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1、 2013届毕业生毕业论文核桃青皮提取物的抑菌活性研究学生姓名 学 号 7021209215 所属学院 生命科学学院 专 业 应用化学 班 级 13-2班 指导教师 日 期 2013年5月 塔里木大学教务处目 录摘 要1关键词1前言21 材料与方法21.1 实验材料21.1.1 供试材料21.1.2 供试菌种21.2 供试仪器与试剂21.2.1 实验仪器21.2.2 实验试剂31.3 实验方法31.3.1 核桃青皮提取物的制备31.3.2 SDA、SDB培养基的制作31.3.2.1 SDA培养基的制作31.3.2.2 SDB培养基的制作31.3.2 抑菌活性测定31.3.2.1 微孔板生物检测
2、法抑菌活性测定31.3.2.2 牛津杯抑菌活性检测法（管碟法）抑菌活性测定42 实验结果与分析42.1 微孔板生物检测法最小抑菌浓度和最小杀菌浓度数据与分析42.2 牛津杯抑菌活性检测法（管碟法）抑菌圈直径的数据与分析53 结论与讨论6参考文献7致 谢8核桃青皮提取物的抑菌活性研究 摘 要：【目的】研究核桃青皮提取物的抑菌活性。【方法】采用5种溶剂对核桃青皮进行平行提取和液液萃取。以白色念珠菌（Canidida Albicans）（标准、临床分离）、克柔氏念珠菌（Candida Krusei）、热带念珠菌（Candida Tropicalis）4种病原真菌为靶标，采用微孔板生物检测法和牛津杯抑
3、菌活性检测法（管碟法）对核桃青皮不同溶剂提取液进行抑菌活性测定。【结果】核桃青皮乙酸乙酯提取物相对供试的4种病原真菌抑制效果最好，抑菌圈直径分别为11.94 mm、11.12 mm、10.31 mm、10.23 mm；正丁醇的抑制效果次之，抑菌圈直径分别为9.11 mm、9.20 mm、9.3 mm、09.45 mm；氯仿提取物、石油醚提取物、水提取物对供试的4种病原真菌抑制效果较差。【结论】核桃青皮提取物具有抑菌活性，抑菌物质主要集中在中高极性部位。关键词：核桃青皮；抑菌活性；微孔板法；牛津杯法Study on antifungal activities of extracts from W
4、alnut green peel (Juglans regia) Huang Huan-huan (College of Life Sciences,Tarim University,Alar, XinJiang,843300)Abstract: 【Objective】Research antibacterial activity of the Walnut peel extract 【Methods】5 solvent extraction and liquid - liquid extraction parallel Walnut. In order to the Candida albi
5、cans the (standard, clinical isolates of), the grams of Sophies Candida, Candida tropicalis, Candida the 4 kinds of pathogenic fungi as the target standard, carried out the antibacterial activity of Determination of on the walnut Peel extracted by different solution. 【Results】Walnut ethyl acetate ex
6、tract relative tested four kinds of pathogenic best inhibitory effect, inhibition zone diameter to 11.94 mm, 11.12 mm, 10.31 mm, 10.23 mm; followed by the inhibitory effect of n-butanol, inhibition zonediameter do not as 9.11 mm, 9.20 mm, 9.3 mm, 09.45 mm; chloroform extract, petroleum ether extract
7、, water extract tested four kinds of pathogenic poor inhibitory effect.【Conclusion】Walnut extract has antibacterial activity of antibacterial substances are mainly concentrated in high polar fractions.Keywords: Walnut peel; Fungistasis; Microplate method; Oxford Cup前言随着人们生活质量的提高和环保意识的增强，开发对人畜安全、无污染、
