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1、 密级： JINGGANGSHAN UNIVERSITY本科毕业论文题 目 井冈山杜仲绿原酸的提取工艺研究学 院 医学院 专 业 药学 班 级 药学10级本一班 学 号 101115037 姓 名 指导教师 起讫时间 2013.07.012014.05.15 教 务 处 印 制毕业论文诚信声明本人声明：所呈交的毕业论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，论文中引用他人的文献、数据、图表、资料均已作明确标注，论文中的结论和成果为本人独立完成，真实可靠，不包含他人成果及已获得井冈山大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的老师、同学对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明
2、确的说明并表示了谢意。 论 文 作 者 签 名： 日期： 年 月 日毕业论文版权使用授权书本毕业论文作者同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权井冈山大学可以将本毕业论文全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本毕业论文。本人离校后发表或使用该毕业论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，单位署名为井冈山大学。 论 文 作 者 签 名： 日期： 年 月 日指 导 教 师 签 名： 日期： 年 月 日摘 要 目的： 为了获得井冈山地区杜仲皮中绿原酸提取的最佳方法和工艺 。方法：用超声提取、回流提取两种方法
3、对杜仲皮中绿原酸进行提取，采用高效液相色谱法测定其含量。 结果：超声提取法绿原酸提取率为3.27%，回流提取法绿原酸提取率为2.42%； 回流提取法中80摄氏度下提取90min提取率最高。 关键词：杜仲皮；绿原酸；超声；回流；高效液相色谱Abstract Objective: To obtained the optimal extraction method of eucommia ulmoides from chlorogenic acid in jinggangshan region. Methods : Ultrasonic extraction and reflux extractio
4、n method was selected to extract the aucubin. And High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method was used for determination of content. Results: The contents of aucubin in ultrasonic extraction method and refluxing extraction method is 3.27 mg/g,and 2.42 mg/g, respectively. Ultrasonic extracti
5、on is better than refluxing extraction in the respect of chlorogenic acid extraction efficiency. In refluxing extraction method, the suitable extract parameters is 80 degree and 90 min of extraction time. Key words: Eucommia bark; Chlorogenic acid; Ultrasound; Reflux; High performance liquid chromat
6、ography (HPLC).目 录 第一章 绪论1.1 杜仲的基本概况.51.2 绿原酸结构及理化性质.51.3 绿原酸的作用.61.4 绿原酸含量测定的方法.61.5 绿原酸的提取.71.6 绿原酸的生产现状和市场前景.71.7 本课题研究的目的、内容及意义.8第二章 绿原酸含量测定方法的建立2.1 实验材料与仪器.82.2 实验方法.82.3结果分析与讨论.9第三章 杜仲皮绿原酸提取工艺的优化3.1实验材料和仪器.123.2实验方法.123.3 结果分析及讨论.12第四章 结论与展望4.1 结论.134.2 展望.13参考文献致谢第一章 绪论1.1 杜仲的基本概况 杜仲（oides Ol
