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1、加替沙星温度敏感型原位凝胶的质量和体内药动学研究目录摘要1前言3第一章 研究的背景及意义41.1 温敏型原位凝胶41.2 泊洛沙姆水凝胶的胶凝机理4第二章 加替沙星温敏型眼用原位凝胶的处方前研究62.1 主要试剂及仪器62.2 处方前研究7第三章 加替沙星温敏型眼用原位凝胶的质量考察113.1 加替沙星温敏型原位凝胶的体外溶蚀与释放113.2 胶凝温度的测定13第四章 加替沙星温敏型眼用原位凝胶的体内药动学研究164.1 眼内药动学研究164.2 家兔的体内药动学实验19参考文献20致谢8附录X 9加替沙星温度敏感型原位凝胶的质量和体内药动学研究 黄莉 0841918摘要：加替沙星是第4代氟喹
2、诺酮类药物，为国家西药一类新药2。其应用特点为抗菌谱广、抗菌活性高、生物利用度好、半衰期长、给药方便、不良反应较少。临床上3主要为滴眼剂和普通凝胶剂，但是滴眼剂作用时间短、生物利用率低，需频繁滴眼，患者依从性差；凝胶剂黏度大，分剂量不准确，给药不方便。本课题以加替沙星为模型药物，制备温度敏感型原位凝胶，通过眼部给药后形成凝胶，达到维持药物缓慢释放，眼部滞留时间延长，提高生物利用度目的。关键词：温敏型原位凝胶； 泊洛沙姆； 体外溶蚀； 胶凝温度；体内药动学 Research on the gatifloxacin temperature-sensitive in situ gel and in-
3、vivo PharmacokineticAbstract： Gatifloxacin is a 4th generation fluoroquinolones drug, a class of 2 Western medicine for the country. Its application characteristics involves broad antibacterial, spectrum antibacterial activity, good bioavailability , long half-life, convenient dosing and few adverse
4、 reactions. Its clinical agents are mainly eye drops and gels. But eye drops has a lot of disadvantages including short active time, low bioavailability and frequent delivery in patients with poor compliance. Besides the viscosity of the gel is very high and its divided doses is not accurate. So the
5、 drug is not convenient. This topic is to add Gatifloxacin as a model drug and prepare temperature-sensitive in situ gel through the formation of the gel after ocular administration to maintain the drug slowly released, extend residence time in eye and enhance the bioavailability .Keywords：Temperatu
6、re-sensitive in situ gel; poloxamer; in vitro dissolution; gelling temperature; pharmacokinetic前言智能材料是一种能从自身表层或内部获取环境条件及其变化规律，进行判断、处理和做出反应，以改变自身结构和功能使其更好地适应环境。温敏型眼用原位凝胶属于智能材料的一种，其在贮存温度下为低粘度的液体，滴入咽喉由于温度的升高使高分子溶液发生相变，形成凝胶，从而达到局部给药和延缓药物释放的目的。加替沙星为第四代喹诺酮类抗菌药物，对革兰氏阳性菌、厌氧菌、枝原体、衣原体以及分枝杆菌等具有很强的抗菌作用。加替沙星普通滴眼
