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1、附录： 短小芽孢杆菌菌株C2A1的毒死蜱降解及其降解产物3，5，6三氯2吡啶酚-摘要-从土壤中分离出的一种菌株C2A1能高度有效降解毒死蜱及其首要水解代谢物3,5,6 -三氯- 2 -吡啶（TCP）的。在形态学基础上，生理特性，生化试验和16S rRNA序列分析，应变菌株C2A1被鉴定为短小芽孢杆菌。应变菌株C2A1在毒死蜱降解过程中的降解作用在不同培养条件下进行研究，例如pH，接种密度，浓度存在的添加碳/养分来源和农药浓度。毒死蜱是作为应变菌株C2A1的唯一碳源，相当于葡萄糖，酵母提取物和营养液在体内的代谢作用。在毒死蜱作为降解菌株唯一的碳源、高pH环境（8.5）、高接种密度的条件下，毒死蜱
2、的降解率最大。在其他营养物质的存在时，毒死蜱的降解作用增强可能是由于菌种数量的高增长使毒死蜱更容易被降解从而增加了代谢物的量。该菌株C2A1显示在8天降解期内90的毒死蜱降解为TCP（300mg/L）。1.导言 农药被引入农业实现增加粮食以满足不断增长的全球人口的需求。现在使用农药已成为必然之恶，但这种做法是玩弄人类和混乱其他生命形式。应用农药残留在环境（空气，土壤，地下水和地表水）的持续周期较长1-3 。 由于长期持久性的有机氯农药（林丹，七氯，滴滴涕（DDT）等）及其生物蓄积和对非目标生物的潜在毒性，这系列的农药农药已经被残留相对较少，但持续有效的有机磷（OP）化合物所取代。虽然有机磷降解
3、速度比有机氯快，但是由于它们有能力抑制乙酰胆碱酯酶（AChE），这类杀虫剂具有急性毒性。乙酰胆碱酯酶可作为一种神经传递调节酶，可在交界处的突触降低乙酰胆碱的浓度。当AChE在突触灭活，例如通过一种有机磷农药，乙酰胆碱的浓度在突触的浓度仍然很高，肌肉或神经纤维持续发生刺激，最终导致衰竭和抽搐4。毒死蜱（O，O-二乙基- O -（3,5,6 -三氯- 2 -吡啶基）硫代磷酸酯）是一种被广泛应用的有机磷畅销杀虫剂，一个重要的经济作物害虫广谱杀虫剂。毒死蜱也可用于控制蚊患（幼虫和成虫），苍蝇，白蚁以及各种土壤和家庭害虫。毒死蜱在土壤中的半衰期通常是60至120天，但根据土壤类型，气候和其他条件也可以从
4、2个星期至1年以上 5。最初，降解农药在碱性土壤中所观察的现象是有关其在高pH值的水解。然而对几个高pH土壤进行消毒，观察到毒死蜱完全抑制水解，从而表明了土壤中微生物的参与6。后来，辛格等人证实了同样的结果7。 如何分离出具有毒死蜱降解能力的纯菌株，这一直是一个问题。这是因为生物降解有机磷农药对抗药性的增强。几个徒劳的尝试通过重复处理或富集土壤样品分离出了毒死蜱降解微生物系统8,9。一般来说，土壤的微生物反复或连续多次遇到人造有毒化学品的发展能力，以降低这些化学物质和微生物等演变特征与新问题，影响农药在土壤中的快速失活 10。毒死蜱生物降解过程中抗性增强的一个可能原因是毒死蜱水解产物3,5,6
5、 -三氯- 2 -吡啶（TCP）的毒副作用 11。 辛格等人12从澳大利亚的土壤中分离出6株毒死蜱降解菌显示了毒死蜱降解能力的加强。 除了这6株毒死蜱降解菌外，一株肠杆菌同样具有降解这种农药的能力。Li等人分离出一种能够将毒死蜱（100mg/L ）水解成3,5,6-三氯- 2 -吡啶（TCP）的鞘氨醇单属菌。 环境因素如基质的物理和化学特性，营养状态，pH值，温度和生物因素如接种密度会损害任何生物修复过程的完成14,15。据报道，假单胞菌在低pH值和较高有机质的土壤中降解阿特拉津的成功率较低16。而土壤的高pH在毒死蜱降解过程中起到重要的作用7。当接种物种能够降解污染物时，同样的接种量被确定为
