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1、第八章,生物氧化与氧化磷酸化,Biological oxidation and oxidative phosphorylation,第一节生物氧化反应及氧化还原酶基本类型Reactions and Oxidative-Reductive Enzymes in Biological Oxidation,一、体内进行的氧化还原反应就是生物氧化,泛指在生物体内发生的任何氧化还原反应，也包括营养物和生物分子在生物体（细胞）内进行的氧化还原作用。营养物和生物分子经历氧化还原反应被彻底分解，产生H2O、CO2，并伴有ATP的生成，或转化为其它分子,此过程需耗氧、排出CO2，又在活细胞内进行，故又称细胞呼吸
2、(cellular respiration)。,*生物氧化（biological oxidation）,CO2和H2O,O2,能量,ADP+Pi,ATP,热能,*生物氧化的一般过程,*生物氧化特点：生物分子在体内的反应条件温和，逐步反应，逐步释能，常伴有分解释能反应与需能反应偶联，或能量形式的转换。,氧化还原酶类促进的氧化反应，包括失电子、脱氢和加氧不同反应方式，参与产生能量或催化物质代谢变化。加水脱氢是重要的脱氢反应，酶催化向底物加入水分子同时脱去一对氢，相当于底物加入一个氧原子。,*生物体内的氧化还原反应类型,二、很多氧化酶直接以氧为受氢/电子体,氧化酶类是一大类酶的统称，泛指催化涉及氧分
3、子（O2）的反应。分为4组：氧化酶（oxidases）需氧脱氢酶(aerobic dehydrogenases)加氧酶(oxygenases)氢过氧化物酶（hydroperoxidases）特点：分别存在于不同亚细胞结构中，多数催化物质转化，与ATP的生成无关。,（一）某些氧化酶辅基含铜或铁卟啉 催化的反应可以O2为直接受氢体，产物为H2O。其辅基主要成分是Cu2+或铁卟啉，主要存在于线粒体。如细胞色素C氧化酶、抗坏血酸氧化酶。（二）需氧脱氢酶直接还原氧生成过氧化氢 属于黄素酶(flavoenzyme)，辅基成分为FAD或FMN，如醛脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、L-氨基酸氧化酶等。它们催化的反应以O
4、2为直接受氢体，产物为H2 O2。黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)辅基还含有钼（Mo）和铁-硫蛋白。,各种加氧酶以及氢过氧化物酶包括过氧化氢酶(catalase)、过氧化物酶(peroxidase)主要存在于微粒体，参与某些代谢物、药物、毒物的转化或清除。,（三）直接涉及氧反应的酶还有加氧酶和过氧化酶,三、不需氧脱氢酶不能直接以氧为受氢体,不需氧脱氢酶（anaerobic dehydrogenases）：指能催化底物脱氢而又不以氧为直接受氢体的酶。此类酶不是将氢（H+e-）直接传递给O2，而是使H活化并由辅酶或辅基接受，产生还原型辅酶或辅基。主要功能：（1）作为呼吸链/电子传递
5、链中氢或电子载体，间接将氢或电子传递给O2，生成H2O，与产生ATP相关。（2）催化不涉及呼吸链/电子传递链偶联的氧化还原反应，促进代谢物之间氢的交换。（3）通过催化可逆的反应促进还原当量在细胞内的自由运转或穿梭。,NAD+和NADP+的结构,R=H:NAD+;R=H2PO3:NADP+,（一）很多不需氧脱氢酶以尼克酰胺腺嘌呤核苷酸为受氢体,NAD+（NADP+）的加氢和脱氢反应,氧化还原反应的变化发生在五价氮和三价氮之间。,（二）某些不需氧脱氢酶以黄素核苷酸为受氢体,琥珀酸脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶、NADH-Q氧化还原酶和琥珀酸-Q还原酶等分别以黄素单核苷酸（flavin mononucle