7、剂存在人体角膜接触时间过短、生物利用度低等问题，临床上常采用频繁给药方法维持眼内药物浓度，患者顺应性差。原位凝胶（in situ gel）是一类以液体状态给药在给药部位转化为半固体制剂，由水溶性泊洛沙姆和聚乙二醇制备的原位凝胶具有高亲水性三维网络结构，其独特的溶液-凝胶转变性质，具有在眼部滞留时间延长和良好的控制释放性能等优点。本课题以加替沙星为模型药物，利用不同型号的泊洛沙姆水溶液受热具有反向凝胶性质，拟制备温度敏感型原位凝胶（thermosensitive in situ gel），通过眼部给药后形成凝胶，达到维持药物体内缓慢释放、提高生物利用度目的；研究原位凝胶的物理特性和质量，考察原位
8、凝胶的体外释放及凝胶溶蚀性质，进行原位凝胶和普通滴眼液家兔眼部给药的体内在药动学研究。温敏型眼用原位凝胶不同于传统的水凝胶，它能根据温度的变化发生相转变，体外以液体形式存在，滴入眼后即转化为凝胶。这种凝胶剂型具有一定的新颖性，不仅可以解决普通滴眼液眼内滞留时间短、生物利用度不高等问题，也克服了普通眼用凝胶铺展性不好，剂量不易控制的问题。因此具有良好的发展前景。第一章 研究背景及意义（黑体、三号）1. 1.温敏型眼用原位凝胶智能材料是一种能从自身表层或内部获取环境条件及其变化规律，进行判断、处理和做出反应，以改变自身结构和功能使其更好地适应环境。温敏型眼用原位凝胶属于智能材料的一种，其在贮存温度
9、下为低粘度的液体，滴入咽喉由于温度的升高使高分子溶液发生相变，形成凝胶，从而达到局部给药和延缓药物释放的目的。1.1.1 原位凝胶的定义原位凝胶4又称在体凝胶，会因为体内外环境的不同而发生相转变。它在体外通常为低粘性液体，给药后因聚合物的分散状态或者构象发生变化，可立即在给药部位发生相转变，成为半固体的凝胶状态。近年来，随着一些智能型高分子，特别是一些环境敏感型高分子材料的迅速发展，原位凝胶这种新型给药系统得到了进一步的发展。1.1.2 原位凝胶的优点原位凝胶的特点与优点有：（1）独特的液-固转化特性，即以液体状态给药后，在给药部位形成半固体状态。（2）具有凝胶制剂的亲水性三维网状结构及良好的
10、生物相容性。（3）与用药部位亲和力强，滞留时间长，具有良好的生物粘附性及药物控制释放能力。（4）使用方便舒适，易为患者接受，临床适应性好。（5）具有特殊的理化性质，在体外贮存条件，如低温或室温条件下，具有一定的流动性，易于分剂量灌装，便于工业化生产。1.2 泊洛沙姆水凝胶的胶凝机理1.2.1 泊洛沙姆的作用国外研究表明，泊洛沙姆对组织无明显损伤，刺激性小，生物相容性好，是常用的温度敏感型材料。非离子表面活性剂泊洛沙姆是由聚氧化乙烯与聚氧化丙烯组成的嵌段共聚物（PEO-PPO-PEO）,其中P407可形成温度敏感型原位凝胶，而P188可调节温敏型原位凝胶的胶凝温度，HPMC水溶性大，能够增加P4
11、07温敏型凝胶的凝胶强度，因此加入一定浓度的HPMC可起到阻滞水溶性药物释放的作用。1.2.2泊洛沙姆的胶凝机理 在低温或低浓度的时候，泊洛沙姆在溶液中以单体存在，当温度升高达到临界胶束浓度（CMT）或泊洛沙姆浓度达到临界胶束浓度(CMT)的时候，泊洛沙姆链上疏水性嵌段聚氧丙烯(PPO)脱水,泊洛沙姆分子聚集成为以脱水的聚氧丙烯（PPO）为内核、以水化膨胀的聚氧乙烯（PEO）链为外壳的球状胶束。随着温度的升高，由于胶束间的缠绕和堆砌作用加剧从而形成胶束。第二章 加替沙星温敏型眼用凝胶的处方前研究2.1 主要试剂及实验仪器表2-1 试剂规格Table 2-1 Reagents and Speci
12、fication 名称 规格生产厂家氯化钠（NaCl）AR南京化学试剂有限公司氯化钾（KCl）AR南京化学试剂有限公司无水氯化钙（CaCl2）AR上海凌峰化学试剂有限公司碳酸氢钠(NaHCO3)AR南京化学试剂有限公司泊洛沙姆407(F127)工业级上海卡乐康包衣有限公司泊洛沙姆188(F68)工业级上海卡乐康包衣有限公司羟丙基甲基纤维素（HPMC）工业级上海卡乐康包衣有限公司表2-2 实验仪器Table 2-2 Experiment Instruments 名称 型号 生产厂家磁力加热搅拌器78-1上海江星仪器有限公司离心机TGL-16C上海安亭科学仪器厂紫外分光光度计752上海菁华科技仪器