7、ivEucommia ulm.）,杜仲科（Eucommiaccae）杜仲属（Eucommia Oliv.）稀有孑维植物1是我国特有的一种落叶植物，占世界总量的95%，杜仲用药在我国中药史已经有上千年的历史，是我国重要的传统中药材2，神农本草经中对其有记载和描述，主治“腰漆痛、不中、益精气、坚胫骨”，“久服身轻耐老”3，近年来我国的制药工业、保健品生产以及工业材料等方面的发展导致对杜仲的需求不断增加4，比如保健品杜仲莲花茶等。 杜仲主要含有木质素类、有机酸类及氨基酸类5、甾贴类、黄酮类、脂肪酸、微量元素等，在治疗高血压，血管硬化，抗菌、安胎、利尿、抗衰老、抗肿瘤、止咳等药理方面有独特疗效6，尤其
8、是杜仲的降压作用毒副作用低，以被当今认定为最高质量的天然降压药物7，这也是杜仲在降压药物及保健品中应用广泛。 杜仲传统以皮入药，但杜仲皮的生长年限较长，一般需要十到二十年才能去皮，切去皮后杜仲树易死亡，因此以皮入药不仅不能满足市场对杜仲的需求，也不利于可持续生产8，近年来研究发现，杜仲叶含有的成分与皮含有的成分有很多想类似的地方，且有些活性物质含量不低，从而提出了“以叶带皮”的观点。1.2 绿原酸结构及理化性质 绿原酸（Chlorogenic）艺名咖啡单宁酸、咖啡酸9，IUPAC命名法为3-O-咖啡奎尼酸（3-O-Caffeoyl quinic acid），分子式，C16H18O9,分子量，3
9、54.30.是由咖啡酸（Caffeic acid）与奎尼酸（Quinic acid）组成的缩酚酸10，其结构如图所示。 绿原酸的分子结构 理化性质是11：绿原酸半水合物为白色或微黄色针状结晶，在110时变为无水物，与稀盐酸共热产生咖啡酸，熔点208，比旋光度D=35 2(C=28)。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分。在从植物提取过程中，往往通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化。由于绿原酸的特殊结构，决定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂从植物中提取出来，但是由于绿原酸本身的不稳定性，提取时不能高温、强光及长时间加热。绿原酸的供试液放置于
10、棕色瓶、冰箱（2）保存时最为稳定。1.3 绿原酸的应用绿原酸的作用广泛，药理作用主要体现在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗高雪蛋白、保肝利胆、降压、降血脂、降血糖、清除自由基等11方面。1.3.1 消炎、抗病毒、抗肿瘤作用绿原酸具有光谱的灭菌效果，以及较强的消炎作用。研究表面，绿原酸具有抗菌活性1215，另外，绿原酸能够通过增强S-adenosy-L-homoeysteme的合成，通过抑制遗传物质转录过程中的甲基化反应阻止转录过程，从而阻止癌细胞扩散。此外，绿原酸还可以抑制抗癌因子，比如4-NQO等，达到防癌的效果。绿原酸还被认为是抗艾滋病的先到化合物16，将来在治疗艾滋病方面将会有非常重要的作用。1
11、.3.2 降压、降血脂作用绿原酸是杜仲降压效果的有效成分18，在降压药、保健产品方面都是重要的添加剂，此前，此前，国外学者通过白鼠实验研究表明19，服用绿原酸后，肝脏内脂肪增加速度和脂肪含量出现降低的趋势；另外静脉注射绿原酸后，肝脏中脂类物质的含量也会大大降低，血液中脂类物质的含量也呈减小的趋势。1.3.3 降血糖作用绿原酸也是一种良好的治疗糖尿病的药物。例如，常饮咖啡有助于降低患 2型糖尿病的风险，研究发现20，绿原酸及其衍生物能够抑制6-磷酸葡萄糖酸移位酶体系的正常转运，这对非胰岛素依赖性糖尿病患者有着良好的治疗作用，因为通过绿原酸的这种作用能够降低患者较高的肝糖排泄速度，从而保持血糖叫稳
12、定的浓度。1.4 绿原酸含量测定方法目前，绿原酸含量测定的方法很多，有光谱法，色谱法等，在此主要研究高效液相色谱法测定绿原酸的含量。高效液相色谱法在中草药有效成分的检测中应用广泛，在反向色谱中，绿原酸检测谱图尾现象，使用酸化的流动相有助于克服拖尾，提高检测的准确性。更容易得到人们想要的结果。杜仲绿原酸的含量测定主要也是用高效液相色谱法。1.5 绿原酸的提取 绿原酸的提取方法很多，例如：水提醇沉法、醇提水沉法、回流提取法、超声提取法等等。在此我们知讨论了超声提取法和回流提取法。绿原酸是一种强极性有机酸，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，也可用水提取，但绿原酸稳定性低，85摄氏度以上就会分解，因此提取过