8、低毒、低残留的生物医药成为医药领域研究的新热点。植物源杀菌剂是一类利用植物中含有杀菌活性物质的某些部分或提取有效成分制成的杀菌剂。具有高效、低毒或无毒、无污染、选择性高，不损害人体机能等优点，符合医药从传统的有机化学物质向环境和谐医药（Environmental harmony medicine）或生物合理性医药（Biological plausibility medicine）转化的发展趋势。核桃青皮又称青龙衣，为核桃外部的一层厚厚绿色果皮。核桃青皮中含有丰富的抗菌坑病毒抗肿瘤的物质，具有极大的开发和利用价值。我国年产核桃青皮45万吨，每年用于药用的核桃青皮只是少部分，绝大部分的桃青皮都作为
9、废弃物而造成浪费，极大的浪费了我国这一丰富资源。大量青皮成为垃圾堆放在田间、地头或沟边污染环境，如果对其加以利用，不仅可以防止环境污染，还可以增加果农的收入。念珠菌病主要是念珠菌引起的急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病。常侵犯皮肤、粘膜，也可引起内脏或全身感染。临床症状错综复杂，急缓不一。儿童多为急性继发性感染。近年来随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，以及器官移植术的开展，其发病率渐趋增高，并可危及生命造成严重后果。故寻找一种天然低副作用的抗真菌药成为了现在医学领域研究的一个重要方向。核桃青皮提取物不仅对水稻纹枯、棉花立枯、油菜菌核、小麦纹枯等供试植物病原真菌具有较好的抑菌活性,
10、而且对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等供试细菌也具有较好的抑制作用，并且抑菌活性成分主要集中在中高极性部位。姚焕英等人总结了核桃青皮中的 9种醌类及其衍生物。胡桃醌是核桃青皮中主要的毒性物质，具有明显的抑菌和抗癌作用。醌类衍生物的毒性，一般都小于胡桃醌。核桃青皮中的醌类物质对多种体内移植性肿瘤有明显的抑制作用，体外杀伤细胞的作用更强，且毒性较低，其他成分的提取物也有不同程度的抗菌、抗肿瘤、镇痛等作用。本实验利用新疆特色地产核桃青皮为实验材料，以白色念珠菌（Canidida Albicans）（标准、临床分离）、克柔氏念珠菌（Candida Krusei）、热带念珠菌（Candida Tropic
11、alis）4种人体病原真菌为靶标，采用微孔板生物检测法和牛津杯抑菌活性检测法（管碟法）对核桃青皮不同溶剂提取液进行抑菌活性测定，可为新疆丰富核桃资源的综合开发利用提供依据。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供试材料核桃青皮提取物：在核桃成熟前期，分别于6月、7月和8月份去阿克苏核桃产区采摘新鲜的核桃青皮，使用 95工业酒精浸泡 3次，合并提取液减压浓缩，得到核桃青皮乙醇浸膏。将核桃青皮乙醇浸膏溶于水，得到水悬浮液，然后依次用石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯萃取，合并剩余的水提取物，就可以得到核桃青皮的五种提取物。（提取流程见图 1）1.1.2 供试菌种白色念珠菌（临床分离）（Candid
12、a Abicans1634 Ca1634）；白色念珠菌（标准）（Canidida Abicansatcc CaATCC）；热带念珠菌 （Candida Tropicalis CT）；克柔念珠菌 （Candida Krusei CK）。以上菌种由塔里木大学生物研发中心曾红副教授提供。1.2 供试仪器与试剂1.2.1 实验仪器MLS-3750 高压灭菌锅（SANYO Electril Co-Ltd）；Pax-350c 智能光照培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂）；JJT-1300 超净工作台（北京德天佑科技有限公司）；HZQ-F160 恒温振荡培养箱（哈尔滨东联电子技术有限公司）；SY-500超声仪（
13、上海宁商超声仪器有限公司）；BS124S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；HH-2智能数显恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）；101电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；WP800TL23-K3 微波炉（Galan 2）；电磁炉。1.2.2 实验试剂葡萄糖（北京奥星生物技术有限责任公司）；蛋白胨（北京奥星生物技术有限责任公司）；琼脂粉（北京中北林格科技发展有限公司）；二甲亚砜、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均为天津市天力化学试剂有限公司生产分析纯。图1 核桃青皮提取物的提取流程图Figure 1 Walnut peel extract extraction flowchart1.