6、otide，FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD为辅酶。,FMN的加氢和脱氢反应,FMN结构中含核黄素，功能部位是异咯嗪环，氧化还原反应时不稳定中间产物是FMN。,FAD,（三）某些氧化还原酶以血红素为电子载体,Q-细胞色素c氧化还原酶以血红素bH、bL及c1为辅基，传递电子。,血红素 b,血红素 C,第二节 线粒体氧化体系与氧化磷酸化Mitochondrial oxidative system and oxidative phosphorylation,真核细胞ATP的生成主要发生在线粒体中。营养物质经脱氢酶催化脱下的成对氢原子（NAD
7、H+H+，FADH2），再通过位于线粒体内膜上多种酶和辅酶催化的氧化还原连锁反应逐步传递，最终与氧结合生成水。氧化反应逐步释放的能量可同时驱动质子跨膜转移到内膜外侧，形成跨线粒体内膜的质子梯度，该梯度势能再促进ATP的生成。营养物氧化、电子传递、质子泵流和ATP合成等过程结合偶联成一个整体,高效完成线粒体的呼吸作用。,呼吸链的定义在线粒体内膜中，由一系列具有氢和/或电子传递功能的酶复合体按一定顺序排列，组成的氧化还原体系称为呼吸链（respiratory chain）。因为传递氢相当于传递质子和电子（2H 2H+2e-），所以呼吸链又称电子传递链(electron transport chai
8、n)。组成电子传递体,一、呼吸链就是由电子传递体组成的氧化还原体系,（一）电子传递体是酶复合体的辅酶或辅基,电子传递体：就是组成呼吸链的几种酶复合体的辅酶或辅基，有的直接传递氢，有的传递电子。由于辅酶/辅基分子不同，受不同蛋白质内部环境影响不同，电子传递体具有不同的氧化还原电位（redox potential），决定了它们在呼吸链中的排列次序。,某些电子传递体直接传递氢 包括NAD+、FMN、FAD和泛醌。,2.铁硫蛋白和细胞色素传递电子 Fe2+Fe3+e-,泛醌（Coenzyme Q,CoQ,Q）由多个异戊二烯连接形成较长的疏水侧链（人CoQ10），氧化还原反应时可生成中间产物半醌型泛醌。
9、,泛醌的加氢和脱氢反应,铁硫蛋白中辅基铁硫中心(Fe-S)含有等量铁原子和硫原子，其中一个铁原子可进行Fe2+Fe3+e-反应传递电子。属于单电子传递体。,表示无机硫,铁硫蛋白(iron-sulfur protein),细 胞 色 素（Cytochrome，Cyt）,细胞色素是一类以血红素（heme）为辅基的电子传递蛋白，根据它们吸收光谱不同而分类。,各种还原型细胞色素的主要光吸收峰,（二）复合体、和在电子传递中有质子泵作用,采用胆酸、脱氧胆酸处理线粒体内膜，经硫酸铵分级分离，可纯化出呼吸链成分，得到4种酶复合体（complex）。复合体、和完全镶嵌在线粒体内膜中，在参与电子传递过程，同时驱动
10、产生跨线粒体内膜的质子梯度。复合体镶嵌在内膜的内侧，只参与电子传递。,人线粒体呼吸链酶复合体,注细胞色素c不参与酶复合体组成，而是作为可溶性蛋白在复合体和之间自由移动。,1.复合体将NADH+H+中的两个质子/电子传递给泛醌（ubiquinone）,复合体又称NADH-泛醌还原酶复合体电子传递：NADHFMNFe-S CoQ Fe-S CoQ 每传递2个电子可将4个H+从内膜基质侧泵到胞浆侧，复合体有质子泵功能,NADH FMN N1a（N3,N1b,N4）N2 QP-N Q,（Fe2S2）（Fe4S4）（Fe2S2）（Fe4S4）（Fe4S4）,目前推测复合体中电子传递顺序如下：,复合体的功
