际上是一个信号传递和级联放大的过程。其主信号途径通过位于细胞膜上的酪氨酸
19、激酶使酪氨酸磷酸化，激活信号传导物和转录激活因子，然后信号传导物和转录激活因子转移到细胞核内。它们导致了许多基因产物的表达并由此产生一系列的生理学进程 。干扰素(interferon，IFN)是细胞在病毒或其他诱生剂作用下产生，具有广谱抗病毒活性的蛋白质，干扰素有两大类型，即I型(主要是和)和II型()干扰素，其中干扰素(IFN-)由白细胞产生，干扰素(IFN)由成纤维细胞产生，干扰素(IFN-)则在免疫相关细胞内合成，每种类型的干扰素都包括多种分子亚型。干扰素的作用是通过与细胞膜上的特异性受体结合，引发级联性的信号放大过程，将信号最后传递到细胞核内，对一系列基因的表达进行调控，并引发各种生理
20、反应，/干扰素(IFN-/)与干扰素(IFN-)信号传导经不同但相关的途径，人们在认识细胞对IFN的反应，特别是揭示诱导基因表达途径等研究领域取得了很大进展，现已知道这些途径包括a、特异I型和II型受体形成后，接上门神激酶(Janus kinases，JAKs);b、JAKs对信号介质和转录激活物(signal transducers and activators of transcription，STATs)磷酸化使信号放大。研究IFN信号传递所揭示的JAKs和STATs除参与对IFN的信号响应外，还参与许多不同的细胞素和生长因子介导的途径，目前已经了解到哺乳类的4种JAKs和7种STATs
21、。因此，IFN作用于细胞的过程是：IFN与细胞上受体结合，与受体相联的JAKs对STATs磷酸化;STATs中的特异酪氨酸残基被JAKs磷酸化激活后，与磷酸化酪氨酸的Src同源区2(SH2)相互作用形成同体和异体二聚体。STAT二聚体结合到基因的-激活序列(gama-activated sequence，GAS)上驱使临近基因的表达。不同的GAS偏好不同的STAT二聚体建立特异性反应。此外，STATl-2异体二聚体和STATl同体二聚体都可以结合到一种干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)家族成员p48上，组成一个三体结构。由STATl-2异体二聚体
22、与p48结合而成的三体结构称IFN激活的基因因子3(IFN-stimulated genefactor3，ISGF3)，它同一个结构上与GAS迥然不同的IFN激活的调节序列(IFN stimulated regulatory elements，ISREs)结合,ISREs驱动多/调控的基因但也有少数的IFN-调控的基因表1、信号传递途径1l 干扰素的信号传递途径IFN-相关的信号传递，要求5个截然不同的蛋白参与，即I型膜内蛋白IFNGRl和IFNGR2(IFN-受体亚基)以及JAKl，JAK2和STATl近期的研究揭示这一信号途径对大多数IFN-生物学反应而言是带普遍性的。IFN-受体几乎在所
23、有的细胞类型中有表达，仅可能在成熟的红细胞中例外，并且表现出严格的与IFN-结合能力的物种间特异性，功能活跃的IFN-受体至少含有两条种属特异性多肽，IFNGRl(以前所称的链或CD1l9w)，由人类6号染色体或小鼠第10号染色体上的基因编码，在介导配体结合、配体通过细胞的转运及信号传导中起重要作用，IFNGR2(以前所称链或结合因子1)，是由人类21号染色体或小鼠第16号染色体上基因编码的一相对分子质量为6.2X104多肽，在配体结合中作用甚微，但也是信号传递过程中所必需的。有3组实验或分析表明JAKs和STATs在IFN-引起的细胞学反应中起介导作用，一是人突变细胞系的分离和互补性实验，揭
