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1、（2-羧乙基）壳聚糖的制备及其抑菌性能第28卷第9期2011年9月应用化学CHINESEJOURNALOFAPPUEDCHEMIsTRYV01.28Iss.9Sep.2011季铵化,D-(2一羧乙基)壳聚糖的制备及其抑茵性能蔡照胜孙岳明杨春生朱雪梅(.东南大学材料科学与工程学院南京211189;盐城工学院化学与生物工程学院盐城)摘要以缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMA),缩水甘油基三乙基氯化铵(GTEA),缩水甘油基三丙基氯化铵(GTPA),缩水甘油基三丁基氯化铵(GTBA)和缩水甘油基二甲基苄基氯化铵(GDMBA)等活性季铵盐为季铵化试剂,对N,0-2一羧乙基壳聚糖(N,0-2一CEC)进行了
2、化学改性,得到了系列季铵化N,O一2一CEC(QCECs);用电位滴定法测定了QCECs的季铵化度(DQ),分光光度法测定了N,0-2一CEC和QCECs的等电点(pH);用琼脂平板法测定了N,0-2一CEC及其季铵化衍生物对金黄色葡萄球菌(S.aureu)和大肠杆菌(E.coli)的最低抑菌浓度(MIC值),并根据N,O一2一CEC及其季铵化衍生物对这2种微生物的MIC值评价了它们的抗菌活性.结果表明,实验条件下得到的QCECs的DQ值在51.3%一59.1%间;,0-2-CEC及其季铵化产物的等电点在6.447.30间,且季铵基团的引入会导致pH.增大;除GTMA改性N,O一2一CEC的产
3、物外,其它QCECs的pH随其季铵化度提高都有所增大;,0-2.CEC和QCECs对Saurell和正coli均具有抗菌活性,且QCECs的MIC值均低于N,0-2一CEC的MIC值;同时,季铵基团中烃基碳数的增加及二甲基苄基结构的存在可提高QCECs的抑菌能力.关键词N,O一(羧乙基)壳聚糖,季铵化改性,等电点,最小抑菌浓度中图分类号:0636.1文献标识码:A文章编号:1000-0518(2011)09-1017-05DOI:l0.3724/SP.J.1095.2011.00489N,O一(2一羧乙基)壳聚糖(N,0-2-CEC)是壳聚糖(CTS)由3一氯丙酸进行羧乙基化改性得到的衍生物,
4、在废水处理,药物控制释放和食品保存中有重要应用l引.但由于羧烷基壳聚糖在水溶液中更多地呈现阴离子高分子电解质的特征,使其应用受到一定限制.用季铵化试剂改性N,O一羧甲基壳聚糖(,OCMC)已有报道H.由于N,0-2一CEC的结构类似于N,0.CMC,因此对其进行季铵化改性,可以得到分子中既有羧基,又有季铵基团的两性高分子电解质季铵化羧乙基壳聚糖(QCECs).作为壳聚糖的一种新型衍生物,QCECs不但对金属阳离子有较强螯合力,而且对表面呈负电性的微生物细胞膜也有很强结合能力,可使QCECs有典型季铵盐的抑菌性能.因此,CEC的季铵化改性对进一步拓宽壳聚糖在生物材料领域的应用有重要价值.本研究对
5、N,O一(2-羧乙基)壳聚糖(N,0-2一CEC)进行了季铵化改性,测试了它们在水溶液中的等电点和抑菌性能.与文献刮相比,本研究通过对壳聚糖衍生物在水溶液中等电点行为的考察,可以更好地确定这些壳聚糖衍生物的典型应用条件;同时,通过季铵基团结构对QCECs抑菌性能影响的研究,可以为有选择性地对N,0-2.CEC进行季铵化改性以制备高抑菌活性的壳聚糖基生物材料提供指导.由CTS制备QCECs的反应式如Scheme1所示.N0-2.CEC2010-08-23收稿,201010-30修回国家973基础研究项目资助(2007CB936300);江苏省自然科学基金项目资助(BK2009293)通讯联系人:
6、孙岳明,教授;Tel:025-83792637;Fax:025-52090621;Email:sun;研究方向:光电功能材料,线性光学材料及天然高分子化学利用应用化学第28卷-OR-/ORzOR,/_ORQCECsScheme1SynthesisofcarboxyethylchitosanandquatemizedcarboxyethylchitosanR=HorCOCH3;R=CH2CH2COOH;R=CH2CH(OH)CH2NRlR2R3C1;QCECl:Rl=R2=R3=CH3;QCEC2:R1=R2:R3=CH2CH3;QCEC3:Rl=R2=R,=CH2CH2CH3;QCEC4:Rl