13、有限公司分析天平BS110S北京赛多利斯天平有限公司水浴恒温振荡器SHA-B金坛市精达仪器制造厂超声波清洗器KH2200DB昆山禾创超声仪器有限公司2.2 处方前研究2.2.1加替沙星温敏型眼用凝胶剂的制备：采用冷溶法制备凝胶溶液：精密称取处方量的泊洛沙姆及羟丙基甲基纤维素及药物置于西林瓶中，然后加入溶剂水适量，放入冰箱中冷藏24h以上，使其充分溶解溶胀后，得到澄清无团块并且分散均匀的溶液，制成处方量的加替沙星温敏型眼用凝胶。（宋体、四号）2.2.2人工泪液(STF)的配制： 根据泪液的电解质组成，每1000 mL模拟泪液包括碳酸氢钠2.18 g，氯化钠6.78 g，无水氯化钙0.084 g和
14、氯化钾1.38 g。先称取处方量的碳酸氢钠，氯化钠和氯化钾，然后溶于容量瓶中，接着称取无水氯化钙溶于一定水中备用，将无水氯化钙溶液加入容量瓶中得到人工泪液。2.2.3 加替沙星紫外分析方法学的建立： 准确称取加替沙星10.0mg于50ml量瓶中，用人工泪液稀释至刻度，摇匀，得200.0ug/mg储备液，分别准确吸取0.15, 0.2, 0.3, 0.35, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7ml至10ml。在最大吸收波长处测定吸光度(A)值，以(A)对浓度(C)进行线性回归，得到标准曲线方程:y = 0.0564x + 0.0058。 图 2-1 加替沙星的标准曲线 Fig. 2-1 Sta
15、ndard curve of Gatifloaction 2.2.4 精密度考察日内精密度考察： 分别精密吸取1.0ml, 2.0ml, 3.0ml贮备液至50ml量瓶中，加人工泪液稀释，定容，摇匀，分别得到浓度为4.0, 8.0, 12.0 ug/ml的溶液（低，中，高）,每隔两小时测定一次，共6次（室温放置）。表 2-3 日内精密度实验结果Table 2-3 Data of precision test within day Concentration (ug/ml)AMeanRSD4.0 0.210 0.213 0 .212 0.215 0.210 0.2110.2130.8%8.00.
16、454 0.451 0.448 0.449 0.450 0.4540.4150.5%12.00.686 0.686 0.681 0.682 0.685 0.6870.6380.3%日间精密度考察： 分别精密吸取1.0, 2.0, 3.0ml贮备液至50ml量瓶中，加入人工泪液稀释定容并摇匀，分别得到低，中，高浓度4.0, 8.0, 12.0ug/ml溶液，以人工泪液为空白对照，测定吸光度值A。每天测定一次，共5天，室温放置。表2-4 日间精密度实验结果Table 2-4 Table Data of precision test between day Concentration(ug/ml)A
17、MeanRSD4.08.012.00.210 0.215 0.215 0.213 0.2150.453 0.456 0.455 0.453 0.4580.687 0.689 0.686 0.687 0.6900.2141.0%0.4550.4%0.6880.2% 由表2-3 和2-4 可知加替沙星的日内精密度和日间精密度其RSD均小于2%，符合方法学要求，可做进一步研究。2.2.5 回收率实验 精密吸取贮备液1.0， 1.5，2.0ml 至 10ml 试管中，分别加入空白凝胶剂0.1ml，每个浓度3份，用人工泪液稀释至刻度，摇匀，测定其吸光度，计算回收率。 表2-5 回收率实验结果 Table
18、 2-5 Data for recovery testConcentration Test concentration Recovery Mean RSD（ug/ml） （ug/ml） (%) (%) (%)10.0 9.79 97.8 10.0 9.77 94.5 97.7 0.110.0 9.77 93.315.0 14.75 95.7 15.0 14.13 94.2 94.5 1.115.0 14.03 93.520.0 18.76 93.820.0 18.66 93.3 93.3 0.520.0 18.57 92.9表2-5表明，其回收率均在90%-105%以内。其RSD均小于2% ，