24、示JAKl和JAK2在IFN-处理的细胞中变得有选择性的活跃，这是配体依赖性激活IFN-目标基因的前奏;二是通过生化研究，STATl这一潜在的胞液转录因子被分离并表现出迅速的酪氨酸磷酸化活性，在IFN-处理的细胞中很活跃;三是对两IFN-受体亚基的细胞间结构域的结构与功能分析，确定了保守的JAKl和JAK2特异结合位点。此外，IFN-在受体上为STATl诱导出一特异的磷酸酪氨酸结合位点，由此为激活了的受体与其信号介导元件连接提供了可能。 根据已有的认识，可以归纳一个相对完整的IFN-信号传递分子过程的模型，在未激活的细胞中，IFN-受体亚基彼此不紧密结合，但它们的膜内结构域特异地与JAKl和J
25、AK2结合，JAKl通过IFNGRl上膜内结构域临近膜的区域中4个氨基酸残基(266LPKS269)与之联结，JAK2则联结在IFNGR2膜内结构近膜区的富含脯氨酸的12个序列残基(263PPSIPLQIEEYL274)上。 功能上活跃的IFN-是同体二聚体，结合到两个IFNGRl亚基上，然后为两个IFNGR2亚基的结合产生出结合位点，在由此形成的对称性信号传递复合体中，受体亚基在细胞内的结构域及所带的非活性JAKs紧密相邻，JAKl和JAK2再在自主磷酸化和转移磷酸化作用下依次活化，JAK2首先被活化，活化后的结构特征表现出酶的作用，并对JAKl进行活化。 一旦活化后，结合了受体的JAKs对
26、IFNGRl近C末端含酪氨酸的5残基序列(440YDKPH444)磷酸化，使其为STATl的结合形成配对的配体诱导的锚定位点。两个潜在的STATl蛋白这时结合到这些位点上，因为SH2识别酪氨酸磷酸化的YDKPH序列，结合受体的STATl蛋白上靠近C端的701位酪氨酸残基又被与受体相连的激酶磷酸化，磷酸化了的STATl蛋白从受体上脱离，形成一同体二聚体，在依赖Ran/Tc4的GTPase活性机制作用下，转位到核内，STATl同体二聚体结合到IFN-诱导性基因的特异GAS序列并激活其表达。STATl同体二聚体的转录活性还可被MAP激酶特异作用，对其727位丝氨酸残基磷酸化而使活性加强。 最近才对I
27、FN-信号的负调节作用有所了解，在某些细胞中，如T细胞，IFN-能通过抑制IFNGR2的mRNA和蛋白质的表达来降低细胞对IFN-敏感性，但敏感性降低是否也在其他细胞类型中存在尚不清楚，受IFN-作用被活化后的IFNGRl亚基即迅速脱磷酸化，虽然还没有资料显示IFN-受体与特定的磷酸酶相连，但受体的脱磷酸化可能是由细胞通用磷酸酶作用的结果，IFN-以及几类其他细胞素能诱导称为SOCS/JAB/SSI的蛋白家族的表达，这些蛋白可与JAKs结合并抑制其活性，这一工作揭示细胞素通过诱导抑制JAK活性的蛋白的合成使细胞脱敏感性，虽然这些蛋白在细胞内过度表达后表现出对IFN-诱导的生物学反应的抑制作用，
28、但还没有足够的信息来确定其作为酶或细胞素的特异性，自然，对这些新蛋白的研究将为了解JAKSTAT途径提供新的资料。 IFN-经JAK-STAT的信号传递途径及信号传递的特异性问题，通过对小鼠STATl基因敲除获得的突变体研究进行了生理性揭示。STATl突变小鼠表现出正常的组织和器官发育表型，能产生正常数量和分布的免疫细胞，并能繁殖后代，然而，这些小鼠的细胞对IFN-或IFN-都不能产生明显的生物学反应，在抵抗微生物和病毒的感染能力上表现出严重的缺陷，相反，体外激活STAT3和STATl表明，STATl突变的小鼠对一些其他的细胞素如生长激素、表皮生长因子(EGF)和白细胞介素(IL)-10的反应