7、=Rs=CH2CH2CH2CH3;QCEC5:RJ=R2=CH3,R3=CH2C6H51实验部分1.1试剂和仪器N,0.2一CEC参照文献1制备,羧乙基化度(DS)为72.3%(PH滴定法测定),质均相对分子质量(Mw)为3.4710;环氧丙基三甲基氯化铵(GTMA),环氧丙基三乙基氯化铵(GTEA),环氧丙基三丙基氯化铵(GTPA),环氧丙基三丁基氯化铵(GTBA)和环氧丙基二甲基苄基氯化铵(GDMBA)水溶液:均参照文献4,6-7方法制备,其含量分别为49.56%,53.13%,51.83%,54.19%和55.27%(离子色谱法测定);其它试剂均为分析纯.DDS-11A型数字电导率仪(上
8、海伟业仪器厂);Water-208型凝胶渗透色谱仪(美国Waters公司);PHS-3C型精密pH计(上海日岛科学仪器有限公司);NicoletIR.360型FfI一IR光谱仪(美国),KBr压片法;DRXS00和AV300型NMR谱仪(瑞士BRUKER公司),D:O溶剂,TMS内标;UV-9200型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司).1.2季铵化,D-(2-羧乙基)壳聚糖(QCECs)的制备室温下将N,0-2-CEC溶于蒸馏水中后,再在30min内缓慢滴加计量的环氧丙基三烷基氯化铵溶液,并不断用NaOH溶液调节物料pH值至9.0左右,水浴加热80.0oC反应24.0h.用稀盐酸调节物
9、料pH值至2.0左右继续反应2.0h.物料经浓缩后,搅拌下按体积比1:8加到无水乙醇中,析出大量絮状物.抽滤,无水乙醇浸泡并研磨(反复3次),得粒状或纤维状固体,真空干燥器中干燥,得QCECs.将QCECs样品溶于双蒸水中,充分搅拌形成均一溶液;向溶液中滴加标准AgNO溶液,作出QCECs溶液电导率随标准AgNO,溶液量的变化曲线,根据电导率达最低值时对应的AgNO,溶液体积,用下式计算QCECs的季铵化度DQ.DQ(%)=帚x100(1)式中,为AgN()3标准液的浓度(moVL):203为乙酰氨基葡萄糖单元(GIcNAc)的相对分子质量(g/too1);42为GlcNAc与氨基葡萄糖单元(
10、GlcN)的相对分子质量之差(g/too1);DS为N,0-2一CEC的羧乙基化取代度;为酸式羧乙基的相对分子质量(g/mo1);m为测定季铵化度的QCECs的质量(g);为QCECs中季铵基团的相对分子质量(g/mo1);V1为QCECs溶液电导率达最低值时对应的AgNO.溶液体积(L);为滴定蒸馏水并使其电导率达最低值时对应的AgNO,溶液体积(L);DD为壳聚糖的脱乙酰度.用GPC法测定QCECs的重均分子量,测定条件:凝胶色谱柱,TSKgelG3000PWXL(300mm7.8ram);0.7%NaSO水溶液为流动相,流速0.5mlMmin;柱温30;进样量为20;相对分子质量标准为系
11、列标准葡萄糖.1.3等电点的测定等电点反映两性电解质在水溶液中以偶极离子形式存在时所对应的pH值,在溶液的pH值与两性电解质的等电点相等时,两性电解质在水溶液中的溶解度最小,其混悬液在540nm波长处出现最大吸收(ABS).称取0.10gN,0-2-CEC或其季铵化产物,分别溶于50mL蒸馏水中,磁力搅拌下用0.10mol/L的盐酸调节pH值至3.0左右.用0.10mol/LNaOH溶液滴定,并精确测定溶液的pH值,测定该pH值时溶液在540nm的吸光率(ABS)值,做ABS-pH曲线,曲线上ABS最高值时对应的pH值即第9期蔡照胜等:季铵化N,O-(2?羧乙基)壳聚糖的制备及其抑菌性能为壳聚
12、糖衍生物的等电点(pH).1.4最小抑菌浓度测定用琼脂平板法测定N,0-2一CEC及QCECs对E.coli和S.aureus的最小抑菌浓度(MIC).将样品溶解并配制成浓度(w/v)为o.5g/L溶液,121oC下灭菌30min;按2倍稀释法或l0倍稀释法将溶液加到营养肉汤中,并制成营养琼脂平板.将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种在营养琼脂平板上,37下孵化48h;通过菌落数的变化确定MIC值.2结果和讨论2.1QCECs的波谱表征N,0-2一CEC和QCECs的FI1一IR图见图1.其中QCEC1,QCEC2,QCEC3,QCEC4和QCEC5分别为GTMA,GTEA,GTPA,GTBA和
13、GDMBA为季铵化试剂改性N,0-2一CEC生成的产物.在N,0-2一CEC的FrIR图中,1569和1411cm处为羧酸基(一CO)的吸收峰.在QCEC1QCEC5的FT?IR图中,反映一CO的吸收峰分别出现在1571和1409cm,1569和1410cm,1572和1413cm-.,1571和1411cm,1570和1414cm处;同时,QCEC1QCEC5分别在1457,1455,1460,1461和1453cm出现了反映引进的季铵基团中甲基CH弯曲振动吸收峰.这说明QCEC1QCEC5是一种既有羧基又有季铵基团的两性壳聚糖衍生物./cnl图1N,0-2一CEC和QCECs的FTIR图F