19、符合方法学要求。第三章 加替沙星温敏型眼用原位凝胶的质量考察3.1加替沙星温敏型原位凝胶的体外释放与溶蚀待添加的隐藏文字内容2无膜溶出模型为研究伴随着凝胶溶蚀而发生药物释放提供了选择，出去半透膜的限制，模拟泪液在振荡条件下可对凝胶表面产生类似眨眼的剪切作用，水溶性凝胶的溶蚀与药物释放同步进行，更符合眼用凝胶在体内的真实过程，因此采用该模型考察药物的体外动力学。3.1.1 实验方法（宋体、四号）采用无膜溶出法：将加替沙星温敏型眼用凝胶加入到圆柱形的容器中，加入模拟人工泪液作为释放介质，在一定的温度和频率下震荡20分钟，立即倒出全部释放介质，将容器内外表面用滤纸吸干，迅速称量记录，重新放入震荡器内
20、平衡15分钟后，再小心加入人工泪液并继续震荡。而释放介质经0.45um的微孔滤膜过滤后，稀释至相应刻度，测定其吸光度。如此反复操作，直至剩余凝胶量不足加入量的10。以凝胶的溶蚀量对时间作图，考察凝胶的溶蚀动力学和凝胶的药物释放。图3-1 药物的累积释放曲线Fig. 3-1 The accumulation release in vitro药物释放曲线y = 0.0033x + 0.0273R2 = 0.999100.20.40.60.811.21.41.61.80100200300400500600时间（min）药物累积释放量（g）图3-2 凝胶的溶蚀曲线图 Fig.3-2 Gel disso
21、lution line由图3-1 及3-2 可知加替沙星温敏型原位凝胶的药物释放与凝胶释放均符合线性，为恒速释放。可做进一步质量考察。3.2 胶凝温度的测定 眼用凝胶滴入到结膜囊内后与泪液的混合过程存在两种极端可能：最好的情况是未经泪液稀释已经形成凝胶。这样可以保证温敏型凝胶制剂获得较为理想的眼部滞留时间；最差的情况是首先完全与泪液混合，然后再形成凝胶。在体歌谣后的情况必须介于两者之间。因此将凝胶溶液与模拟泪液按40:7（v/v）的比例混合，分别考察混合前后的胶凝能力，以便理解浓度依赖型凝胶其体内过程。3.2.1实验方法温敏型眼用原位凝胶在贮存温度下应为液态，滴入眼后由于温度的升高使高分子溶液
22、发生相变，形成凝胶。这就要求所制的眼用原位凝胶未经泪液稀释前其胶凝温度要求高于室温，经泪液稀释后要低于眼表温度，因此，本研究以室温25，眼表温度34二者共同作为调节胶凝温度的指标采用“搅拌子法”测定胶凝温度：取待测溶液2ml于试管中，加入搅拌子，将试管置于低温水浴中，温度计测量水的温度。开启磁力搅拌器，设定搅拌子转速为200r/min，保持水浴温度缓慢升温，升温速度约为1-2/min，记录搅拌子完全停止转动的温度，即为该待测液的胶凝温度。每个样品平行测定3次，结果取其平均值。将待测溶液用模拟人工泪液按40:7(V/V)的比例稀释，同上法测定，即为经模拟泪液稀释后的胶凝温度。处方分为六组：R1-
23、R3 20% P407； 2% P188； 0.01% 苯扎氯铵； 0.1% 加替沙星； 0.1%-0.3% HPMC(R1:0.1%, R2:0.2%, R3:0.3%)R4-R6 22% P407；6% P188；0.01% 苯扎氯铵； 0.1% 加替沙星； 卡波姆 0.1%-0.3%（R4:0.1%，R5:0.2%,R6:0.3%） 表3-1 不同样品经人工泪液稀释前后的胶凝温度 Table 3-1 Different samples before and after diluted by simulatet tear fluidSample NameGelatin Temperatur
24、e（）BeforeAfterR125.033.0R225.532.0R328.030.5R422.531.5R524.030.5R621.531.0处方R1, R2, R3其胶凝温度符合眼用凝胶的胶凝温度的指标，可做进一步的质量研究。药物及抑菌剂对凝胶胶凝温度的影响测定：分别制备含有抑菌剂和不含抑菌剂的样品，测定其胶凝温度的变化。 表 3-2 样品加入抑菌剂前后胶凝温度的变化 Fig. 3-2 Gelatin temperature before and after add bacteriostaic agentSamples NameBefore diluted STF After dilu