6、影响生物修复农药污染点成功或失败的一个可能原因15。要去除农药污染点的污染推荐接种水平为106-108个/克土壤 14。然而，在一项类似的研究中，斯特拉瑟斯等17发现，农杆菌菌株的接种水平低至105个细胞/克土壤也足以迅速降解阿特拉津。农药浓度是生物修复失败的另一个原因18。辛格等19还研究了不同的环境对毒死蜱和苯线磷在土壤条件和水对的生物修复的影响，研究了这两种农药的降解菌株生物修复潜力。毒死蜱主要水解产物3,5,6 -三氯-2吡啶（TCP）的水溶性远大于毒死蜱，导致大规模土壤和水生环境的污染。TCP不仅持续微生物降解，而且由于其抗菌活性限制了毒死蜱的降解9,20,21。相对于TCP降解的重
7、要性，关于毒死蜱在环境中降解步骤的研究还是很少的。在本研究中，芽孢杆菌C2A1菌株不仅能够降解毒死蜱，而且还能分离TCP。生物降解不同浓度的农药毒死蜱和TCP的环境因素，如在根据不同的液体培养，研究媒体和pH值对分离菌株接种量的大小以优化该菌株降解毒死蜱的条件。这项研究旨在阐明一种污染环境中毒死蜱降解菌分离的可能应用.2. 材料和方法 2.1 化学品 分析纯毒死蜱标准品（98.4）来自Ehrenstorfer GmbH（德国）；工业级毒死蜱（95），来自巴中国化工，Lahore； Trichloropyridinol（TCP，99）购买自化学服务网站（Web Chester）。HPLC购买自默
8、克公司。所有使用的其他化学品购自Sigma - Aldrich公司，默克公司或BDH公司。2.2 富集，分离和菌株的选择 土壤样本从全国生物技术和基因工程NIBGE研究所棉花领域采集（如有关农药喷洒广泛）用于农药降解菌的富集，分别在30mg/L和60mg/L（毒死蜱）浓度进行富集。微生物在低盐浓度进行分离（MSM，pH值6.8-7.0），其中（g/L）磷酸氢二钠，5.8；磷酸二氢钾，3.0;氯化钠，0.5；氯化铵，1.0; 和MgSO4，0.25。大约20克的土壤被添加到50毫升含毒死蜱和MSM培养液中，用250毫升锥形瓶在室温下摇床（100转）培养。两周后，回收5mL培养液并移至新鲜的含毒死
9、蜱的培养液中（ 30mg/L和60mg/L）。此后，连续三次转移，进行了新的接种培养，每一次的接种量只有5毫升碳源MSM，每2-4周培养。通过定期增补，使整个实验无菌水水分含量保持在一定范围内。两个星期后，最后转移至10倍稀释的培养液和100 L的每个稀释的含有60mg/L毒死蜱营养琼脂平板（NA）。在NA平板上反复分离含毒死蜱降解菌的菌落，纯化毒死蜱降解菌。一旦所有分离纯化获得到，在含毒死蜱浓度为50mg/L的MSM培养基上培养，测试毒死蜱降解菌对毒死蜱的利用。同时，在37C和100转摇瓶培养，对毒死蜱降解菌在含毒死蜱的MSM培养基中增长状况进行监测。毒死蜱残留浓度在这个阶段利用高效液相色谱
10、法测定。 1株毒死蜱降解菌，指定C2A1，它具有最高的毒死蜱降解能力，被选定作为进一步研究毒死蜱降解。 2.3 分类鉴定的菌株 由威尔逊等人所描述的菌株，基因组总DNA的提取细菌菌株的描述为16S rRNA基因序列22。 16S rRNA基因的扩增采用通用引物，FD1（5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3;大肠杆菌，8月27日）和RP1（5 ACGGHTACCTTGTTTACGACTT - 3，大肠杆菌，1507至1492年）23。PCR产物的组成扩增16S rRNA基因片段，纯化QIAQuick自旋列（QIAGEN公司），并pTZ57R TA克隆载体克隆。在克隆载体转化大肠杆