14、ig.1FI-IRspectraofN,O一2一CECandQCECsN,0-2一CEC及QCECs的HNMR分析结果及其归属见表1.由表1也可知,QCECs是一种既有2一羧乙基,又有含羟丙基的季铵基团的壳聚糖衍生物.表1N,0-2.CEC及QCECs的HNMR分析结果及归属Table1HNMRresultsofN,0-2-CECandQCECsandtheirascriptionsCompoundChemicalshift8/1061.95(CH3C0NH一),2.272.44(NcH2CH2CO2H),2.59(0一CH2CH2C02H),2.90(SNC2H),3.204.1(SNC3,
15、C4andC5H,NCH2CH2CO2H),4.41(SNClH,0一CH2CH2CO2H)3.15(CH3),2.29,2.93(NCH2CH2CO2H),2.4o2.55(CH2CH(OH)CH2,SNC2H),3.593.80,3.85-4.1(CH2CH(OH)CH2,0一cH2CH2CO2H)1.49(CH3CH2),2.51(CH2CH(OH)CH2,SNC2H),2.97(NCH2CH2C02H),3.643.91,3.954.2(CH2CH(OH)CH2,0一cH2CH2CO2H)QCEC31.49(CH3CH2CH2),2.202.70(CH2CH2CO2H,SNH),2.8
16、03.20(CH3CH2CH2,CH2CH2CO2H),3.204.20(CH2CH(OH)CH2,0一cH2CH2CO2H,SNH),1.902.10(CH3cONH)QCECA1.45(CH3CH2CH2CH2),2.92(CH2CH2CO2H),2.45(CH2CH(OH)CH2),3.253.70,4.204.50(CH2Crt(OH)CH2,CH2CH2CO2H)QCEC56.97(ArH),4.2-4.5(ArCH2,CH2CH2CO2H),2.64(CH2CH(OH)CH2),2.92(CH2CH2CO2H),3.343.39(CH2CH(OH)CH2)?Denotedtheca
17、rbonofHsituation.N?orO-denotedthesubstitution0ccudinNor0atomofchitosan.respectively.SNdenotedthesugarunit.2.2QCECs的季铵化度,等电点和其最低抑菌浓度壳聚糖衍生物的季铵化度,等电点及MIC值测定结果见表2.由表2可知,N,0-2一CEC中引进季铵基团得到的QCECs,其pH_ep值相对于N,0-2一CEC均有一定提高,且除QCEC1外,QCECs的季铵化度越高,其pHi.值越大.这是由季铵基团引进到N,0-2一CEC中,所得产物带有更多的正电性基团,要使相应产物在水溶液中形成偶极离子
18、,就需更多的羧基转化为-co;造成的.QCEC1的DQ值最高,而pH卸值C2CC应用化学第28卷相对较小的原因可能与GTMA的季铵结构空间位阻小,在N,0-2一CEC的季铵化过程中主要进行了氨基或胺基的季铵化,而氨基或胺基上引进了含羟丙基结构的季铵基团后会增强N的给电子性有关.表2壳聚糖衍生物的羧乙基化度,季铵化度,等电点及MIC值Table2DQ,pHkpandMICvaluesofchitosanderivatives由表2还可知,与文献5报道的季铵化羧甲基壳聚糖(QCMC)相类似,N,0-2-CEC和QCECs无论对S.aureus还是对Ecoli,均具有抑制活性,且对S.aureu.q
19、的抑菌活性大于对E.coli的抑菌活性,但QCECs的抑菌活性均好于QCMC;QCECs的抑菌活性优于N,0-2一CEC;在相同羧乙基化度和相近季铵化度时,季铵基团中烷基碳数的增加对提高QCECs的抑菌活性是有利的,且二甲基苄基的存在更有利于改善QCECs的抑菌活性,其原因可能与以下几方面因素有关.:1)羧乙基的亲脂性大于羧甲基,因而其对微生物结构中具有部分亲脂性的细胞膜的结合能力更好;2)N,0-2一CEC及其季铵化产物都能够螯合微生物生长过程中所必需的酶中某些微量金属离子,从而影响酶的活性并抑制微生物的生长;3)季铵化N,0-2一CEC中的季铵基团有利于其吸附于微生物带负电的细胞膜上,而且