14、3 实验方法1.3.1 核桃青皮提取物溶液的制备 准确称取核桃青皮水提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物各0.48 g，溶于30 mL 5%的二甲亚砜溶液中，制成16 mg/mL的核桃青皮提取液，装于50 mL锥形瓶，塑料布封口后用报纸或牛皮纸包扎好，湿热125 灭菌20 min，储藏备用。1.3.2 SDA、SDB培养基的制作1.3.2.1 SDA培养基的制作4 称取20 g葡萄糖、10 g蛋白胨、1618 g琼脂粉加入1000 mL水煮5 min，用玻璃棒不断搅拌，加热至沸腾使之充分溶解，趁热分装于200 mL三角瓶。塑料布封口后用报纸或牛皮纸包扎好，湿热 125
15、 灭菌20 min，储藏备用。1.3.2.2 SDB培养基的制作2 称取20 g葡萄糖、10 g蛋白胨加入1000 mL水煮5 min，用玻璃棒不断搅拌，加热至沸腾使之充分溶解，趁热分装于200 mL锥形瓶，塑料布封口后用报纸或牛皮纸包扎好，湿热125 灭菌20 min，储藏备用。1.3.2 抑菌活性测定1.3.2.1 微孔板生物检测法抑菌活性测定11 平底96微孔板上取1孔作为空白对照孔，微孔内装有100 L药液、100 L病原菌液；9、10孔装有100 L SDB培养基液、100 L病原菌液；11、12孔装有200 L SDB培养基液。28孔加入100 L SDB培养基液后，2孔加入100
16、 L药液，然后采用对半稀释法稀释到8孔，弃去100 L，得到浓度倍半递减的药液，最后接种病原菌100 L，制成有毒培养基平板。其中A、B行加入石油醚相，C、D行加入氯仿相，E、F行加入乙酸乙酯相，G、H加入正丁醇相，每个菌种、每个浓度设3板重复。水萃取相微孔加入方法相同，药液均为水萃取相，A、B行加入克柔氏念珠菌，C、D 行加入热带念珠菌，E、F行加入白色念珠菌（标准），G、H行加入白色念珠菌（临床分离），同样设3板重复。放在 25 的光照培养箱中培养 48 h后观察菌落生长情况，测量每种药液的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）。1.3.2.2 牛津杯抑菌活性检测法（管碟法）抑菌活
17、性测定12取1.5 mL培养好的克柔氏念珠菌菌悬液与150 mL冷却至50 的培养基充分混匀，倒入9 cm培养皿中制成带菌的平板。将灭过菌的牛津杯（d = 60.1 mm）放在制备好的带菌平板中央，并加入200 L的药液，每种药液重复3皿。以同样的方法制备热带念珠菌、白色念珠菌（标准）、白色念珠菌（临床分离）的平板，重复3皿。放在25 的光照培养箱中培养，培养24 h再补充200 L的药液，等到48 h后观察牛津杯周围病原菌的生长情况，并用十字交叉法测量抑菌圈直径（不包括牛津杯直径 6 mm）。抑菌圈平均直径=抑菌圈直径之和/抑菌圈总数2 结果与分析2.1微孔板生物检测法最小抑菌浓度和最小杀菌
18、浓度数据与分析表 1 各相提取物的最小抑菌浓度（MIC）Table 1 The minimum inhibitory concentration of each phase extract (MIC )提取物最小抑菌浓度（MIC）/（mg/mL）Ca1634CaATCCCTCK水提取物888-氯仿提取物-4-正丁醇提取物4444石油醚提取物-8-乙酸乙酯提取物2244注：“-”代表无抑制效果表 2 各相提取物的最小杀菌浓度（MFC）Table 2 Minimum bactericidal concentration of the respective phases extract ( MFC
19、)提取相最小杀菌浓度（MFC）/（mg/mL）Ca1634CaATCCCTCK水提取物161616-氯仿提取物-8-正丁醇提取物8888石油醚提取物-1616-乙酸乙酯提取物4488注：“-”代表无抑制效果核桃青皮不同溶剂提取液对4种供试病原真菌的抑菌作用结果见表1、表2。由上表可以看出，对白色念珠菌（临床分离）（Candida Abicans1634）抑制效果最好的为乙酸乙酯提取液，最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）分别为2 mg/mL 和4 mg/mL，氯仿提取液和石油醚提取液的抑制效果最差，几乎无抑制效果，水相提取液的抑制效果不明显；核桃青皮乙酸乙酯提取液对白色念珠菌（标准）
