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1、本科生毕业设计（论文）题目 粗毛栓菌木聚糖酶的分离与纯化 姓名 XXX 学号 XXX 系 别 生命科学 专业 生物工程 指导教师 XXX 职称 教 授 年 月 日教务处制中文摘要：将粗毛栓菌木聚糖酶粗酶液经Sephadex G-150分子筛层析柱，最后通过活性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步分离纯化，获得具有木聚糖酶活性的组分。关键词 ：粗毛栓菌, 木聚糖酶 ,分子筛层析，活性聚丙烯酰胺凝胶电泳 Abstract： The crude enzyme from wheat straw culture of Trametes gallica Fr. was applied to Sephadex G-
2、150 gel filtration. A component with xylanase activity was finally obtained by native polyacrylamide gel electrophoresis.Key words： Trametes gallica Fr.，xylanase， Sephadex G-150 gel filtration， native PAGE指导教师评语：该生认真查阅参考文献，实验方案设计合理，在规定时间内完成了预定任务，初步掌握了从事有关研究的基本实验技能，具备了一定的独立从事科学研究的能力，达到了本科生的培养目标。该文达到了
3、学士学位论文水平。指导教师签名： 年 月 日论文等级：系负责人（签章）： 年 月 日 系审核意见：系公章： 年 月 日填写说明1. 用蓝色或黑色墨水的钢笔（或签字笔）填写，书写要清晰、工整、规范，不得打印。2. 此表一式两份。一份装入学生档案；一份按此表、开题报告、中期检查表、成绩评定表、论文正文的顺序装订成册，留系存档。目 录摘要1关键词1Abstract1Key words1引言11 材料与方法11.1 材料11.1.1 仪器11.1.2 试剂21.1.3溶液的配制21.1.4菌种21.2 实验方法21.2.1粗酶液的硫酸铵盐析21.2.2 Sephadex G-150分子筛层析31.2.
4、3木聚糖酶的活性聚丙烯酰胺凝胶电泳31.2.4 木糖标准曲线的测定41.2.5木聚糖酶活力的测定41.2.6蛋白含量的测定42 结果与分析52.1 木糖标准曲线52.2蛋白含量标准曲线62.3 粗毛栓菌木聚糖酶柱层析实验结果62.4 活性聚丙烯酰胺凝胶电泳后显结果73 结论8参考文献9致谢9表1-1木糖浓度与光密度值的关系5图 1.1木糖标准曲线图 5表1-2牛血清蛋白浓度与光密度值值的关系6图1.2蛋白含量标准曲线6表1-3粗毛栓菌木聚糖酶各步骤的纯化结果6图1.3 Sephadex G-150柱层析图谱7图1.4 活性聚丙烯酰胺凝胶电泳后的显色图 7粗毛栓菌木聚糖酶的分离和纯化生物工程专业
5、学生 XXX指导教师 XXX摘要 将粗毛栓菌木聚糖酶粗酶液经Sephadex G-150分子筛层析柱，最后通过活性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步分离纯化，获得具有木聚糖酶活性的组分。关键词 粗毛栓菌, 木聚糖酶 ,分子筛层析，活性聚丙烯酰胺凝胶电泳 Isolation and purification of xylanase in Trametes gallica Abstract The crude enzyme from wheat straw culture of Trametes gallica Fr. was applied to Sephadex G-150 gel filtrati
6、on. A component with xylanase activity was finally obtained by native polyacrylamide gelelectrophoresis.Key words Trametes gallica Fr.，xylanase， Sephadex G-150 gel filtration， native PAGE引言 木聚糖是植物细胞壁中主要的半纤维素成分，是自然界中仅次于纤维素的可再生的丰富生物资源12。木聚糖降解需要木聚糖酶系的协同作用，主要包括作用于主链内部木糖苷键的-l，4-内切木聚糖酶(endo-l，4-Dxylanxyla
7、nohydrolase，EC3218)，将木聚糖分解成木寡糖和少量的木糖；作用于木聚糖和低聚木糖非还原端的-1，4外切木聚糖酶（exo-l，4一Dxylanxylanohydmlase，EC3217)，产物为木糖；作用于低聚木糖非末端-木糖苷酶(1，4一-D-xylosidase，EC32137)，释放出木糖2。木聚糖酶在自然界广泛分布，海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、瘤胃和反刍动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在。由于微生物来源的木聚糖降解酶普遍存在于自然界且种类繁多应用领域广泛1。近年来，木聚糖酶在饲料、造纸及食品等行业均有广泛的应用，如纸浆生物漂白，功能性