13、程中要注意提取温度。影响绿原酸提取率是多方面的，除了温度外，提取次数、提取时间都会影响绿原酸的提取率，所以，在绿原酸提取过程中，要注意的问题是多方面的。1.6 绿原酸的生产现状和市场前景 杜仲是一种传统中药材， 我国人民认识和利用杜仲至少已有二千多年的历史，汉代 神农本草经 将杜仲列为上品， 李时珍曰 “久服杜仲， 轻身耐老” ， 说明了杜仲具有有病治病、 无病保健的功能21。绿原酸可作为多种医药原料，其市场潜力巨大。近年来，杜仲绿原酸中药提取物的年出口额在中药出口商品中明显呈上升趋势。以2008年为例，我国提取物的出口增速高达21.17%，高于中药出口总值增速16个百分点；出口1.33亿美元
14、，占中药出口总值的5.3%；出口增长1957万美元，占中药出口总增长值的2.98%，成为拉动我国中药出口增长的动力。 我国杜仲绿原酸产品研发最早由西北农林科技大学于90年代初实施，后来又有湖南农业厅林产品研究所、中科院成都分院、安康市志朗生物资源应用研究所等机构于90年代中期开始进行研发工作。然而，研究至今，绿原酸作为重要的化学试剂，我国目前尚没有生产医用或化学纯的厂家，绿原酸纯品，只能依靠进口。纯度约90%的绿原酸价格一般在100元 /克人名币；纯度95%的绿原酸价格一般在200500元/克。 在国外，绿原酸的提取以往是从咖啡豆中提取的，如今也转向从杜仲叶中提取。日本科研所需杜仲原料90%来
15、源于我国，仅2006年，从我国购进的杜仲叶及杜仲树皮达8000余吨，美国则干脆将杜仲作为行道树观赏使用。 由于我国在这方面的技术落后，因此高纯度杜仲绿原酸的提取将成为以后绿原酸市场需求的发展趋势。该项目研究成果经济效益巨大。对于杜仲绿原酸未来的发展态势，部分专家表示，与化学药物和其他中药品种相比，由于具有原创性优势和较高的技术含量，未来的高纯度杜仲绿原酸开发仍将风光无限。1.7 本课题研究的目的、内容及意义 杜仲是我国特有树种，种植区域广泛，具有很高的要用价值和经济价值。但我国对杜仲的开发利用进展不大，由于成本限制，能够大规模提取杜仲所含重要医药成分绿原酸，杜仲的重要作用一直没有体现。这导致我
16、国生产绿原酸能力有限，需要进口，绿原酸价格较高；如果能设计提取路线将杜仲综合利用，必然能起到意想不到的效果。 本论文研究的内容是对绿原酸的含量测定，提取的研究，主要包括一下几个方面： 1、通过回流提取和超声提取来退出两种提取的最有方案，最终判定哪一种才是最好的方法。2、通过实验时间、实验次数、实验温度等条件来判定影响绿原酸提取率的因素有哪些，并做出合适的选择。第二章 绿原酸含量测定2.1 实验材料与仪器材料：杜仲皮（江西省井冈山市）、杜仲绿原酸标准品粉末、无水乙醇、甲醇等。仪器：RE-2000A旋转蒸发仪（郑州亚荣仪器有限公司）；DLSB-10/20低温冷却循环泵（郑州亚荣仪器有限公司）；SH
17、B-DIIA循环式多用真空泵（上海于康科教仪器设备有限公司）；DG-160C中微粉碎机（上海菁海仪器有限公司）；FA1604N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；HH-4水浴锅；SL-250超声波清洗器。 2.2 实验方法2.2.1绿原酸标准液的制备 标准品浓缩液（0.11mg/mL):精密称取绿原酸标准品1.1mg,用体积分数为60%的甲醇为溶剂，配成浓度为0.11mg/mL的标准浓缩液避光低温保存。 标准品工作液1（0.055mg/mL)：临用前取标准品溶液浓缩液1mL，用等量60%的甲醇稀释到浓度为0.055mg/mL的标准工作品避光低温保存，并贴上标签以备下面用。依次类推，连续做5次
18、像这样的方法在前一标准液的基础上稀释10倍。并贴上相应的标签，以备含量测定时用。2.2.2 杜仲皮提取液的制备2.2.2.1 回流提取称取10.0220g杜仲皮干品粉末，装入500ml的圆底烧瓶中，加入120ml 60%的乙醇（料液比为1:12），用盐酸调PH=4，温度在60条件下回流提取2次，每次90min，合并提取液，浓缩至乙醇蒸发完全，再用少量的60%的甲醇溶解，并移入100ml容量瓶，用60%甲醇清洗3次，一并加入容量瓶，然后定容。2.2.2.2超声提取称取10.0481g杜仲皮干品粉末，装入500ml的圆底烧瓶中，加入80ml60%的乙醇（料液比为1:8），用盐酸调PH=4，温度在5
19、0条件下超生提取2次，每次40min，合并提取液，浓缩至乙醇蒸发完全，再用少量60%的甲醇溶解，并移入100ml 容量瓶，用60%甲醇清洗3次，一并加入容量瓶，然后定容。2.2.3 绿原酸含量测定方法 精密称取杜仲绿原酸标准品1.1mg，用体积分数为60%的甲醇为溶剂，配成浓度为0.11mg/mL的标准对照品品溶液，以甲醇和1%冰乙酸（40:60）为流动相，检测波长为328nm,流速为1.0mL/min，温度为25摄氏度，进样量为10uL的条件下，测定精密度和标准曲线。2.3 结果分析及讨论以下为高效液相色谱法测定的杜仲绿原酸标准谱图及超声与回流提取的实验谱图 ：Lysbzp29 保留时间3.
