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1、牛血清白蛋白与核黄素荧光共振能量摘要：本文采用荧光光谱法尝试在弱碱性溶液中以BSA为给体，核黄素为受体，研究BSA与核黄素荧光共振能量转移情况。考察了缓冲溶液体系、BSA的浓度、反应时间等多种因素的影响。实验结果表明，在80L pH 7.43的Tris-HCl 缓冲液中，反应时间为8min，6.910-7mol/L CTMAB，核黄素的浓度为1.210-61.210-5mol/L范围时，其线性回归方程Fa/Fd =0.0863+0.0884C (10-6 mol/L)，相关指数和检测限分别为0.9973和2.610-8mol/L。该方法灵敏度高，为核黄素的测定提供了新的方法。关键词: 牛血清白
2、蛋白; 核黄素; 荧光共振能量转移绪论血清白蛋白是人和动物血清中含量最丰富的一种蛋白质，与各种带正负电荷的物质及电中性物质均有一定程度的相互作用。各种药物进入体内首先与血清白蛋白结合，通过血浆的存储和运输，到达受体部位产生药理作用1。测定血清白蛋白的变化，可为疾病诊断、疗效观察提供有价值的资料及数据。因此，从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性小分子间的相互作用，对了解药物的作用机制具有重要意义。通过对荧光光谱的研究，可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息，同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。目前已有多篇文献采用荧光光谱法研
3、究药物分子如槲皮素3甲基硫菌灵4等与血清白蛋白的相互作用。核黄素(Riboflavin, RI)又称维生素B2，是人体必需的13种维生素之一，具有促进发育和细胞的再生；促使皮肤、指甲、毛发的正常生长；消除口腔内、唇、舌的炎症；减轻眼睛的疲劳增进视力，协助代谢碳水化合物、脂肪、蛋白质等多种功能。同时还具有利尿消肿防治肿瘤，降低心脑血管病的发生等保健功效。荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将给体激发态能量转移到受体激发态的过程。发生FRET需要几个条件：供受体在空间上比较接近(1
4、10nm)；供体的荧光量子产率较高；供体的发射光谱与受体的吸收光谱要重叠;供、受体的发射光谱要足够分开5, 6。目前，荧光共振能量转移技术已应用于无机离子的测定7,8，维生素的测定9,10，蛋白质分析11以及作为核酸荧光探针的研究等诸多领域。本文采用荧光光谱法尝试在弱碱性溶液中以BSA为给体，核黄素为受体，研究BSA和核黄素荧光共振能量转移情况。1 实验部分1.1 仪器和试剂F-4500型荧光分光光度计（日本日立公司, 配有R3896型红敏光电倍增管10mm标准石英池）；PHS-3CT型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）；牛血清白蛋白(Amresco. 0930, 分子量: 67000)；核黄
5、素(中国药品生物制品检定所)，pH = 7.43的Tris-HCl 缓冲溶液，配制1. 010-4mol/L 的BSA 标准溶液，6.010-4mol/L核黄素标准溶液，两种标准溶液均在04冰箱中保存。实验所需浓度由此稀释而得。Tris，HCl，NaCl均为分析纯；水为双重蒸馏水。1.2 实验方法在10mL比色管中加入80L pH=7.43的Tris-HCl缓冲溶液，60L浓度为1.1510-4 mol/L CTMAB溶液，100L 浓度为1.010-4mol/L BSA，一定浓度的核黄素溶液，定容到10mL，放置8min，在荧光分光光度计上，以295nm为激发波长，测定Fa 和Fd，计算Fa