11、菌Top10和质粒，通过使用核苷酸序列一Fermentas小量DNA纯化试剂盒获得。 2.4 接种的准备C2A1菌株培养在营养肉汤培养基中，用离心机4600转离心5min，用N-生理盐水（0.9NaCl溶液）清洗与灭菌， N -生理盐水菌悬液设定在OD590nm为0.7。菌落形成单位（CFU mL - 1）用稀释平板计数法测定。2%菌悬液被用来作为研究提到接种直到毒死蜱降解。 2.5 提取样本（农药残留的高效液相色谱分析）样品（5毫升）从培养瓶中提取，并用离心机7200转离心10min获得。毒死蜱和3,5,6 -三氯- 2 -吡啶（TCP）的残留量用二氯甲烷（DCM ）提取两次。 DCM的有机
12、层通入空气，在室温下充氮气蒸发。残留物溶解在高效液相色谱级乙腈（1毫升），然后通过flouroporeTM滤膜（0.45m FH）过滤，以去除颗粒。高效液相色谱法分析之前，这些样本如果需要稀释，农药和TCP的滤液浓度高效液相色谱法测定，参阅第2.6及培养基计算。 2.6 HPLC色谱条件与分析提取的样品与三元梯度泵配备1瓦里安高效液相色谱法分析，可编程可变波长紫外检测器，列烤箱，电取样阀和ODS2 C18反相柱。对农药残留进行了分析，采用梯度流动相为乙腈：水：乙酸如前所述24。进样量为20升，流动相的流速1mL/min,毒死蜱是在290nm和320nm波长检测。对毒死蜱和3,5,6-trich
13、loropyridinold 保留时间分别是15min和7.8min。 2.7 降解毒死蜱摇瓶研究工作进行了毒死蜱的最佳降解能力分离株，到目前为止，即C2A1.MSM（30毫升），其中50mg/L毒死蜱（作为碳源和能源的唯一来源）接种（接种2）与C2A1和37C和100rpm摇床上培养5天。在24小时的间隔，从培养基中回收样本无菌和农药残留浓度测定采用高效液相色谱法。利用MSM Uninoculated瓶含有50mg/L作为对照毒死蜱，进行了重复实验。降解菌株C2A1毒死蜱浓度高，即100mg/L时，200mg/L，300mg/L，500mg/L和1000mg/L，研究了500毫升含150毫升
14、MSM（一式两份）瓶。没有接种重复瓶则留作为对照。提取样本（10毫升）含24至100mg/L时，200mg/L和为300mg /L的降解期为10天。按例500mg/L和1000mg/L，每隔4天的降解期完成抽样。从农药残留中提取代表性的样品，高效液相色谱法测定农药定量分析已完成的2.6和2.5节所述。 2.8 替代效应碳源/营养素对毒死蜱降解的影响 葡萄糖，营养液和酵母提取物被用来研究营养素或替代碳源对应变C2A1降解毒死蜱能力的影响。最小盐中（30毫升）的葡萄糖，营养液和酵母提取补充（分别）和C2A1接种（一式两份）50mg/L毒死蜱。所有这三个营养分别被增添加在MSM无菌的1g/L的浓度。
15、该培养37C和100rpm摇床上和农药浓度的测定。细菌生长形成单位（CFU）也需监测。 2.9 接种密度对毒死蜱降解的影响 准备营养培养液，其中含有应变C2A1毒死蜱（50mg/L）。培养24小时后，培养基4600转离心5分钟，用N-生理盐水清洗灭菌和使N -生理盐水菌悬液的OD590nm为0.8。中止菌落形成单位测定及接种含有1.5 109 CFU/mL，1.5 107 CFU/mL和1.5 105 CFU/mL，加入适量的N -生理盐水准备。这些菌剂（2）被添加到含有50mg/L毒死蜱的MSM 1培养液。每隔24小时测定农药残留浓度。 2.10 pH值对毒死蜱降解的影响 三种不同的pH条件