20、（Canidida Abicansatcc）的抑制效果也最好，最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）分别为2 mg/mL 和4 mg/mL，正丁醇和水相提取液对白色念珠菌（标准）（Canidida Abicansatcc）的抑制效果次之，氯仿提取液的抑制效果最差，几乎无抑制效果，石油醚提取液的抑制效果不明显；核桃青皮水乙酸乙酯提取液也对热带念珠菌（Candida Tropicalis）的抑制效果最好，最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）分别为4 mg/mL 和8 mg/mL，正丁醇、水和氯仿提取液的抑制效果较好，石油醚提取液的抑制效果最差，最小杀菌浓度（MFC）为16 mg/
21、mL；同时桃青皮乙酸乙酯和正丁醇提取液对克柔念珠菌（Candida Krusei）的抑制效果最好，最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）分别为4 mg/mL 和8 mg/mL，水、石油醚和氯仿提取液的抑制效果较差，几乎无抑制效果。2.2 牛津杯抑菌活性检测法（管碟法）抑菌圈直径的数据与分析表3 各相提取物的抑菌圈直径 Table 3 Each phase extraction material inhibition zone diameter提取相提取物浓度/（mg/mL）抑菌圈直径/（mm）Ca1634CaATCCCTCK水提取物168.030.217.860.467.910.358
22、.050.48氯仿提取物165.980.155.800.616.210.516.050.21正丁醇提取物169.110.369.200.239.300.419.450.32石油醚提取物165.760.116.040.185.400.245.310.19乙酸乙酯提取物1611.940.2411.120.3310.310.3810.230.25图2 各相提取物的抑菌圈直径Figure 2 Each phase extraction material inhibition zone diameter图注：图为核桃青皮不同溶剂提取液对4种供试病原真菌的抑菌圈直径结果。其中A为桃青皮乙酸乙酯提取相，B为
23、核桃青皮正丁醇提取相，C为核桃青皮水提取相，D为核桃青皮氯仿提取相，E为核桃青皮石油醚提取相。图3 牛津杯抑菌活性检测法（管碟法）抑菌圈效果图Figure 3 Oxford Cup antibacterial activity assay (plate method) zone of inhibition effect diagram核桃青皮不同溶剂提取液对4种供试病原真菌的抑菌圈直径结果见表3。由上表可知，提取物浓度为16 mg/mL时，核桃青皮不同溶剂提取液对4种供试病原真菌具有一定的抑制效果。其中乙酸乙酯相、正丁醇相和水相对4种供试病原真菌的抑制效果较为明显，抑菌圈直径均在7.00 mm
24、以上；而氯仿相、石油醚相的效果不明显，抑菌圈直径基本在6.00 mm以下。根据牛津杯抑菌活性检测法（管碟法）3中相关资料可知，氯仿相、石油醚相对4种供试病原真菌没有抑菌效果。4种提取液中，乙酸乙酯相的抑菌效果最好，抑菌圈直径在10.00 mm以上；正丁醇相次之抑菌圈直径在9.0010.00 mm之间；水相提取物有一定抑制效果，但抑菌圈直径较小，在7.008.00 mm之间，抑菌效果很微弱。3 结论与讨论从研究结果中可以看出，核桃青皮乙酸乙酯提取液对白色念珠菌（临床分离）（Candida Abicans1634）、白色念珠菌（标准）（Canidida Abicansatcc）、热带念珠菌（Can
25、dida Tropicalis）、克柔念珠菌（Candida Krusei）的综合抑制效果最好, 其最小抑菌浓度（MIC）在2 4 mg/mL之间，最小杀菌浓度（MFC）在4 8 mg/mL之间，且核桃青皮乙酸乙酯提取液对四种真菌的抑菌圈直径均在10 mm以上；正丁醇提取物的抑制效果次之，其最小抑菌浓度（MIC）为4 mg/mL，最小杀菌浓度（MFC）为8 mg/mL，且核桃青皮乙酸乙酯提取液对四种真菌的抑菌圈直径均在9 mm以上。这说明核桃青皮中的抑菌物质主要集中在中高极性部位,因此对此部分提取物的进一步追踪分离将有望发现具开发价值的抗菌活性物质。这也意味着核桃青皮在人体念珠菌疾病防疫、治疗
26、方面有着很好的利用价值和发展前景。1985年，许绍惠等首次从核桃的青皮中分离提纯出胡桃醌，并鉴定了结构。新鲜山核桃青皮中胡桃醌含量较高，达到 0.42。另外，姚焕英等人总结了核桃青皮中的 9种醌类衍生物。胡桃醌是核桃青皮中主要的毒性物质，具有明显的抑菌和抗癌作用7。醌类衍生物的毒性，一般都小于胡桃醌。核桃青皮中的醌类物质对多种体内移植性肿瘤有明显的抑制作用，体外杀伤细胞的作用更强，且毒性较低，其他成分的提取物也有不同程度的抗菌、抗肿瘤、镇痛等作用。查阅其它文献的研究结果可知，核桃青皮不同极性的提取物对某些植物源致病菌（如苹果腐烂病菌、红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌等）有较好的抑制效果8 9 10，