11、能,复合体是三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶，又称琥珀酸-泛醌还原酶,4个亚基组成，以FAD、Fe-S和血红素b（heme b566）为辅基电子传递：琥珀酸FAD几种Fe-S CoQ复合体没有H+泵的功能,2.复合体将质子/电子从琥珀酸传递到泛醌。,3.复合体将电子从泛醌传递给细胞色素c,泛醌-细胞色素C 还原酶同二聚体结构,复合体又叫泛醌-细胞色素C还原酶，细胞色素b-c1复合体，含有细胞色素b(b562,b566)、细胞色素c1和一种可移动的铁硫蛋白(Rieske protein)泛醌从复合体、募集还原当量和电子并穿梭传递到复合体电子传递过程：CoQH2(Cyt bLCyt bH)Fe-S Cy
12、tc1Cytc,复合体的电子传递通过“Q循环”实现。复合体每传递2个电子向内膜胞浆侧释放4个H+，复合体也有质子泵作用。Cyt c是呼吸链唯一水溶性球状蛋白，不包含在复合体中。将获得的电子传递到复合体。,4.复合体将电子从细胞色素c传递给氧,复合体又称细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)电子传递：Cyt cCuACyt aCyt a3CuBO2Cyt a3CuB形成活性双核中心，将电子传递给O2。每2个电子传递过程使2个H+跨内膜向胞浆侧转移,细胞色素C氧化酶CuA中心,细胞色素氧化酶a3-CuB中心,复合体的电子传递过程,细胞色素c氧化酶CuB-Cyta3中心使O2还
13、原成水的过程，有强氧化性中间物始终和双核中心紧密结合，不会引起细胞损伤。,（三）体内有两条重要的呼吸链,呼吸链组分的顺序是根据呼吸链各组分的标准氧化还原电位（E0）、由低到高排列的，即电子总是从低电位组分向高电位组分传递。,标准氧化还原电位拆开和重组特异抑制剂阻断还原状态呼吸链缓慢给氧,由以下实验确定,呼吸链中各种氧化还原对的标准氧化还原电位,1.NADH氧化呼吸链NADH 复合体Q 复合体Cyt c 复合体O22.琥珀酸氧化呼吸链 琥珀酸 复合体 Q 复合体Cyt c 复合体O2,氧化呼吸链可分为两条途径:,NADH氧化呼吸链,FADH2氧化呼吸链,电子传递链中酶复合体电子传递示意图,二、呼
14、吸链释能与ADP磷酸化生成ATP的过程偶联进行,*定义氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)是指在呼吸链电子传递过程中偶联ADP磷酸化，生成ATP，又称为偶联磷酸化。,底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation)是底物分子内部能量重新分布，生成高能键，使ADP磷酸化生成ATP的过程。,（一）复合体、和是氧化磷酸化偶联部位,1.根据P/O比值推测氧化磷酸化偶联部位,2.根据电子传递时自由能变化确定偶联部位,G=-nFE,电子传递链自由能变化,氧化磷酸化偶联部位,（二）氧化磷酸化偶联的机制是跨线粒体内膜质子梯度偶联ATP生成,化学渗透假
15、说(chemiosmotic hypothesis)电子经呼吸链传递时，驱动质子（H+）从线粒体内膜的基质侧泵到内膜胞浆侧，从而产生膜内外质子电化学梯度储存能量,当质子顺浓度梯度回流时驱动ADP与Pi生成ATP。,1.呼吸链氧化驱动产生跨线粒体内膜的质子梯度,氧化磷酸化依赖于完整封闭的线粒体内膜；线粒体内膜对H+、OH、K、Cl离子是不通透的；电子传递链可驱动质子移出线粒体，形成可测定的跨内膜电化学梯度；增加线粒体内膜外侧酸性可导致ATP合成，而线粒体内膜加入使质子通过物质可减少内膜质子梯度，结果电子虽可以传递，但ATP生成减少。,化学渗透假说已经得到广泛的实验支持,化学渗透假说简单示意图,胞