20、其结构中的季铵基团与羧基在抗菌活性上存在协同效应,使季铵化N,0-2一CEC显示出更好的抗菌活性,这也使本研究中报道的QCEC2,QCEC3,QCEC4或QCEC5的抑菌能力,尤其是QCEC5的抑菌能力,明显优于文献5中报道的QCMC;4)S.aure是一种典型的革兰氏阳性菌,共细胞膜是由多孔的肽聚糖构成,外来分子进入细胞内相对较容易;而E.coli是一种典型的革兰氏阴性菌,其细胞膜是由肽聚糖内层和由脂多糖,脂蛋白及磷脂构成的外层组成,这种双层结构不利于外来分子进入;5)季铵基团中烃基碳数的增加可以增强季铵化N,0-2一CEC在细胞膜上的吸附能力,苄基的存在可以使季铵化N,0-2一CEC与微生
21、物的结合能力进一步提高,从而使微生物的正常活动更容易受到限制,并使微生物细胞膜更易破裂而引起其细胞内容物泄漏死亡.3结论壳聚糖经3.氯丙酸改性后生成的N,0-2-CEC及再用环氧丙基三烷基氯化铵季铵化改性的N,0-2一CEC(QCECs),无论对S.aureus还是对E.coli均具有抑菌活性,并且季铵化QCECs的抑菌活性优于,O-2一CEC;季铵基团中烃基碳数的增加以及二甲基苄基的存在更有利于改善季铵化N,0-2一CEC的抑菌能力.N,0-2一CEC经活性季铵化试剂改性后,生成的QCECs的等电点比N,O.2一CEC有一定提高.参考文献1CaiZhaosheng,SongZhanqian,
22、YangChunsheng,eta1.SynthesisofN,O?(2-Carboxyethy1)ChitosanandItsPropertiesfJ.JChemSocPak,2009,31(2):279-283.(2KoganGrigorij,SkorikYuryA,Ingrid2ianova,eta1.AntioxidantandAntimutagenicActivityofiv-(2-Carboxyethy1)chitosanJ.ToxicolAppIPharm,2004,201(3):303-310.3SkorikYuryA,GomesCarlosAR,VasconcelosMTer
23、esaSD,eta1.-(2?Carboxyethy1)Chitosan:RegioselectiveSynthesis,CharacterizationandProtolyticEquilibriaJ.CarbohydrRes,2003,338(3):271-276.4SunL/ping,DuYumin,FanIJhong,eta/.Preparation,CharacterizationandAntimiembialActivityofQuaternizedCarboxymethylChitosanandApplicationasPulpc印J.Polymer,2006,47(6):179
24、6.1804.5CaiZhaosheng,SongZhanqian,SangShibin,eta1.StudyontheFlocculatingPropertiesofQuaternizedCarboxymethylChitosanJ.PolymBu/,2007,59(4):655-665.第9期蔡照胜等:季铵化N,O一(2-羧乙基)壳聚糖的制备及其抑菌性能10216CAIZhaosheng,SONGZhanqian,YANGChunsheng,eta1.SynthesisofGlycidylTripropylAmmoniumChlorideJ.SpecPetrochem,2008.25(2)
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26、hemicallyModifiedChitinandChitosanasBiomaterialsJ.ProgPolymSei,2004,29(9):887-908.9BadawyMEI,RabeaEI,RoggeTM,eta1.SynthesisandFungicidalActivityofNewN,OAcylChitosanDerivativesJ.Biomacromolecules,2oo4,5(2):589-595.10RabeaEI,BadawyMET,StevensCV,eta1.ChitosanasAntimicrobialAgent:ApplicationsandModeofAc
27、tionJ.Biomacromolecules,20O3,4(6):14571465.11XieWenming,XuPeixin,WangWei,eta1.PreparationandAntibacterialActivityofaWatersolubleChitosanDerivativeJ.CarbohydrPolym,2002,50(1):35-40.PreparationofQuaternizedN,O-(2?Carboxyethy1)ChitosansandTheirAntibacterialActivityCAIZhaosheng.,SUNYueming.,YANGChunshen