20、173，峰面积3909916，峰开始及结束2.5176.350杜仲绿原酸以色谱柱为甲醇：1%冰乙酸=40：60的标准峰图 Lysyp33保留时间3.358，峰面积660595，峰开始及结束时间3.1504.075 杜仲绿原酸以色谱柱为甲醇：1%冰乙酸=40：60超生提取的样品图0.05.010.015.020.025.030.035.0min0102030405060mV A:328nm 杜仲绿原酸以色谱柱为甲醇：1%冰乙酸=40：60回流提取的样品图 杜仲绿原酸标准曲线：积分面积25368791212368318124.5172040.5100784.5质量浓度0.110.0550.0137
21、50.0068750.00343752.3.1精密度将质量浓度为0.11的标准溶液连续进样五次得到的峰面积为：2515834、2466982、2548737、2571870、2581290 ，峰保留时间为3.200、3.244、3.185、3.228、3.241 出峰及峰结束时间为2.6585.175、2.7675.283、2.7505.642、2.6835.250、2.7425.267， 相对标准偏差为RSD=1.14%，小于3%，精密度良好。线性关系数为R2=0.9993.2.3.2结果在高效液相色谱法测定绿原酸含量过程中，以浓度为10ug/ml的标准溶液，连续进样5次，每次取样10ul，
22、进样20min中，最终得到RSD=1.14%,小于3%,精密度良好，达到了预期的效果。超声提取法绿原酸提取率为3.27%,回流提取法绿原酸提取率为2.42%.由两组数据对比可以得出超声提取得到的绿原酸高于回流提取。2.33、讨论通过上述的结果以及对超声、回流两种提取方法的含量测定谱图表明，井冈山地区的杜仲绿原酸提取方法中超声提取率高于回流提取率，而我国的杜仲绿原酸提取率2%5%,造成这样结果的原因大概有以下三点：地区、品种、树龄以及温度的不同和季节的采收不同都会影响仲绿原酸的含量。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分，在高温和光照条件下不稳定，
23、易挥发，在实验过程中，由于实验条件的局限性，所得到的结果也会有所影响。实验误差造成实验结果有一定的影响。第三章第四章 待添加的隐藏文字内容1杜仲皮中绿原酸提取工艺的优化 杜仲皮绿原酸的提取方法很多，如有机溶剂提取法、回流提取法、超声提取法、微博辅助提取法等等，本实验中，由于研究的是井冈山地区的杜仲皮，在这里绿原酸的提取方法主要为超声提取法和回流提取法。 杜仲皮绿原酸的提取液含量测定方法采用的是高效液相色谱法，首先在单因素实验的基础上考察对杜仲皮提取率有影响的因素，包括提取温度、时间、提取次数、从中选择对提取率影响较大的因素，并在但因素的基础上设计响应面优化提取工艺的方案，来优化提取工艺，确定最
24、终的提取条件。实验过程中，由于超生提取的温度不好控制，对影响杜仲绿原酸提取率的因素控制上，在此选用了回流提取的方法，温度和时间易于调节。3.1实验材料和仪器 仪器及药品：微孔滤膜，电子天平，旋转蒸发器RE-52A（上海亚荣生化仪器厂），低温冷却循环泵，循环水式多用真空泵SHB-IIIA（上海益康可教仪器设备有限公司）等。杜仲皮（井冈山地区），甲醇：蒸馏水=40:60的色谱流动相，冰乙酸，乙醇等。3.2 实验方法3.2.1温度对杜仲皮绿原酸提取率的影响 绿原酸的提取温度的把握特别重要，温度过低，会浪费大量的提取时间，而且提取不完整，温度过高，由于绿原酸不稳定，温度过高容易分解，也会影响提取率，因
25、此把握好提取温度尤为重要。 在提取过程中，实验设计温度分别设为50C、60C、70C、80C90C、100C，分别提取10g杜仲皮粉末，置于500ml圆底烧瓶中，加入200ml蒸馏水，提取90分钟，提取次，研究不同同提取温度对杜仲皮中绿原酸提取率影响。3.2.2时间对杜仲皮绿原酸提取率的影响同样，不管用哪一种提取方法，除了提取温度会影响绿原酸的提取率，提取时间也会影响绿原酸的提取率，时间过短，提取不完全，会产生原料的浪费，时间过长。在本次实验设定中，时间分别设定为30min、60min、90min、120min、150min，分别提取10g杜仲皮粉末，加入200蒸馏水，在80C条件下提取1次，