16、液侧,基质侧,电子传递过程复合体(4H+)、(4 H+)和(2H+)有质子泵功能,化学渗透示意图及各种抑制剂对电子传递链的影响,F1：亲水部分（动物：33亚基复合体，OSCP、IF1 亚基），线粒体内膜的基质侧颗粒状突起，催化ATP合成。F0：疏水部分（ab2c912亚基，动物还有其他辅助亚基），镶嵌在线粒体内膜中，形成跨内膜质子通道。,ATP合酶结构组成,2.ATP合酶利用质子顺梯度回流释能合成ATP,质子通过ATP合酶Fo顺浓度梯度回流使F1亚基旋转,ATP合酶 Fo中a亚基和c亚基结构示意,通过C环的旋转，质子从内膜胞浆侧进入胞浆半通道，通过基质半通道释放进入线粒体基质。,c环与 亚基紧
17、密相连，当 c环旋转时会带动 亚基旋转。,当H+顺浓度递度经Fo中a亚基和c亚基之间回流时，亚基发生旋转，3个亚基的构象发生改变。,ATP合酶的工作机制,亚基旋转使亚基构象改变导致ATP合成和释放,三、ATP在能量捕获、转移、储存和利用过程中起核心作用,一般将G大于ATP（包括ATP），或G大于21 kJ/mol的磷酸化合物称为高能磷酸化合物。用符号P表示高能磷酸键。,（一）高能磷酸化合物的磷酰基水解时释放出大量自由能,高能磷酸化合物:,一些生物学重要的有机磷酸化合物水解时释放的标准自由能,（二）ATP是最重要的高能磷酸化合物,体内许多代谢物的“活化”反应（吸能）大多直接或间接地与ATP酸酐键
18、的水解放能反应相偶联，使“活化”反应能顺利进行。,ATP,ADP,机械能(肌肉收缩)渗透能(物质主动转运)化学能(合成代谢)电能(生物电)热能(维持体温),生物体内能量的储存和利用都以ATP为中心,人体内ATP的来源和去路:,（三）ATP是生物能转换、储存和利用的核心,ATP+UDPADP+UTP ATP+CDPADP+CTP ATP+GDPADP+GTP,核苷二磷酸激酶催化UTP、CTP、GTP生成,磷酸肌酸作为肌和脑中能量的一种储存形式,ATP,ADP,机械能(肌肉收缩)渗透能(物质主动转运)化学能(合成代谢)电能(生物电)热能(维持体温),生物体内能量的储存和利用都以ATP为中心,四、线
19、粒体内膜选择性地转运代谢物,线粒体基质与胞浆之间有线粒体内、外膜相隔，外膜对物质通透的选择性不强，内膜依赖各种跨膜转运蛋白(transporter)对各种物质的转运。,线粒体内膜中的一些转运蛋白对代谢物转运,（一）胞质中NADH通过两个穿梭机制进入线粒体,转运机制主要有两条:-磷酸甘油穿梭(-glycerophosphate shuttle)苹果酸-天冬氨酸穿梭(malate-asparate shuttle),1.-磷酸甘油穿梭主要存在于骨骼肌和脑中,2.苹果酸-天冬氨酸穿梭主要存在于心肌和肝中,（二）ATP-ADP转位酶促进ADP进入和ATP移出的偶联,ATP-ADP转位酶（ATP-ADP
20、 translocase）又称腺苷酸移位酶（adenine nucleotide translocase）,第三节,呼吸链功能调节及线粒体功能失调Functional Regulation of Respiratory Chain and Mitochondrial Dysfunction,呼吸链电子传递和ATP生成的偶联关系是相互依赖的。,一、ADP/ATP相互转换是调节氧化磷酸化速率的主要因素,二、甲状腺素刺激机体耗氧量和产热同时增加,甲状腺激素诱导Na+,K+ATP酶和解偶联蛋白基因表达增加。,（一）呼吸链抑制剂阻断呼吸链的电子传递 如：鱼藤酮（rotenone）（二）解偶联剂破坏电子传
21、递建立的跨膜质子电化学梯度 如：解偶联蛋白（uncoupling protein,UCP）（三）ATP合酶抑制剂同时抑制电子传递和ATP的生成 如：寡霉素（oligomycin）,三、三类氧化磷酸化抑制剂作用机制不同,鱼藤酮粉蝶霉素A异戊巴比妥,抗霉素A二巯基丙醇,CO、CN-、N3-及H2S,各种呼吸链抑制剂的阻断位点,不同底物和抑制剂对线粒体氧耗的影响,解偶联蛋白作用机制（棕色脂肪组织线粒体）,Q,胞液侧,基质侧,解偶联 蛋白,寡霉素(oligomycin)可阻止质子从F0质子通道回流，抑制ATP生成。,寡霉素,ATP合酶结构模式图,电子传递链及氧化 磷酸化系统概貌：,H+跨膜质子电化学梯