29、并不表现出异常，综合起来，这些结果显示，在生理条件下，IFN-(多数情况下也包括IFN-/) 诱导的生理反应要求有STATI的参与，而且STATl的作用也主要局限于这一信号途径，因此推测，IFN-信号传递的特异性主要是由STATl两步过程的瞬时拓扑结构变化而产生的，第一步是将STATl结合到膜上被激活的受体所形成的特异接纳位点上，第二步是激活的STATl二聚体进入细胞核激活一系列细胞素诱导性基因的表达。STATl可能与其他转录因子反应来修饰其激活基因表达的能力，例如，IFN-依赖性诱导9-27基因的表达被STATl同体二聚体p48复合体与ISRE而不是GAS元件的反应来传递，此外，IFN-诱导
30、ICAM-l基因的表达也依赖STATl与转录因子Spl的反应，只有两蛋白都与DNA结合时基因才能表达。综上所述，IFN-对细胞类型特异基因的诱导至少可以部分解释为细胞特异的正负调控因子对STATl的作用加以修饰的结果。12 和干扰素途径响应IFN/的主要途径要求两受体亚基、两个JAKs，两个STATs和IRF家族的转录因子p48的参与，形成一个多亚基的复合体，目前勾画的IFN-/诱导的分子机制还比较粗略，只有对主要成员单独或彼此结合形成的三维结构加以分析，并在此基础上对这些结构加以操作，提示出对功能起关键作用的具体反应，才能精细了解IFN-/的信号传递过程。 IFN-/信号的大致过程包括5个主
31、要步骤:1)IFN诱导细胞后，胞外受体在IFN的驱使下形成二聚体，导致2)启动级联的细胞内酪氨酸磷酸化酶，使3)磷酸化的STATs形成二聚体，被激活后4)转移至核内，5)结合到特异的DNA序列上激活转录，目前对这一反应过程的起始部分了解得较多些，另外还了解了对IFN激活基因(ISGs)在IFN缺乏时的抑制原理，以及在IFN持续存在时对初始信号反应的负调节，除这一主途径外，IFN-/还行使几条其他的途径，尽管这些途径的生化证据很有说服力，但对其生理作用还知之甚少，很明显，不同的IFN-/亚型可以激活截然不同的辅助反应途径，其机理可能涉及图1所示不同的新途径。 目前从分子水平已经了解的情况，受体有
32、两个主亚基：IFNARl(旧文献称a亚基)和IFNAR2c(L亚基)，IFNAR2亚基细胞外侧的IFNAR2a结构域为可溶性的，IFNAR2b(也称s亚基)上带有一个短的可通过拼接改变的胞质域，当过量表达时，会产生主要的负作用活性，只有IFNAR2c在IFNAR2基因抑活了的突变细胞系中恢复IFN-/的信号过程，与IFN-/受体的情形相反，IFNARl和IFANAR2都不能单独与IFN-/结合，而当两亚基联合后则与IFN/具有很强的亲和力，一旦与IFN-/结合上，级联作用即开始启动，首先对预先联系在IFNARl上的Tyk2磷酸化，预先结合在IFNAR2c上的JAKl能对Tyk2磷酸化和将其激活
33、，激活了的Tyk2又反过来对JAKI磷酸化并使其进一步激活，Tyk2还起到一定的结构作用，因为在Tyk2无效的细胞中IFNARl的量较少，激活的JAKl和Tyk2负责对IFNARl中的Y466，STAT2中的Y690和STATl中的Y701依次磷酸化激活。2、干扰素诱导的抗病毒活性IFNs赋予细胞抗病毒作用是其基本的功能，也是其得以发现和研究的原因 IFNs对高等脊椎动物的生存至关重要，因为它们为抗御病毒的侵害提供了第一道防线，较免疫反应要早几小时至几天的时间，IFN-/和INF-受体缺损的小鼠对病毒的感染特别敏感，足见干扰素抗病毒作用的重要性，IFN诱导的抗病过程为对付不同的病毒，产生了多条