26、研究不同提取时间对杜仲皮中绿原酸提取率的影响。3.3 结果分析与讨论3.3.1 提取温度对杜仲皮绿原酸提取率的影响实验采取了温度为50C、60C、70C、80C、90C、100C，四个水平进行单因素实验，结果如图所示。 温度对杜仲绿原酸的提取率较大，如上图所知，在5080C，随着温度的升高，绿原酸的提取率也逐渐提高，由80100C，随温度的升高，杜仲绿原酸的提取率降低，说明温度过高或过低都回影响绿原酸的提取率。因此，提高绿原酸的提取率，温度的选择至关重要。3.3.2提取时间对杜仲皮绿原酸提取率的影响 如上图所示，当时间达到90min时，提取率达最高值，因此，在其他因素不变的情况下，提取时间也是
27、影响杜仲皮提取率的一大重要因素，时间过短，提取不完全，药品浪费，提取出的绿原酸少，提取率低下；时间过长，会导致绿原酸部分分解，特别是在光照的条件下。所以时间过长也会导致绿原酸提取率下降。第四章 结论与展望4.1 结论井冈山地区杜仲皮绿原酸提取工艺的研究，通过不同的提取方法找出最优方案，调节实验中的单因素，从而找出影响杜仲皮绿原酸提取率的因素，本课题通过改变实验温度或改变时间，最终得出在温度为80C、提取时间为90min时，绿原酸的提取率最高。 4.2 展望 杜仲作为国家的重点保护植物，近年来又不少学者对杜仲有效化学成分进行了深入的研究 ，并将其中的有效成分及其相关的药理作用进行了归纳，并涵盖了
28、医药、保健品、特种工业、木材加工等方面。其中绿原酸就是其中重要的一种。为了能让杜仲可持续的发展，笔者认为：国家正在西部进行退耕还林，可以考虑加大对杜仲的种植，这样不仅可以绿化环境，还可得宜可持续利用，并在此基础上加大对杜仲有效成分的研究，为了人们的健康，在保证质量的同时还要稳定提高产量。 参考文献1王太霞，赵红艳，柴志艳，等.仲皮发育过程中结构和绿原酸含量的变化J，时珍国医国药，2009,20（3）:635-636.2刘传安，邹胜琴，RP-HPLC法测定杜仲发酵液中绿原酸的含量J。安徽农业科学，2005,33（10）:1862-1863.3孙波。从杜仲皮中提取绿原酸工艺研究进展J，天然产物分离
29、，2003,1（1）: 9-12.4王丽楠，杨美华。杜仲不同部位主要有效成分含量比较J。天然产物研究与开发，2009,21:108-110.5程光丽，杜仲有效成分分离及药理学研究进展J，中成药，2006,28（5）:723.6刘圣金，狄留庆，吴德康，等。高校液相色谱法测定杜仲皮中绿原酸的含量J，中国中医药信息杂志，2006,13（1）:44-45.7赖娟华，徐丽英，饶骅，等。杜仲皮化学成分和药理作用研究概况J。实用中西医结合临床，2004,4（2）:67-69.8赵辉，杜仲皮药理作用研究（I）-抗衰老作用J，国外医学中医中药分册，2000,22（3）:151-153,144.9Wu L.Fff
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33、im HJ,et al. Du- zhong（Eucommia ulmoidesOliver Leaf Extrac）t Mediates Hypolipidemic Action in Hamsters Fed aHigh- Fat DietJ. Am J Chin Med,2008,36（1）.致 谢经过几个月的整理和修改，本次毕业论文设计已经接近尾声。本次论文是在宋明霞老师和黄小流老师虚心指导下完成的。从论文选题、文献查询、实验方案的设计、开题报告以及毕业论文的撰写，无不凝聚着老师的关心和支持。在学习中，老师严谨的治学态度、求实的工作作风、丰富渊博的知识、敏锐的学术思维、精益求精的工作态度以及侮人不倦的师者风范是我终生学习的楷模。是您们的督促指导才使我能够顺利完成本次毕业论文。在此谨向宋老师和黄老师致以最衷心的谢意。还要感谢胡跃华、曾繁友、张远利等同学在本次毕业论文实验过程中提供的帮忙。如果没有他们的帮助，此次毕业论文实验也难以顺利完成。在此，我向他们表示深深的感谢。同时，诚挚地感谢在百忙之中抽出时间对本次论文进行审阅，评议和参加本人论文答辩的各位老师。最后我要感谢医学院的各位老师和学校领导这四年来对我的栽培。你们传授给我的专业知识是我不断成长的源泉，也是完成本次毕业论文的基础。你们对我的谆谆教诲令我终生受益。在此，谨向老师们致以衷心的感谢和崇高的敬意。