8、低聚木糖生产及面团改良剂，饲料添加剂等13。本文主要对粗毛栓菌木聚糖酶进行了分离纯化以便对其酶学性质进行进一步的研究。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器 仪器名称生产厂家Hisense冰箱海信北京电器有限公司TH-500梯度混合器上海沪西分析仪器厂HL-2恒流泵上海沪西分析仪器厂XWT-S小型台式记录仪上海自动化仪表三厂HD-核酸蛋白检测仪上海泸西分析仪器厂BJQ-74-2自动部分收集器上海医用分析仪器厂TU-1810紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司恒温水浴锅北京长安科学仪器厂1.1.2 试剂 Sephadex G-150购自Pharmacia公司；桦木木聚糖（birch
9、wood xylan）购自美国Sigma公司， 其它试剂均为国产分析纯。1.1.3 溶液的配制 1.1.3.1 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 甲液：准确称取10g NaOH，用去离子水溶解，定容至200mL，将其分为50mL和150mL两部分，在50mL NaOH溶液中加入2g苯酚，在150mL NaOH溶液中加入10g DNS，加热溶解；乙液：称取300g酒石酸钾钠溶于500mL水中，加热溶解。待甲乙两种溶液冷却后，将二者合并、混匀，加入0.5g亚硫酸氢钠，搅拌、混匀，定容至1000mL。1.1.3.2 0.2mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液(pH5.0)将700mL的0.2mol/L醋酸
10、钠溶液和300mL的0.2mol/L的醋酸溶液混合，用pH计调至pH5.0。1.1.3.3 1%桦木木聚糖溶液 称取0.5g桦木木聚糖，加入30mL pH5.0的醋酸钠-醋酸缓冲液，加热、搅拌溶解，冷却后用同样的缓冲液定容至50mL，4冰箱保存。1.1.3.4 考马斯亮试剂 称取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL95%的乙醇中，加入10mL85%的磷酸，用去离子水稀释到1000mL。1.1.4 菌种本实验室保存的现成的具有较强降解木质纤维素能力的菌株-粗毛栓菌（Trametes gallica Fr.），白腐担子菌粗毛栓菌系的XXX博士于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从
11、被砍伐的杨树上分离得到的。该野生菌株于同年经由山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定，定名为Trametes gallica4。1.2试验方法1.2.1 粗酶液的硫酸铵盐析向粗酶液中添加固体(NH4)2SO4至30%饱和度，4过夜，离心（6,000r/min，4）15min，除去杂蛋白沉淀物；然后将上清液的硫酸铵饱和度上调至75%，再于4静置过夜，离心（7,500r/min，4）10min，弃上清，得沉淀约100mL，将沉淀于-20冰箱中保存，备用。将沉淀透析（截留量12-14KD），每隔3-4小时换一次4去离子水，直到透析袋内酶液无残留的(NH4)2SO4。透析液经
12、聚乙二醇（平均分子量20,000）浓缩后，作为下一步进行分子筛层析的样品。 1.2.2 Sephadex G-150分子筛层析(1.6cm115cm)将处理好的凝胶放在大烧杯中，用去离子水反复冲洗至中性，再用50mmol/L的醋酸钠缓冲液（pH 5.0）冲洗几次。将凝胶装制成1.6115cm柱，上样前用上述缓冲液平衡柱，过夜。上样时样品体积不宜过多，约为柱体积的1%-5%。洗脱线速度为6cm/h，每管收集2mL。检测流出液的酶活性，合并具有相同酶活性的组分，然后再如上法进行(NH4)2SO4盐析、离心和透析等步骤7。1.2.3 木聚糖酶的活性聚丙烯酰胺凝胶电泳 活性-聚丙烯酰胺凝胶电泳（nat
13、ive-PAGE）5，11用于木聚糖酶的回收制备及活性检测，样品为经过层析法分离的部分纯化的酶样品。8%分离胶的制备（20mL）：取5.3mL 30%凝胶储备液（含29%丙烯酰胺和1% N,N-亚甲双丙烯酰胺）、2.5mL 3.0mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.9）、0.1mL 10% TEMED、0.2mL 10%过硫酸铵、11.9mL dH2O，混匀，灌入DYY- 5型垂直板电泳槽的玻璃板间隙中，使液胶的高度为玻璃板纵长的2/3-3/4。上面封一薄水层。使玻璃板在30恒温箱中聚合20-30min。5%浓缩胶的制备(10mL)：取1.7mL 30%凝胶储备液、2.5mL 0.5m