34、途径，也衍生了几种抗病机制，病毒复制的每一阶段似乎都受到IFN相应反应的抑制作用，包括侵入及脱衣壳(如SV40，反转录病毒)，转录(流感病毒、囊炎病毒)，RNA的稳定性(细小核糖核酸病毒)，翻译起始(呼肠孤病毒、腺病毒、牛痘病毒)，成熟与组装及释放(反转录病毒、囊炎病毒)。 IFN诱导的抗病毒机制主要有3条途径，既PKR(依赖dsRNA的蛋白激酶途径)、2-5A合成酶途径和Mx蛋白质途径，这3条途径的具体作用过程已经了解得比较清楚，可以归纳为图1所示。PKR途径：PKR(依赖dsRNA的蛋白激酶)是一种丝氨酸一苏氨酸激酶，在控制基因的转录和翻译中有多重功能，PKR通常是不活跃的，但一旦结合了d
35、sRNA，它便进入自主磷酸化和随后的不依赖dsRNA的底物磷酸化，PKR的N端为调节区，有两个保守的dsRNA结合基点(motif)，第一个基点含有与dsRNA结合的高度保守性氨基酸序列，与dsRNA结合，与PKR结合的dsRNA则没有序列上的特殊要求;C端为催化活性结构域，但这一活性在dsRNA结合前是封闭的，当N端基点上结合dsRNA后，可能通过蛋白质构型的改变，使C端的酶活性表现出来，活化的PKR能对蛋白质合成的起始因子elF2的a亚基磷酸化，导致elF2-GDP和循环因子elF2B形成无活性的复合体，使蛋白质合成迅速停止。 2-5A系统是一个多酶参与的IFN诱导系统，病毒dsRNA激活
36、2-5A合成酶，产生一系列短的2，5寡腺苷酸(2-5A)，2-5A再激活2-5A依赖性Rnase L，Rnase L的作用使大量单链RNA水解，由多个基因编码这些2-5A合成酶，在细胞的多个部位以不活跃的单体形式存在，2-5A与之结合后，诱导其形成同体二聚体的活性形式，RNaseL的活性是双向的，其N-端与2-5A的结合有关，C端为酶活性相关的结构域Rnase L活性由小分子激活的特性，为药物的设计开发提供了一个很好的突破，甚至哺乳动物的2-5A系统被克隆和转入烟草后，转基因烟草可以抗御几种不同的病毒。 Mx蛋白可由IFN诱导产生，相对分子质量7.0X1058.0Xl05，属于GTPase大家
37、系中的丰富性成员,Mx蛋白质在病毒转录及其他途径，干扰病毒的复制、抑制流感病毒和其他负链RNA病毒的生长，鼠源的核内Mxl蛋白抑制流感病毒、Thogoto及Dhori病毒，人的细胞质蛋白MxA抑制流感病毒，Thogoto，人副流感病毒等，但不抑制Dhori病毒。 值得一提的是细胞与病毒的斗争，几乎类似于道与魔的斗法，在细胞抗御病毒侵染的同时，病毒也对细胞的防御进行反击，这种反击不仅仅针对细胞的惯常防卫系统，也有特异针对IFN系统的反击方式，这种反击包括采用新的侵染机制和通过合成新蛋白来削弱或干扰细胞对IFN的响应，例如腺病毒就有一种联系RNA(VA RNA)，以VA RNA与PKR结合可以使其
38、不被激活，流感病毒通过利用细胞内的一种PRK抑制蛋白(分子伴娘hsp40)来抑制细胞对IFN的反应。3、干扰素的其他生理作用(1)抑制细胞生长，IFN能抑制细胞生长，这种活性参与其对癌症和感染的抑制作用，IFN对培养细胞表现出的抗增生作用对不同的细胞系差异很大，目前还未能鉴定出由IFN诱导产生的，直接参与抗增殖活性的基因产物，但IFN-a能针对细胞周期的控制体中的特异因子发生作用，包括c-myc，Prb，D3和cdc25A蛋白，来抑制细胞的增殖。(2)控制细胞凋亡，IFN在细胞对病毒或其他病源微生物的反应关键作用，还包括控制细胞的死亡这一最终层次上，IFN具有抑制或促进细胞凋亡的双重活性，发挥
39、哪种活性取决于细胞的分化状态等因素，例如IFN-便因血清存在与否和IFN-受体水平高低对人T细胞有促进增殖或促进死亡作用。 (3)IFN对免疫系统的作用，已知IFN几乎影响免疫反应的全过程，在IFN的大家庭里，IFN-起主要的免疫调节作用，它是由一组特定的免疫细胞(T细胞和原生杀伤细胞)在免疫响应和发炎刺激下产生并对免疫效应细胞产生作用的细胞素，IFN-/作对免疫的调节作用较严谨，它们主要为细胞抗御病毒感染提供多条机制来加强免疫反应。 总之，IFN对细胞的作用过程和功能是多方面的，这些功能的发挥借助信号传递过程和细胞因子的作用，对直接参与作用的蛋白质加以修饰，或者激活其活性或者抑制其功能来具体