16、下最小盐媒体还决定了C2A1对毒死蜱的降解能力，即酸性（5.5），中性（7.0）和基本（8.5）。磷酸氢二钠（5.8mg/L）和磷酸二氢钾（3.0mg/L）的比例混合，这样配制成MSM缓冲溶液（含氯化钠，0.5g/L;氯化铵，1g/L;和MgSO4，0.25g/L）。在pH 5.5，7.0和8.5，不同pH在含有毒死蜱（50mg/L）MSM培养液中对毒死蜱的降解作用。 2.11 3,5,6-三氯- 2 -吡啶（TCP）的降解 MSM培养液中不同浓度的TCP（100mg/L，200mg/L和300mg/L）于37C和100rpm摇床培养。经2,4,6,8天培养后用二氯甲烷提取TCP和残余TCP采
17、用HPLC法测定。3. 结果和讨论 3.1 毒死蜱降解菌的分离和特性 从NIBGE棉田采集土壤样品（已接触农药属于不同的化学类，即有机磷，氨基甲酸酯类，硝基胍和拟除虫菊酯），其中从毒死蜱富集土壤中分离出毒死蜱降解菌。培养基富集后，利用含毒死蜱营养琼脂平板分离出22株形态不同的菌株。MSM/琼脂平板含毒死蜱（40mg/L），以毒死蜱作为唯一来能源和碳源，来检测这些菌株对毒死蜱的利用能力。测试的22株菌株，有11 株菌株能在含有毒死蜱的MSM/琼脂平板上生长。将这些菌株接种到含有50mg/L毒死蜱的MSM中，于37培养。对农药利用的能力证实了高效液相色谱定量分析的农药残留. 两株C2A1和C2A2
18、能够在这个成长培养中3天之内利用69和74%的毒死蜱。在本研究中，应变C2A1（显示最高降解）在不同培养条件下毒死蜱降解的详细研究。 Aislabie和Jones25提出，细菌在该领域目前可以利用梯度农药作为生长基质，并在后续的应用中增强。这是由于微生物扩散和利用农药作为能源与碳源，增加了土壤中生物降解的能力。这种现象被称为生物降解农药的增强10,26。 3.2 应变菌株C2A1的鉴定琼脂平板菌落应变C2A1出现整个养分循环与凸海拔和（偶数）边缘。这株能游动，革兰氏阳性和小杆形。应变C2A1生化测试中描述表1。基因序列分析16S rRNA基因进行BLAST表明，菌株C2A1是短小。据我们所知，
19、这是对毒死蜱降解菌为短小芽孢杆菌，革兰氏阳性细菌的第一次报告。在此之前，有报道称短小芽孢杆菌能降解呋喃丹27和双酚A 28。表1生化短小芽孢杆菌C2A1特点。生化检验结果（1）过氧化氢酶阳性（2）明胶液化正（3）福格斯-普罗斯考尔正（4）糖的利用正（5）积极利用甘露醇（6）邻硝基苯基-半乳糖苷（糖苷）负（7）精氨酸dihydrolase（ADH）的负（8）赖氨酸脱羧酶（土）负（9）鸟氨酸脱羧酶（失聪）负（10）硫化氢（H2S）负（11）色氨酸脱氨酶二胺（TDA）负（12）吲哚负（13）利用柠檬酸负 3.3 短小芽孢杆菌C2A1降解毒死蜱短小芽孢杆菌C2A1降解毒死蜱研究表明，只有6毒死蜱降解，
20、农药在24小时之后，开始迅速降解。实验结束后，82%的毒死蜱实现降解只有9mg/L毒死蜱残留在培养基中。此外达到低浓度时，毒死蜱降解率显著下降，由于酶在高浓度时的表达。没有发现在未接种时就降解。这表明，毒死蜱降解是由于菌株C2A1。当暴露于高浓度毒死蜱，短小芽孢杆菌C2A1高效降解毒死蜱。在100mg/L，200mg/L和为300mg/ L的浓度，农药降解开始后，2，2和3天的潜伏期分别为73，83和87，添加的毒死蜱在10天内降解（图1）。在较高浓度，即500mg/L和1000mg/L，培养开始后第7天和第10天88和89的毒死蜱降解，分别天2个星期（未显示数据）。关于有报道微生物降解高浓度