25、ted STFBefore() After() Before（） After（）R1 25.0 25.5 33.0 33.0R2 25.5 25.5 32.0 32.5R3 28.0 28.5 30.5 30.5 表2-4 表明抑菌剂的加入对于凝胶的胶凝温度几乎无影响。3.3 温敏型凝胶的流变学研究 流变学是研究材料流动和形变的科学。因此不难理解，在体温敏感凝胶药物传递系统的生产分装以及使用过程中几乎都要涉及流动，凝胶强度甚至会直接影响其体内深生物利用度，因而了解温敏型眼用凝胶的流变性质对于此类剂型的质量研究有重要的意义。尽管流变学的定义允许研究所有物质的流动行为，但本实验所指的流变学仅为流体
26、和半固体的范畴。对于许多简单流体如i，流变性质的研究就是粘度的测量，其粘度主要取决于温度。在试验中可知，温敏型眼用凝胶的粘度受到温度的影响极大，尤其是在相转变温度时，粘度值极具变大，可见温敏型原位凝胶在相转变温度时，粘度增大，流动性变差。第四章 加替沙星温敏型眼用原位凝胶的体内药动学4.1 眼内药动学研究眼内药动学的研究一直是困扰着药剂学工作者的难题。其难点主要在于眼内药物浓度的测定。眼睛承担着重要的视觉感知作用，具有相对独立而紧凑的生理结构，高度的敏感性和非常有效的保护机制，致使生物样本采集困难而且无法满足连续取样的要求。眼部药动学评价实验具有损伤性，因此多局限于动物模型研究水平。兔子在眼球
27、大小和房水体积方面与人类具有解剖学上的相似性，是最常用的理想受试动物。研究方法采用角膜穿刺术取房水样品分析。4.1.1 家兔房水样品的处理精密吸取房水样品0.1ml,至于离心管中，精密加入0.1ml的内标溶液，3000r/min离心10min，吸取上清液20ul进行色谱分析，记录色谱图。4.1.2 家兔房水标准曲线的制备 取家兔三只，雌雄皆可，实验室，将加替沙星滴眼液滴入0.1ml滴入家兔左眼结膜囊内，右眼滴入0.1ml温敏型泊洛沙姆溶液。给药后使家兔眼睛被动闭合30s，角膜穿刺法取房水备用。精密称取加替沙星适量，用人工泪液稀释后，配制成不同浓度的标准溶液。准确吸取加替沙星储备液0.15,0.
28、2,0.3,0.35,0.4,0.5,0.6,0.7ml至10ml容量瓶中，取家兔房水0.95ml，加入上述溶液中，稀释至刻度，处理后进行色谱分析，记录峰面积。以加替沙星浓度对加替沙星与内标的峰面积比进行回归，得到标准曲线为：y=1.9076x-0.0394,r=0.9998.4.1.3 回收率实验按照家兔房水标准曲线的的方法操作，制备0.05,1.0,10.0ug/ml的模拟房水样品各三份，处理后，进行色谱分析，求出相应的测定值，测定两与加入量比较，得到回收率。其低，中，高三种样品的平均回收率为138.4%,98.5%,99.9%。其RSD值分别为0.7%，0.02%，0.2%。表4-1 回
29、收率结果 Table 4-1 Data of RecoveryConcentration Recovery Mean RSD(ug/ml) (%) (%) (%) 139.40.05 138.2 138.4 0.7 137.5 98.5 1.00 98.5 98.5 0.01 98.5 99.710.00 100.2 99.9 0.3 99.84.1.4日内及日间精密度实验按照4.1.2项“家兔房水标准曲线”的方法操作，制备高中低三种模拟房水样品，按照4.1.1中处理房水的方法进行房水的处理各浓度进样5针，记录色谱图，以药物与内标峰面积比计算相对标准偏差RSD；按照上述方法操作，各浓度样品每日
30、测定一次，连续测定5天，以药物与内标峰面积比计算相对标准偏差RSD。计算结果如下：日间精密度分别RSD为0.2%，0.8%，0.2%。日内精密度分别为3.0%，1.1%，0.04%。 表4-2 日内精密度及日间精密度实验结果 Table 4-2 Precision within day and between dayConcentration Withinday RSD Between day RSD (%) (%)Low 3.0 0.2Mid 1.1 0.8High 0.04 0.24.2 家兔的体内药代动力学实验家兔三只，每只家兔左眼滴市售加替沙星滴眼液，作为对照组；右眼滴入加替沙星温敏型
31、眼用凝胶，作为实验组，轻轻闭合双睑30s.分别于0.5,1,2,3,4,6,8h进行角膜穿刺，抽取房水0.2ml。 表4-3 滴眼液与凝胶房水中药物浓度 Drug concentration in aqueous of eye drops and eye gelT(h) eye drop concentration eye gel concentration (ug/ml) (ug/ml)0.25 0.261 0.308 0.5 0.357 0.9331 0.501 1.0952 0.271 1.4603 0.137 1.2304 0.115 0.8846 0.069 0.3058 0.033