40、表现出来，这些作用既有针对生理生化过程的，例如对酶蛋白的作用，也有针对基因表达的，例如对转录因子和蛋白质合成elF因子的作用，IFN的分子作用过程并不是单向的，IFN的诱导反应还反过来抑制细胞对IFN的敏感性，使其对过量的IFN的作用变得迟钝，病毒的致病作用与IFN诱导细胞的抗病作用也是一个互动性过程，某些病毒针对IFN的抗病机制发展出了特定的应对措施。 IFN作用的信号传递过程，尽管已总结出了被广为接受的模型，但这一模型中最基本的设想却受到最近研究发现的挑战，Siegel和Takaoka等近来对Fas和肿瘤坏死因子的研究显示，IFN受体在配体结合之前便以二聚体形式等待IFN的到来.鸡传染性法
41、氏囊病(IBD)本病在世界各地因造成严重经济损失，所以受到各国高度重视。我国自1979年广州、北京首先发现该病以来，迅速传播全国各地。由于该病引起雏鸡的免疫抑制，从而使病鸡对多种病原微生物更易感，容易继发新城疫、传染性支气管炎、大肠杆菌病、葡萄球菌病、慢性呼吸道病等，而且对多种疫苗接种的免疫应答能力降低，因此该病已成为目前危害养鸡业的三大主要疫病（ND、IBD、MD）之一。该病的发生有明显的季节性，多在春夏秋季发生，冬季发病相对少一些。在1989年，该病突然在全国呈爆发流行，发病率高，死亡率高，在一个养鸡场内每批鸡都发病，很难控制，但使用疫苗后，免疫效果非常好。发病鸡拉白色米汤样及绿色稀薄粪便
42、，脱水严重，病变法氏囊出血呈紫色葡萄状或肿大内部出血外部有绿色胶冻样物，死亡率高，造成很大的经济损失，呈现一时的“恐慌”。广大禽病工作者，对该病进行了大量试验研究，在病原方面各地分离鉴定了多株野毒，还进行了血清亚型的研究，证实了亚型的存在和危害，并初步证明我国有超强毒株存在。对病毒结构蛋白的分析和抗原特性的研究，初步揭示了野毒株和标准毒株之间的差异，从而探索了某些弱毒疫苗效果欠佳的原因。对病毒遗传变异的分析以及利用核酶剪切病毒的RNA等使对该病毒的研究提高到分子生物学的水平。在诊断技术的改进和提高方面，建立了多种免疫血清学方法，如北京兽医试验诊断所和广西兽医研究所的传染性法氏囊病酶联免疫吸附试
43、验(ELISA)诊断试剂。还研制成中和性单克隆抗体和核酸探针等，为该病毒抗原或抗体的检测提供了先进的测试手段。在免疫预防方面，目前国内市场上已有多种不同毒力的弱毒疫苗和灭活疫苗，为正确地选择适当的疫苗和安排合理的免疫程序进行了大量试验研究，在研究和应用更为实用有效的双价或多价弱毒疫苗方面，获得良好的免疫效果。在使用疫苗时要弱毒苗和中等毒力疫苗交替使用，或先使用弱毒苗然后再使用中等毒力疫苗对预防强毒法氏囊病毒的感染非常好。蛋种鸡或肉种鸡在一生中要免疫两次油乳剂灭活苗，使小雏鸡在早期有母源抗体的保护，减少发生传染性法氏囊病。在防制该病的流行中，各地相对都比较重视实施综合防制措施，在搞好环境卫生、净
44、化疫源、合理使用疫苗等措施上建立了一套较为有效的防制办法。. 鸡马立克氏病(MD)目前呈世界性分布，也是危害养禽业的三种主要疫病之一。我国1975年开始联合攻关，于1978年复制成功国际上广泛应用的HVT疫苗，1981年研制成同源弱毒疫苗“814”、CVI988和细胞游离毒的HVTF及二价苗等。近些年来常有HVT苗免疫失败的报道，其原因与存在高度致病的超强毒株、母源抗体干扰及其它多种影响免疫失败的因素有关。近年来在MDV的分子生物学研究方面取得了良好的进展。应用分子克隆技术成功地构建了MDV抗原和B抗原的表达载体，并在我国首次研究B抗原基因在大肠杆菌和昆虫多角体病毒中的表达及其生物学活性，探讨