21、农药丙线磷及其他类似29-31。不过有报道微生物能降解毒死蜱的最大浓度为250mg/L 12。据我们所知短小芽孢杆菌C2A1是首次报道能够降解高达1000mgL毒死蜱的菌株。在降解研究毒死蜱的浓度高，滞后期较长，观察与农药浓度的增加。 Karpouzas和Walker29提出，在高浓度时有较长滞后阶段，可能是因为需要更多的细菌数量启动迅速降解农药。生物降解可能开始缓慢，需要一个适应期，其后迅速降解。有人建议32，以固定生物量或低基板的水平，降解速率与底物浓度的残留是成正比的，不断下滑。图。 1。降解毒死蜱的短小芽孢杆菌菌株在最小的盐中（MSM）含有作为唯一碳源和能源的毒死蜱，其浓度100mg/
22、L的（），200mg/L的（）和为300mg/ L的（），和毒死蜱C2A1没有接种（）。3.4 替代效应碳源和营养物质对降解毒死蜱的影响 应变C2A1接种至含50mg/L毒死蜱的MSM培养基中，培养24小时后降解毒死蜱。它在5天内降解82农药，残留9mg/ L的毒死蜱。当酵母提取物，营养液和葡萄糖被添加到培养液中，细菌利用86，92和100，分别农药（图2）。在所有三个营养物质添加到培养液中，在24小时内降解近50毒死蜱。葡萄糖提高，在3天的毒死蜱降解潜伏期内毒死蜱降解率提高。这一结果与辛格等人先前的调查结果形成对比12，其报告说，毒死蜱降解菌利用其他碳源，3天后才开始利用毒死蜱。我们的研究结
23、果显示，芽孢杆菌倾向于利用毒死蜱，即使在营养丰富的环境中，毒死蜱仍作为主要的养分来源，其他营养物质只是补充辅助。这可能是因为芽孢杆菌中毒死蜱降解酶的所表达的结果，即使在其他碳源和能源充足的条件下。在这个实验没有观察到未接种的毒死蜱样本有明显的降解。图。 2。降解毒死蜱的短小芽孢杆菌菌株在最小的盐中（MSM）的含有碳源和能量的唯一来源的50mg/L毒死蜱C2A1（）和其他营养物质的存在，即酵母提取物（），营养肉汤（），葡萄糖（）和控制（）。在本实验中，监测细菌生长形成菌落单位。有人指出，CFU/mL在含有葡萄糖，营养液和酵母提取物的含毒死蜱培养基（分别）比在只以毒死蜱作为唯一碳源和能源的培养基中
24、搞（图3）。图。 3。短小芽孢杆菌C2A1（CFU）的增长在最小的盐中（MSM）的含有碳源和能量的唯一来源50mg/L毒死蜱（）和其他营养物质的存在，即酵母提取物（），营养肉汤（）和葡萄糖（）。3.5 接种密度对毒死蜱降解的影响 短小芽孢杆菌C2A1降解毒死蜱的所有三个初始接种密度的测试。按照最初的细胞浓度最高，即109 CFU/mL，培养基培养24小时内，毒死蜱降解迅速开始利用，似乎没有滞后期和培养5天后80以上毒死蜱被降解（图。4）。但在培养基接种密度较低，即105 CFUmL和107 CFU/mL的短小芽孢杆菌C2A1有较长的滞后期，培养第1天和第2天后分别开始降解毒死蜱，培养5天后分别
25、降解了50和72。一般来说，接种密度较小，导致在较长的滞后阶段后菜开始迅速降解毒死蜱。有人建议，驯化的异源物质降解期间所需的时间到一定程度，足以迅速降低异物33。相关的类似（如目前的研究发现）驯化的长度之间的时期，接种后观察培养液含2,4-D不同接种密度假单胞菌株BRI6001，1 2,4 - D的降解菌34。图。 4。短小芽孢杆菌菌株C2A1在不同接种密度降解毒死蜱，在最小的盐中（MSM）的含有碳和能量的唯一来源，50mg/L毒死蜱即1.5 105 CFU/mL （），1.5 107 CFU/mL（）和1.5 109 CFU/mL（）和未接种控制（）。 3.6 pH值对毒死蜱降解的影响pH值