22、度H+m内膜基质侧H+H+c 内膜胞液侧H+,四、DNA突变影响氧化磷酸化并导致多种疾病,（一）线粒体功能蛋白质由核基因组/线粒体基因组编码 线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）：约17 kb,编码13种重要的呼吸链复合体亚单位、22种tRNA和2种rRNA。,（二）线粒体基因突变可导致线粒体病,线粒体DNA缺陷能导致氧化磷酸化功能损伤和能量代谢障碍，引起细胞结构、功能的病理改变，发生线粒体病（mitochondrial diseases）。,*mtDNA高突变致病原因：,1）其基因不含内含子且常有部分区域重叠,各种点突变都可能累及重要功能域；2）mtDNA缺乏组蛋白
23、的保护；3）DNA合成始终活跃，但DNA聚合酶不具校读功能，及缺乏有效的损伤修复系统；4）线粒体内膜是活性氧产生主要部位,mtDNA更容易受氧自由基攻击而发生突变,使其突变频率约为核基因的1020倍。,*线粒体疾病有以下特点：,mtDNA只来源于卵子,原发性mtDNA突变导致的线粒体疾病呈现典型的母系遗传特征,也是线粒体疾病诊断的重要依据；体细胞mtDNA突变数量会随着年龄增长而积累。只有当mtDNA突变超过一定阈值,野生型mtDNA的数量不足维持呼吸链的正常功能时,组织或器官异常才可表现临床表型；能量需求高的组织如骨骼肌、脑、心、肾等更易受突变影响。,*mtDNA突变类型,包括点突变、重排、
24、缺失和重复。如Leber 遗传性视神经病变（Lebers hereditary optic neuropathy，LHON）：存在mtDNA基因组的复合体亚基4（ND4）编码区G11778A突变与复合体组分细胞色素b基因的单碱基突变。如 MERRF病（myoclonic epilepsy and ragged-red fiber disease）：mtDNA编码赖氨酸tRNA基因的点突变。,（三）核基因突变也能造成线粒体功能障碍,核基因编码900多种线粒体功能必需的酶和蛋白质，除部分呼吸链复合体蛋白，还包括聚合酶、装配因子、转运蛋白、代谢酶等,需在胞质合成后转运到线粒体内。目前已鉴定出导致线粒
25、体疾病的致病核基因突变约40种。如线粒体基因和核基因突变引起复合体缺陷，都可引起Leigh氏综合征。,第四节 细胞抗氧化体系和非线粒体氧化-还原反应体系,Cellular Antioxidative System and Non-Mitochondrial Redox Reaction System,一、抗氧化体系具有清除反应活性氧功能,反应活性氧类(reactive oxygen species，ROS)主要指O2的单电子还原产物，是一类强氧化剂，包括超氧阴离子（O2-）、羟自由基（OH）和过氧化氢（H2O2）及其衍生的HO2和单线态氧（1O2）等。,自由基（free radical）是指任
26、何带未成对电子的原子、分子或基团。H2O2不是自由基，但在细胞内Fe2+或Cu+的存在下可通过芬顿（Fenton）或哈伯-韦斯（Haber-Weiss）反应转变成羟自由基。,（一）线粒体呼吸链是体内ROS的最主要来源,线粒体是ROS产生的主要部位，又是自由基的主要攻击靶点。,线粒体内产生：（1）O2-主要在呼吸链酶复合体（20）和复合体（80）中生成。（2）O2-和H+可能通过反应生成HO2。（3）线粒体膜间隙的氧还蛋白p66，外膜中的Cyt b5还原酶、单胺氧化酶、二氢乳清酸脱氢酶等也可产生ROS。,*线粒体外产生（1）微粒体加单氧酶系中Cyt P450还原酶可产生O2-；（2）细胞过氧化酶