28、g,ZHUXuemei(SchoolofMaterialsScienceandEngineering,SoutheastUniversity,Nanjing211189;DepartmentofChemicalandBiologicalEngineering,YanchengInstituteofTechnology,Yancheng)AbstractAseriesofamphotericpolymericelectrolytewaspreparedandtheirantibacterialactivitiesanddissolvingbehaviourinwaterwereinvestiga
29、ted.AseriesofquaternizedN,O-2一carboxyethylchitosaus(QCECs),whichexhibittypicalbehaviourasamphotericelectrolyte,wereobtainedthroughthechemicalmodificationsofN,0一(2一carboxyethy1)chitosan(N,0-2一CEC)by2,3-epoxypropyltrialkylammoniumchloridesincludingglycidyltrimethylammoniumchloride(GTMA),glycidyltrieth
30、ylammoniumchloride(GTEA),glycidyltripropylammoniumchloride(GTPA),glycidyltributylammoniumchloride(GTBA)andglycidyldimethylbenzylammoniumchloride(GDMBA).Substitutiondegreeofquaternization(DQ)ofQCECswasdeterminedbythepotentiometry,inwhichthevariationsofpotentialofsolutionwiththevolumeofAgNO3aqueoussol
31、utionweremeasured.Theisoeletricpoints(pHi.)ofN,0-2一CECanditsquatemizedderivativesweredeterminedbyspectrometrymethod.TheantibacterialactivitiesofchitosanderivativesincludingN,0-2一CECandQCECswereevaluatedaccordingtotheirminimuminhibitionconcentrations(MlCs)againstE.coli,atypicalGramnegativebacterium,a
32、ndS.auFeus,atypicalGrampositivebacterium,determinedbyagarplatemethod.DQvaluesofQCECswereestimatedintherangeof51.3%59.1%,thepHi.ofN,0-2一CECandQCECswereintherangeof6.447.30andtheintroductionofquaternizinggroupresultedintheaccretionofpHip.ExcepttheproductobtainedfromthemodificationofN,0-2一CECbyGTMA,the
33、pHi.pvaluesofallotherQCECsincreasedalongwiththeirDQcontents.AllN,0-2一CECandtheirquaternizedderivativesshowedimprovedantibacterialactivityagainstE.coliandS.aureus.TheMICvaluesofQCECswerelowerthanthoseofN,O-2-CEC.TheincreaseofcarbonchainlengthofalkylandthepresenceofdimethylbenzylinthequaternaryammoniumgroupscouldendowQCECswithmuchbetterantimicrobialactivity.KeywordsN,0一(carboxyethy1)chitosan,quaternizingmodification,isoeletricpoint,minimuminhibitionconcentration