26、是影响微生物降解异生物质能力的一个重要因素。在三个不同的pH条件下研究应变C2A1菌株降解毒死蜱能力，即酸性（5.5），中性（6.8）和基本（8.5）的50mg/L毒死蜱MSM培养基。短小芽孢杆菌C2A1显示，在所有的pH值（酸性至碱性降解）的测试。然而，观察到在酸性pH值有较长的滞后期降解近50。观察到在较高的pH值毒死蜱降解没有滞后期和在中性偏碱的情况下毒死蜱能更有效的被降解以及超过80的降解率（图5）。图。 5。短小芽孢杆菌C2A1在不同介质pH值降解毒死蜱，在最小的盐中（MSM）的含有碳源和能源的唯一来源毒死蜱（50mg/L），即5.5（），7.0（）和8.5（）和未接种控制（）。辛格
27、等人 7报道Enterobactor藻在高pH值迅速降解毒死蜱，在酸性pH值时则降解缓慢。然而，Karpouzas和Walker 30报道，两株假单胞菌株（EPI与EP）在基本培养基中（pH值为5.5到7.6不等）能够快速降解丙线磷农药。在本研究中，实现了高pH值时的最高降解率。这可能是由于一些负责毒死蜱降解活性的关键在高pH值时具有最佳酶解。 3.7 TCP的生物降解为了研究TCP（毒死蜱水解后第一代谢物）的生物降解，短小芽孢杆菌C2A1接种于含100mg/L时，200mg/L和300mg/L TCP的MSM培养基中。该菌株的代谢产物的利用高效液相色谱法分析证实。结果发现，添加的TCP（30
28、0mg/L）在8天培养过程中降解90（图6）。有人建议9 TCP和毒死蜱的水解，由于TCP的毒性作用，加强毒死蜱降解通常不会发生。但是，在目前的研究毒死蜱的降解和TCP都实现了同样的应变，这是一个罕见的发现。杨等人 35报道粪产碱菌都对毒死蜱和TCP（100mg/L）有降解能力。短小芽孢杆菌C2A1表明毒死蜱和TCP浓度高达为300mg /L，是该报告的3倍35。冯等人 36报告假单胞菌在液体培养基中可矿化TCP，但不是毒死蜱。由于TCP的抗菌特性，微生物降解TCP的观察和报告很少。可能，TCP的顽抗归因于存在3个氯原子的吡啶环在环被打破前删除了 21。在我们的研究中发现短小芽孢杆菌C2A1不
29、仅能降解毒死蜱，还能降解其主要代谢产物TCP。此外，在不同条件下研究生物降解毒死蜱（第3.5和3.6），没有TCP积累的发现表明，这种菌株都能有效的降解毒死蜱和TCP。图。 6。短小芽孢杆菌C2A1生物降解TCP在最小的盐中（MSM）的含有碳源和能量的唯一来源，其浓度100mg/L的（），200mg/L（）和为300mg/ L的（），而未接种控制（）。4. 结论目前的研究显示，在培养基中，接种密度和pH值变化影响短小芽孢杆菌C2A1对毒死蜱的降解。高碱性pH和接种密度必须实现此实验系统最大的降解率。短小芽孢杆菌菌株C2A1能够降解毒死蜱的pH范围广泛，在pH值低至5.5时也能降解毒死蜱。这是一
30、个有机体生物修复可变环境的重要特点。短小芽孢杆菌C2A1能够容忍1000mg/L高浓度的毒死蜱。另一个值得一提的重要特点就是这菌株能降解TCP。这种同一菌株复合降解化合物，降解毒死蜱是非常重要的，因为TCP一般是抗菌剂，如果没有退降解，将堆积在培养基中，通过分解产物，抑制微生物生长和产物降解。这里提供的信息可以用来优化田间降解条件。然而，生物修复土壤毒死蜱污染的研究工作仍在继续。鸣谢:作者感谢M.Afzal Ghauri博士和Kalsoom Akhtar，BPT公司的NIBGE给予进入他们的实验室测定的支持。参考文献:1 M.I. Tariq, S. Afzal, I. Hussian, N.
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