32、 0.172图4-1 滴眼液房水中药物浓度曲线图Fig.4-1 Drug concentration in aqueous of eye drops图4-2 凝胶房水中药物浓度曲线图Fig.4-2 Drug concentration in aqueous of eye gel 表4-4 滴眼液与凝胶家兔体内药动学数据Table 4-4 Rabbit pharmacokinetic data of eye drops and gelDrug AUC/(ug/ml/h) Cmax(ug/ml) Tmax/h t/2(h) Eye drop 1.327 0.5009 1 2.21Eye gel 6
33、.050 1.460 2 1.69由图4-1,4-2和表4-4 可以看出凝胶中药物浓度-时间曲线下面积明显高于滴眼液，达峰时间也高于滴眼液，说明温敏型眼用原位凝胶有缓释长效作用。参考文献1 吴丽萌, 朱国婵, 陈光龙. 加替沙星热敏型凝胶滴眼液的制备与质量控制J. 中国药业, 2009, 18(23): 34- 35.2 王晓玲, 李东, 聂中越. 加替沙星眼用凝胶的研制与质量控制J. 药学服务与研究, 2005, 5(1): 57.3 朱曼, 王瑞. 第四代氟喹诺酮类抗菌药-加替沙星J. 中国临床药理学与治疗学, 2001, 6(4): 377- 380.4 Yasueda S, Inada
34、 K. A queous liquid preparations. EP10254846P, 2002- 08- 09.5 Satishkumar P, Jain, Sejal P. In situ ophthalimic gel of ciprofloxacin hydrochloride for once a day sustained deliveryJ. Drug Dev Ind Pham, 2008, 34(4): 445- 452.6 Hagerstrom H, Paulsson M, Edsman K. Evalution of mucoadhesion for two poly
35、electrolyte gels in simulated physiological condition using a theological method J. Eur J Pharm Sci, 2000, 9(3): 301- 309.7 吴建强，周建平，赵宁.在体凝固系统的研究进展J.药学进展.2005,29(6):246-2508 沈承武，房广星，张桂芳，等。环境敏感型水凝胶的研究进展及在给药系统中的应用J.齐鲁药事，2004,23(5),40-449 Cohen S. Lobel E. Trevgoda A.et al. A novel in-situ-forming ophth
36、almic drug delivery system form alginates undergoing gelation in the eye J.J controlled Release,1997,44(2-3):201 致谢值此论文完成之际，谨向所有指导、帮助和关心我的人们致以诚挚的谢意。首先，衷心感谢李娟教授，感谢在实习期间老师的谆谆教诲和殷切关怀，老师在工作和学习中对我严格要求，并时常在实习期间对我们进行指导与点拨，不仅培养了我们独立完成实验撰写论文的能力，而且锻炼了我与实验室其他同学的共同合作的能力。老师严谨的治学态度，一丝不苟的工作精神不仅使我在学业上收益颇丰，而且是我学习的榜样，对我的一生都具有重要的影响。诚挚感谢韩培师姐，在整个课题中，给予我许多帮助，使得课题得以顺利完成。最后，感谢实验室其他师兄师姐们的帮助与鼓励，有了你们的帮助，我的实习才能顺利完成，我今后在工作与学习中，也会秉承药大精业济群的校训，学习前辈们刻苦钻研，努力奋斗的精神，将药大精神发扬光大，勉励终生。附录一（有必要时）(黑体、三号、顶格，与内容空一行，X表示一，二，三等)（宋体、小四号，行距25磅）。