6、/Fd，做标准工作曲线。2 结果与讨论2.1 FRET的构建BSA与核黄素的荧光能量转移的首要条件就是给体的发射光谱和受体的吸收光谱要有相当程度的重叠12。在实验条件下，BSA的荧光峰 ( 350 nm)与VB2的吸收峰 ( 375nm)有较好的重叠。这样就为BSA和VB2的能量转移提供了前提条件。用波长为295nm去激发BSA和VB2的混合体系，既可以保证BSA有较大的发射，而VB2又不会被激发，使能量转移效果好。实验中观察到，在混合体系中，给体在295nm处的荧光峰比单独存在时明显下降，而VB2的荧光峰比单独存在时明显增强，这充分说明了在这两种物质间确实发生了荧光能量转移 (图1)。加入N
7、aCl溶液时对于体系，BSA荧光强度减小不明显，VB2 的荧光强度增大不明显，说明离子强度对体系影响不明显；加入CTMAB时BSA荧光强度减小明显，VB2 的荧光强度增大明显，且荧光峰位均没有变化，也就是说CTMAB对体系荧光共振能量转移的影响明显。图 1BSA-VB2荧光共振能量转移光谱图1: BSA, 2: VB2, 3: BSA+VB2, 4: BSA+VB2+NaCl, 5: BSA+VB2+CTMAB2.2 影响FRET的主要因素2.2.1 考察酸度对体系的影响. 在激发波长为295 nm条件下，测定了不同pH的缓冲溶液对荧光强度的影响。由实验结果发现，在BSA和VB2的浓度分别为2
8、.010-6mol/L和1.210-5mol/L的条件下，pH 值为7.43，用量为80L时Fa/Fd最大，所以本实验选用Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.43，用量为80L，见图2和图3。图2 PH值的影响 图3 缓冲溶液浓度的影响2.2.2 考察CTMAB浓度对FRET体系的影响在激发波长为295nm条件下，测定了不同浓度的CTMAB对荧光强度的影响，实验结果发现用6.910-7mol/L的CTMAB时Fa/Fd最大，所以本实验的最佳CTMAB的浓度为6.9 10-7mol/L，见图4。图4 CTMAB浓度的影响BSA: 2.010-6 mol/L; VB2: 1.210-5mol /
9、L; Tris-HCl: 80L pH =7.432.2.3 考察时间对FRET体系的影响以激发波长为295 nm的波长激发，BSA和 VB2的浓度分别为2.010-6mol/L和1.210-5mol/L的条件下，测定不同时间对体系的影响，经实验发现在实验反应8min 时Fa/Fd最大（图5），所以本实验选用的反应时间为8min。图5 反应时间对FRET的影响BSA: 2.010-6 mol/L; VB2: 1.210-5mol/L; CTMAB: 6.910-7mol/L; Tris-HCl: 80L; pH =7.432.2.4 考察BSA浓度对FRET体系的影响在10 mL比色管中加入8
10、0L pH=7.43的 Tris-HCl 缓冲溶液，60L浓度为1.1510-4 mol/L的CTMAB溶液，200L浓度6.010-4mol/L的VB2，一定量的BSA溶液，定容到10mL，放置8min，在荧光分光光度计上，以激发波295nm测Fa和Fd，如图6所示，实验数据表明当BSA的浓度增大时，VB2 的荧光强度逐渐增强，说明在BSA与VB2 之间确实发生了共振能量转移；当BSA的浓度大于1.010-6 mol/L时继续增大BSA的浓度对VB2 的荧光强度没有明显的效果。因此本文的BSA的浓度为1.010-6 mol/L。图6 BSA浓度的影响From1 to 10, the conc
11、entration of BSA was 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.010-6mol/L, VB2: 1.210-5mol/L, CTMAB: 6.910-6 mol/L, PH=7.43.2.2.5 考察VB2浓度对FRET体系的影响在10 mL比色管中加入80L pH=7.43的Tris-HCl 缓冲溶液，60L浓度为1.1510-4 mol/L CTMAB溶液，100L浓度1.010-4mol/L核黄素，一定量的核黄素溶液，定容到10mL，放置8min，以激发波长295nm测Fa和Fd，如图8所示。当VB2 的浓度由1.