45、研制MD基因工程疫苗的可行性。还以杆状病毒为载体，在昆虫细胞中表达了MDV的基因和B抗原基因，这种用重组DNA技术产生的和抗原基因，将有助于进一步研究该基因产物在MDV所致肿瘤发生及抗MDV免疫保护中的生物学功能。此外，研制成的MDV单克隆抗体和核酸探针，能区分不同型MDV，为该病的特异性诊断和疫情预测预报提供了先进手段。现在基本普及了细胞菌（液氮苗），单纯的使用冻干HVT疫苗保护率较低，选用疫苗时要尽量选质量好的CVI988液氮苗或含有CVI988及HVT的二价苗。前几年国内有的兽医生物制药厂生产的MD疫苗不过关，污染了网状内皮增生症病毒，造成网状内皮组织增生症的发病，损失非常巨大。还有从国
46、外引进的某种MD疫苗质量出现问题，导致谁家使用该公司的疫苗谁家的鸡发病，教训非常深刻，值得我们兽医界反省。. 鸡传染性支气管炎(IB)本病是由冠状病毒属传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道和泌尿生殖道疾病。在临床和病理上通常可分为呼吸型和肾病变型两类，IBV的血清型至少有30种之多。近二十年来，由荷兰从典型呼吸型毒株培育的52和120弱毒疫苗的普遍应用，呼吸型的流行受到一定程度的控制，但肾病变型的传染性支气管炎从1992年起，流行呈明显上升趋势，至今仍是养鸡中危害严重的疫病之一。由于不同血清型之间交叉保护性弱，从而给IB的免疫预防带来不少困难。我国近几年来从发病鸡群中分
47、离到多株肾病变型IBV，血清中和试验表明，与国外的肾型IBV(美国的G株和澳大利亚的T株)抗原性相似，而与IBV标准株抗原性不同。常规疫苗（52、）对肾病变型的流行几乎无效，Ma5可同时预防呼吸型传支也或预防肾型传支，最近六七年来28/86株对肾型传染性支气管炎的免疫效果较好，在发生该病时可以紧急免疫28/86疫苗，能大大减少发病率和死亡率。目前各地以肾病变型毒株制备的灭活疫苗虽有一定免疫效果，但其应用尚有一定局限性，且不断有变异的毒株出现，因此研制肾病变型弱毒疫苗已成为防制该病的重要课题。1997年江苏、青岛等地报道一种腺胃型传染性支气管炎，分离的病毒与-和-株单抗有明显的交叉反应，用分离毒
48、株试制成灭活苗免疫鸡群获得较好的保护效果。宝依特公司生产的腺胃型传染性支气管炎疫苗保护率高，免疫原性好，深受养鸡户的喜爱。针对IBV的致病型和血清型的多样性，进行毒株筛选，研制多价IB疫苗可望更好地解决其防制问题。IBV的分子病毒学和分子流行病研究也已有一定进展。蛋白形态多样性导致IBV的多种血清型，利用中和试验、HI试验、免疫酶法、单克隆抗体法、寡核苷酸指纹图谱、限制性片段长度多态性图谱和核酸序列分析都证实了病毒存在多种血清型和极大的变异性。. 禽流感（AI）我国对该病的重视和研究起步较晚，香港学者hortridge1975年月1980年10月从南方出口到香港的家禽(鸡、鸭、鹅)检疫中，从上万份材料中分离到586株病毒，分属62种血清亚型；1978年在辽宁丹东从17种不同的野鸟收集标本207份，在其中14种野鸟中分离到24株A型流感病毒；从173份野鸭中分离到9株A型流感病毒；郭元吉等1979年从鸭饮过的186份水标本中分离到58株禽流感病毒；1981年从17种野鸟的207份标分离到24株A型流感病毒；1980年广东卫生防疫站沈桂章从广东健康鸭中分离到8株A型流感病毒；徐为燕等1980年从南京健康鸭群中采集86份泄殖腔样品，分离到15株A型流感病毒。以上的分离株均为不致病的低毒力病毒株，未引起禽流感的流行。1992年陈伯伦、张泽纪从广东