27、并且抑菌活性成分主要集中在中高极性部位 8 。通过本实验的研究可知，如果用乙酸乙酯对核桃青皮中的次生物质进行提取可达到最大抑菌效果。若能将核桃青皮合理开发，成为很好的杀菌药品材料，就可以把新疆的核桃资源进一步的利用，为研发和应用植物源医药品奠定基础。核桃青皮萃取物的抑菌机理尚不清楚，由于萃取物中的抗菌成分多且较为复杂，还需对中高极性部分提取物更深入细致地研究和探讨，以期确定和鉴定抗真菌的有效化学成分，为把核桃青皮研制开发成新型天然抗真菌药物以及使核桃青皮变废为宝而成为很好的抗真菌药物生产原材料提供理论依据。参考文献1景炳年.核桃次生物质抗烟草花叶病毒活性的研究D.西北农林科技大学,2007.2
28、苏学友.核桃青皮提取物抑菌活性研究D.新疆农业大学,2008.3雷波.管碟法测定抗生素效价方法的优化研究J.重庆师范大学学报(自然科学版）,2006,25(03):85-87.4苏学友,李疆,师光禄等.核桃青皮提取物对6种植物病原真菌的抑菌活性研究.北京农学院学报,2008,23(01):42-44.5刘峰,骆健美,刘丹等.基于抑菌活性的纳他霉素微孔板生物检测法J.食品与发酵工业,2009,17(02):142-145.6翟梅枝,王磊,何文君等.核桃青皮乙醇提取物抑菌活性研究J.西北植物学报,2009,22(12):2542-2547.7潘富赟,张培正.核桃青皮的综合应用及开发前景J.中国食物
29、与营养,2010,09(12):21-24.8李海洋.核桃青皮有效化学成分及抑菌性研究D.西北农林科技大学,2012.9王磊.核桃青皮次生物质的抑菌活性研究D.西北农林科技大学,2010.10吕海宁,张克诚,崔增杰等.核桃青皮体外抑菌活性的研究J.华西药学杂志,2011,11(02):150-152.11骆健美,成永新,李培君等.基于抑菌活性的-聚赖氨酸的微孔板生物检测法J.微生物学通报,2011,23(07):976-981.12王新霞,宋雪玲.管碟法对抗生素药品效价的微生物检定J.延安大学学报(医学科学版),2011,35(03):58-68.13杨晓楠,王猛,申瑞平等.微孔板法检测番茄灰
30、霉病菌对杀菌剂的敏感性J.中国农业科学,2012,37(15):3075-3082.14黄英.管碟法测定抗生素效价的影响因素分析J.中国药师,2005,41(08):689-691.15 Haque R,Bin-Hafeez B,Parvez S,etal,Aqueous extrat of walnut (Juglans regia L). protects miceaganst cyclphosphamide-induced biochemical toxicityJ.Human Experimental Toxitocity,2003, 22(4):473-480.16 Bianca M
31、 P,Andrea S, Antonella T, et al. Long-term follow-up of toenail onychomycosis caused bydermatophytes after successful treatment with systemic antifungal agents.Journal of the AmericanAcademy of Dermatology, 2010,62(3):411-414. 致 谢本研究及学位论文是在我的导师白红进教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着
32、我。从课题的选择到项目的最终完成，白老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。在此衷心地向白老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。我还要特别感谢生物研发中心的曾红副教授，她牺牲自己的宝贵的时间，给我实验以最大的帮助和支持。另外，感谢在一起愉快的度过实验室生活的各位同学和师兄师姐，特别感谢边梅娜师姐，对本课题做了不少工作，给予我很多帮助。正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。我还要感谢自己的家人还有帮助过我的朋友，在我试验遇到瓶颈或是阻碍的时候，是他们一直默默的在背后支持着我，鼓励着我，她们给我了继续前进动力的源泉。最后，感谢我的学校塔里木大学生命科学学院能给我一个良好学习和科研的环境，祝所有关心我的人和我关心的人身体健康，事业顺利。