12、210-6 mol/L逐渐增大到1.210-5 mol/L时BSA的荧光强度逐渐降低，核黄素VB2 的荧光强度逐渐增大，也就是说随着VB2 的浓度逐渐增大，给体和受体间的能量转移效率不断提高，且Fa/Fd与VB2 的浓度之间存在良好的线性关系（图8）。图7 VB2浓度的影响From 1 to 10, the concentration of VB2 was 1.2, 2.4, 3.6, 4.8, 6.0, 7.2, 8.4, 10.8, 12.010-5mol/L, BSA: 1.010-6 mol/L, CTMAB: 6.910-6 mol/L, PH=7.43.图8 工作曲线2.2.6 牛
13、血清白蛋白周围VB2分子数目的确定设1个牛血清白蛋白 (给体，用D表示)可同时与n个VB2 (受体，用A表示)分子发生有效的荧光共振能量转移，则它们之间的关系可表示为：DnA Dan，若固定牛血清白蛋白的浓度，改变VB2的浓度，随着VB2浓度的增加，由于荧光共振能量转移，牛血清白蛋白的荧光强度不断降低，而的荧光强VB2 浓度不断增强。当这种此消彼涨的变化进行到一定程度后，若VB2继续增加的浓度，由于“配位”饱和，则牛血清白蛋白和VB2的荧光强度不再发生明显的改变。以荧光强度为纵坐标，VB2和牛血清白蛋白的浓度之比为横坐标作图，采用两边切线外推，交点的横坐标即为n值。本文分别以VB2和牛血清白蛋
14、白的荧光强度对CVB2/CBSA作图(图9)，交点即n值约为10，表明在胶束介质中，能量转移是在1个给体与10个受体分子之间进行的。图9 荧光强度与CVB2/CBSA之间的函数关系BSA:1.010-6mol/L, CTMAB: 6.910-7 mol/L, VB2:1.2, 2.4, 3.6, 4.8, 6.0, 7.2, 8.4, 10.8, 12.0 10-6mol/L, pH=7.43.3 结论研究了在CTMAB胶束介质中，以牛血清白蛋白为给体，VB2为受体的能量转移体系。并考察了牛血清白蛋白的浓度及体系酸度等对测量结果的影响。基于一定浓度范围内，建立了能量转移在偏碱条件下测定的方法。
15、该方法可用于偏碱条件下能量转移的测定，结果令人满意，拓宽了能量转移的应用范围。参考文献1 葛可佑, 翟凤英, 阎怀成, 等. 九十年代中国人群的膳食与营养状况J. 营养学报, 1995, 17(2): 123-134.2 王妙云, 叶蔚云, 蒋翠萍, 等. 光黄素荧光法测定食物中的核黄素J. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(3): 81-86.3 李崇福, 张克荣, 崔世勇, 等. 示波极谱法测定食品中的核黄素J. 中国公共卫生, 2000, 16(3): 259-259.4 王琼娥, 庄惠生, 张帆, 等. 测定核黄素的化学发光新方法J. 分析化学研究简报, 1998, 26(1):
16、85-88.待添加的隐藏文字内容15 梁菊, 陈攀, 吴文澜, 等. 荧光共振能量转移新技术及其在药物筛选中的应用J. 中国药学杂志, 2009, 44(13): 78-80.6 刘玲芝, 刘志洪, 何治柯, 等. 量子点FRET的新发展J. 化学进展, 2006, 18(2): 45-48.7 Li J, Mei F, Li W Y, et al. Spectrochim. Acta . 2008, 70, 811.8 王富强, 李亚明, 刘军等. 含均二苯乙烯荧光探针的合成及其对金属离子的识别研究J. 化学学报, 2008, 66(1):103-107.9 Bhattar,S.L., Ko
17、lekar,G.B., Patil,S.R.J. Fluorescence resonance energy transfer between perylene andriboflavin in micellar solution and analytical application on determination of vitamin B2J. Lumin. 2008, 128, 306-310.10 Xu,H., Li,Y., Liu,C.M, et al. Fluorescence resonance energy transfer between acridine orange an
18、d rhodamine 6G and its analytical application for vitamin B12 with flow injection laser-induced fluorescence detectionJ. Talanta 2008,77,176-181.11 Wei, Q. D., Lee, M. K., Yu, X. B., et al. Development of an open sandwich fluoroimmunoassay based on fluorescence resonance energy transferJ. Anal. Bioc
19、hem. 2006, 358, 31-37.12 陈国珍, 黄贤智, 许金钩, 等. 荧光分析法 (第2版) M . 北京: 科学出版社, 1990, 222-232 .致 谢首先向我的指导老师 致以诚挚的谢意。在做论文的过程中，给予我大量的指导和细致的关怀。老师学识渊博，治学严谨，待人热情、宽容。在老师的耐心指导下，我不仅学到了扎实的专业知识，也在怎样做人处事等方面收益颇多。在此我谨向老师表示衷心的感谢和深深的敬意。真诚感谢我的同学 在实验中对我的支持和帮助，才使我能够顺利地完成了实验的所有内容，同时也让我懂得了团队精神的重要性。同时，我也要感谢在座各位老师，你们让我学会了理论知识和社会知识，这对我是受益终生的。另外，感谢我的母校宿州学院及化生学院领导给我们提供的良好学习环境和生活环境，使我的大学生活丰富多彩，为我的人生写下精彩的一笔。再次深深感谢所有给予我关心和帮助的人们！