27、体中，FADH2将电子交给O2生成H2O2和羟自由基OH；（3）质膜的NADPH氧化酶、胞质需氧脱氢酶可催化生成O2-、H2O2；（4）巨噬细胞、中性粒细胞等受炎症刺激时可生成O2-和H2O2，可杀死细菌；（5）外源因素也可导致细胞产生反应活性氧类。,Fe(),Fe(III),Fe(IV),Fe(III),Fe(III),Fe(III),e-,CuB+,O=O,O,O-OH,H+,H2O,微粒体细胞色素P450基本反应机制,Fe(III),O-O,Fe(),AOH,e-,H+,H2O2,2H+,O2,AH,O2,+,1.SOD：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase),正常细
28、胞内，O2-水平：10-1010-11 mol/L H2O2水平：10-9 mol/L,（二）机体抗氧化酶和抗氧化物体系清除活性氧类,2.过氧化氢酶(catalase)又称触酶，其辅基含4个血红素,3.过氧化物酶(peroxidase)以血红素为辅基，催化H2O2直接氧化酚类或胺类化合物,谷胱甘肽过氧化物酶,H2O2(ROOH),H2O(ROH+H2O),2G SH,G S S G,NADP+,NADPH+H+,谷胱甘肽还原酶,4.谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase），它可消除H2O2和R-OOH,二、细胞微粒体中存在加氧酶类,（一）微粒体细胞色素P450单加氧酶
29、催化底物分子羟化,这类酶催化O2中的一个氧原子加入底物(RH)分子，另一个氧原子被NADPH提供的氢还原成H2O，又称为混合功能氧化酶(mixed function oxidase)或羟化酶(hydroxylase)。,辅酶 Cyt P450属于Cyt b类，与CO结合后在波长450nm处出现最大吸收峰，还有NADPH、黄素蛋白、铁氧还蛋白参与电子传递。,（二）加双氧酶(Dioxygenase)催化向底物双键中加入两个氧原子,例 如：,第五节线粒体功能分析基本原理,Basic Principles of Mitochondrial Function Analyses,一、呼吸功能和内膜电位等指
30、标评价线粒体氧化还原功能,（一）线粒体呼吸功能,（二）内膜电位水平,（三）ATP合酶亚基的表达,在一定条件下，加入线粒体后，依次定量加入反应底物(苹果酸钠/L谷氨酸钠)、ADP，用Clark氧电极法等记录氧耗曲线，观察线粒体呼吸态的变化。3态呼吸（ST3）：ADP加入后相应氧耗速率。4态呼吸（ST4）：ADP耗尽后相应氧耗速率。呼吸控制率(respiratory control rate,RCR)：线粒体呼吸活性以单位线粒体蛋白耗氧表示(nmol/min mg)，其3、4态耗氧之比(ST3/ST4)表示RCR。,（一）检测重要参数显示线粒体呼吸功能,1.ST3：显示有呼吸底物时ADP对氧化磷酸
31、化刺激效应，与电子传递链、ATP合酶活性相关。2.ST4：四态呼吸时，无ATP的合成，显示质子漏状况。3.RCR反映氧化和磷酸化偶联程度。,*ST3、ST4和RCR的意义,测定方法及原理：正常的亲脂性的阳离子化合物能结合到线粒体内膜。1.罗丹明123(Rhodamine123)：可被活细胞线粒体特异摄取，且摄取率与膜电位成正比。2.染色剂JC-1：内膜电位依赖性荧光染料特性，当内膜电位小于100 mV时，JC-1以单体存在，490nm激发光下形成绿色荧光；内膜电位升高时，JC-1在内膜聚集形成橙色荧光。,（二）内膜电位水平与线粒体正常功能密切相关,跨内膜电位（质子电化学梯度）是反映线粒体呼吸链及合成ATP功能的重要指标，被广泛应用。,（三）蛋白印渍技术测定ATP合酶亚基表达,二、测定蛋白复合物活性反映呼吸链电子传递功能,基本方法：反应体系中含有待测复合体相应底物、电子受体和下游复合体抑制剂，加定量线粒体蛋白温育。加底物启动反应后，在线性范围内以特定波长，检测底物/产物的氧化/还原水平改变。,（一）呼吸链蛋白复合体活性检测显示电子 传递速率,（二）蛋白印渍技术测定呼吸链复合体蛋白 表达,