14、ol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.7）、0.05mL 10% TEMED、0.1mL 10%过硫酸铵、5.65mL dH2O，混匀，加于分离胶上面的空隙中。在浓缩胶的上面留有1-2cm高的空隙（上样用），再如上法进行恒温聚合。进行制备电泳时，将酶液与6加样缓冲液（含pH6.7的0.75 mol/L Tris-HCl、30%甘油、0.01%溴酚蓝）混合，上样后，利用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲系统（25mmoL/L Tris、250mmol/L甘氨酸），于4进行恒流（10mA）电泳，待样品进入分离胶后，再将电流升至15mA，继续电泳。电泳至溴酚蓝指示剂离胶底面1-2cm时停止电泳。
15、 取出并分离玻璃板，并使凝胶附着在一块玻璃板上。用刀片纵向切去凝胶两边的部分（每边约1cm宽）。由于酶样品在凝胶的两边沿处往往略呈弓形，不宜用来进行酶的定位，故将凝胶的两边部分切除。再用刀片沿凝胶一侧纵向切去宽约 1cm 的胶条，将此胶条的分离胶部分从上到下切成2mm长的胶块，放在相应编号的EP管中，捣碎胶块，然后向每个EP管中分别加入 50L的1%桦木木聚糖，置于45 水浴锅中保温 1.5h，再向每个EP管中分别滴加100L 1% DNS， 沸水浴煮 15min。观察各管中颜色变化。进行显色反应期间，用保鲜膜覆盖剩余胶块，并置于4冰箱中暂时保存。1.2.4 木糖标准曲线的测定准确称取干燥至恒
16、重的木糖标准品50mg，用蒸馏水溶解，定容至50mL。按下表在各管中加入各种试剂：数量管号 项目空白12345含糖总量（mg）00.20.40.60.81.0木糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）2.01.81.61.41.21.0DNS试剂（mL）1.51.51.51.51.51.5将上述试剂加完后，混匀各管，沸水浴5min，冷却至室温，分别用去离子水将各管定容至25mL，混匀。选用光程1cm的比色杯在550nm处比色，用空白管作对照，测各管光密度值，每管重复三次，求平均值。以木糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线4。1.2.5木聚糖酶活力的测定采用DNS（
17、dinitrosalicylic acid）法即3,5二硝基水杨酸法8,10。取0.9 mL由50mmol/L NaAc-HAc（pH4.5）缓冲液配制的1%桦木木聚糖于25mL刻度试管中，加入0.1mL适当稀释的酶液，于45水浴中保温30min后，加入3mL 1% DNS试剂，混匀，在沸水浴中煮15min，冷却至室温，补加水至25mL，混匀，于550nm处测定吸光值。以每分钟催化木聚糖水解生成1mmol木糖所需的酶量定为1个活力单位。木聚糖酶酶活力计算公式如下：木聚糖酶酶活力（U min-1 mL-1） nA /（150.13 30）其中，n为酶液稀释倍数，A为标准曲线上吸光值所对应的木糖微
18、克数，150.13为木糖分子量，30为酶作用时间（min）。1.2.6蛋白含量的测定参照Bradford9法：取一系列试管，按下表分别加入下列试剂：目项量数号管空白12345BSA（100ug/mL）00.20.40.60.81.0考马斯亮蓝G-250（mL）555555蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20.0将上述试剂加完后，混匀，室温静置2min，选用光程为1cm的比色杯，以不加牛血清白蛋白(BSA)的试管为对照，在595nm处比色。以牛血清白蛋白的浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。取待测样品溶液1mL，加入考马斯亮蓝G-250 5mL，混匀，按上述方法测定595nm
19、的光密度值。平行做3份。比色后，从标准曲线上查出待测样品的蛋白质浓度。2 结果与分析2.1 木糖标准曲线 在上述条件下，得木糖标准品浓度与光密度值的关系（表1-1）。表1-1木糖浓度与光密度值的关系木糖标准品(mg/mL) 0.20.40.60.81光密度值（OD550）0.1010.2800.4640.6220.747以木糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制出标准曲线（图1.1）。计算出标准曲线方程为：A = 0.815x0.047（R2 =0.994）结果表明，在0-0.8mg/mL范围内木糖浓度与光密度值线性关系良好。图 3-1 木糖标准曲线图2.2蛋白含量标准曲线 在上述条件下，得牛
20、血清蛋白浓度与光密度值的关系（表1-2）牛血清蛋白浓度与光密度值值的关系BSA浓度（g/mL）20406080 100光密度值（OD595）0.2360.4690.6760.7880.906以牛血清白蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线（图1.2）。得到标准曲线的回归方程为：A=0.00825x+0.117 (R2=0.971)，结果表明，牛血清白蛋白量在0.2-1mg/mL范围内与光密度值线性关系良好（图1.2）。图1. 4蛋白含量标准曲线2.3 粗毛栓菌木聚糖酶柱层析实验结果木聚糖酶粗酶液经过盐析离心，分子筛层析等纯化步骤结果见表1-3。表1-3粗毛栓菌木聚糖酶各步骤的纯化结果
21、Table 1-3 Summary of the purification of xylanase in Trametes gallica纯化步骤 总酶活 /(U) 总蛋白/(mg) 比酶活（U/mg） 回收率% 纯化倍数purificationTotal Total Specific Recovery Purification step activityproteinactivity ratefold硫酸铵沉淀 4.54105 1.00104 45.4 100 1(NH4)2SO4 fractionation分子筛层析 2.86104 2.25102 127.11 6.3 2.81Sepha
22、dex G-150 molecular sieving硫酸铵沉淀 2.48103 3.596 689.66 0.05 15.19(NH4)2SO4 fractionationSephadex G-150分子筛层析洗脱曲线见图1.3。图1.3 Sephadex G-150柱层析图谱Fig. 1 .3 Elution curve of the Sephadex G-150 chromatography2.4 活性聚丙烯酰胺凝胶电泳后显色结果 按照1.1.4中所述方法得到的结果如图1.4所示：图1.4 活性聚丙烯酰胺凝胶电泳后的显色图从显色结果上可以看出，1号到6号的EP管的颜色比其它各管的颜色深，
23、即分离胶上从负极到正极第2-12mm的位置上有酶存在；而第20到第28管的颜色也比其他它的各管的颜色深，可能是溴酚蓝指示剂的干扰。3 讨论本试验从粗毛栓菌的木聚糖酶粗酶液中, 经过盐析，离心和分子筛层析等操作后, 结果得到一种木聚糖酶的混合组分，木聚糖酶粗酶液得到初步分离和纯化。首先经过硫酸铵盐析得到的组分经Sephadex G-150分子筛层析，此阶段酶的纯化倍数是2.81，回收率是6.3%；再经过盐析后，酶的纯化倍数和回收率分别是 15.19和0.05%。得到的组分通过活性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于进一步的分离纯化和回收。经Sephadex G-150分子筛层析后得到的酶液纯化倍数得到很大
24、的提高，但回收率很低，酶的损失很大，并且纯度和比活力均低于范美霞14的相应结果，其原因可能是上样量较大，造成样品分布过广且未充分回收。另外，分离纯化步骤过于单一，使该实验未能达到理想的纯化效果。参考文献1李秀婷.2008.微生物木聚糖酶及在食品工业中的应用.农业机械学报,39（2）：175-179.2陆平.2008.双功能葡聚糖酶-木聚糖酶与葡聚糖酶-植酸酶融合酶的优化构建及其酶学特分析，浙江大学博士论文,5-5.3闫欣.2006.黑曲霉双功能木聚糖酶的纯化与酶学性质研究.河南农业大学硕士论文,2-2.4XXX，任少亭，毕瑞明.2002. 粗毛栓菌降解麦草木质纤维素的实验研究, 微生物学杂志,
25、22（1）：24-26.5张承圭，王传怀，袁玉荪等合编.生物化学仪器分析及技术1990年4月第一版. 高等教育出版社，北京.6 田亚平.2006.生化分离技术. 北京：化学工业出版社,1-329.7 XXX.2004.粗毛栓菌木质纤维素降解酶及其基因克隆. 四川大学博士论文, 44-44.8 Elisashvili, V. I., Khardziani T. S. and Tsiklauri N. D.1999. Cellulase and xylanase activities in higher basidiomycetes. Biochemistry , 64 (6): 718-22.9
26、 Bradford MIN. 1976.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye biding. Analytical Biochemistry, 72 (0): 248-254.10 Miller, G. L.1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem,
27、 31 (3): 426-428. 11 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术. 1999年12月第二版. 中国协和医科大学出版社，北京.12 Aspinall GO.1959.Structural chemistry of the hemicelluloses. Adbances in carbohydrate chemistry 14:429-430.13 Kulkarni N, Shendye A, Rao M.1999. Molecular and biotechnological aspects of xylannase.FEMS Microb . Rev., 23(4):411456.14范美霞.2006.粗毛栓菌木聚糖酶的分离纯化及性质研究.四川师范大学硕士论文，24-24.致谢毕业论文设计即将完成，首先诚挚的感谢我的指导老师XXX教授。孙老师曾从事粗毛栓菌的木质纤维素降解酶及其基因克隆的研究。正是由于此，我才有机会接触这个课题。孙教授学识广博，治学严谨，态度认真，要求严格，在毕业论文的实验过程中，孙老师给了我细心的指导和教育，谢谢您！同样也要感谢实验室里的其他同学，在试验期间他们给了我很大的帮助。谢谢你们！
