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1、毕业设计说明书(论文)作 者： 学 号： 0904150116 院 系： 化学工程学院 专 业： 生物工程 题 目： 富油微藻的诱变与遗传转化 指导者： 副教授 评阅者： 2013 年 6 月 吉 林摘 要温室效应与石化能源紧缺已成为全球问题，生物燃料作为一种可再生且环境友好型的替代能源受到人们的广泛关注。不少微藻含油量高，环境适应能力强，净碳值几乎为零，尤其是生物柴油最重要的原料来源之一。本论文对高油脂微藻藻种筛选、高密度培养，实验中利用了苏丹黑染色法将藻细胞染色，在645nm波长光下测量吸收峰并进行比对，最高的吸收峰值即可得出藻种富油最佳的培养基，即富油微藻的最优代谢生长环境条件；同时利用
2、酸热萃取法提取测量该最优富油环境下藻细胞中含油量为38.16mg/g。通过本课题实验，会对提高微藻生物柴油的经济性提出一条极有可能实现工业化的潜在高效的生产途径。关键词 生物柴油 富油微藻 代谢条件 苏丹黑染色法 酸热萃取法AbstractThe greenhouse effect and petrochemical energy shortage has become a global issue, biomass as a renewable and environmentally friendly alternative energy attention. A lot of microa
3、lgae with high oil content, strong adaptive capacity to environment, net carbon value is almost zero, it is the most important source of biodiesel. In this paper, the high oil microalgae screening, high density culture, the Sultan black staining the algae cell staining, measuring the absorption peak
4、 and compared in the 645nm wavelength, the maximum absorption peak to the medium of algal oil rich best, that is the optimal metabolic oil-rich microalgae growth condition at the same time, the optimal extraction; measurement of oily algae oil environment for 38.16mg/g by using acid hot extraction m
5、ethod.Through the experiment, put forward a potentially efficient production way is very likely to achieve industrialization to improve the economy of microalgae biodiesel.Key words Biodiesel; Oil-rich microalgae; Metabolic conditions; Sultan black staining; Acid hot extraction method目 录摘 要IABSTRACT
6、II目 录III第1章 绪 论11.1 课题研究背景11.1.1研究项目背景11.1.2微藻固定CO2及与油脂代谢的关系21.1.3基因工程技术微藻脂类代谢途径21.1.4基因工程方法改造微藻31.2 课题研究目的和意义51.3国内外研究现状和发展趋势51.4 主要研究内容与技术路线91.4.1 主要研究内容91.4.2 实验中可能遇到的困难和解决办法91.4.3 采用的技术路线9第2章 实验材料和方法112.1实验材料112.1.1藻类培养基的配制方法112.2 微藻藻种采集分离纯种培养及保存方法122.2.1藻种采集及富集培养122.2.2藻种的分离132.2.3藻种的纯化培养142.2.
7、4藻种的保藏142.3筛选获得实验藻类152.4实验流程152.4.1接种152.4.2不同代谢条件驯化162.4.3苏丹黑染色162.4.2苏丹黑B染色液的配制163.2.3染色后微藻细胞的吸光值与油脂含量172.4.4测量含油量18第3章 不同碳氮比下培养微藻产油结果193.1不同代谢条件驯化193.2苏丹黑B染色测微藻油脂203.3 不同碳氮比条件下微藻吸光度数据213.4实验数据分析22第4章 微藻富油脂化培养的初步探讨23结 论24参考文献25致 谢28 第1章 绪 论1.1 课题研究背景1.1.1研究项目背景能源是国民经济可持续发展的动力，是现代工业的支柱。现今石化燃料资源日益枯竭
8、给全球经济发展带来危机，其燃烧产物CO2造成的温室效应也给全球环境敲响警钟，人们逐渐开始寻求替代能源。生物质能是地球上最普遍的一种可再生能源，它通过植物光合作用将太阳能，以化学能形式储存在生物体内，被称为绿色能源。现今欧洲国家广泛使用的生物柴油便是一种生物质能，其原料主要来自高油脂农作物，如大豆、葵花籽等，但它们都存在产量低、成本高、经济性差、与其他农作物争夺土地等缺点，所以在原料的选择上应更加审慎和全面考虑。藻类，尤其微藻，能有效利用太阳能，将H2O、CO2和无机盐转化为有机资源，在能量转化和碳循环中十分重要。微藻富含蛋白质、脂肪、糖以及氨基酸、高不饱和脂肪酸等多种生物活性物质，是人类向海洋
9、索取食品、药品、精细化工产品等重要材料的一把金钥匙。就全球来说，微藻是巨大的可再生资源，同时也是生物燃料的重要来源。微藻可生产几种生物燃料:一些微藻富含类似矿物油的烃类物质，可加工成汽油、柴油使用1;利用微藻生物质厌氧消化可以生产甲烷等气体燃料2;一些蓝藻和绿藻能在特定条件下通过光合作用产氢3;另一些微藻能将光合产物转化成油脂储存在细胞质中，该油脂与高等植物油相似，都属甘油三酯(TAG，又称中性脂，油脂)，可加工转化为含硫量、黏度及熔点较低的酯类，如脂肪酸甲酯(C14C22)，即生物柴油4。微藻具有光合效率高，零净碳值，易培养，生长周期短，油、烃含量高等优点5，并且“不与农争地，不与人争粮”，
10、不影响全球能源分配，其作为生物能源，已引起各国政府和学者的高度关注。1.1.2微藻固定CO2及与油脂代谢的关系自养微藻以CO2为碳源，了解微藻固定CO2及其与油脂代谢的关系，采用基因工程尽可能将CO2转化为油脂，达到固碳和产油双重功效，成为基因工程的研究方向。还原戊糖磷酸途径(C3途径)、双羧酸途径(C4途径)，景天酸代谢途径(CAM途径)、是植物的三大光合碳代谢途径。其中，C3途径较简单较古老，是大多数植物的碳固定机理;C4和CAM途径则比较复杂，一般只在一些高度进化的植物中出现，没有C3途径广泛，尤其CAM机理只存在于仙人掌等耐旱植物中。微藻为低等单细胞生物，被认为普遍依靠C3途径，现在仅
11、在Phaeodactylum tricornutum等少数硅藻中发现了C4途径存在的证据。C3循环中，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶催化核酮糖-1，5-二磷酸固定CO2，生成3-磷酸-甘油酸，该分子也是糖酵解的中间体，可进一步生成油脂。这个酶催化反应是光合作用碳固定以及油脂合成过程中关键的限速步骤，因此核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶是该过程的重要调节酶6，采用GE使核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶高效表达，很可能会提高微藻固定CO2和油脂积累能力。1.1.3基因工程技术微藻脂类代谢途径油脂生物合成是生物界广泛存在的多酶催化过程，属初级代谢的一部分。微藻大多为真核细胞，其产油脂的过程，本质上与动植物产油
12、脂的过程相似，细胞中油脂生物合成路径如图1所示，由两个主要步骤组成:脂肪酸生物合成和油脂生物合成。脂肪酸生物合成脂肪酸生物合成是油脂生物合成的基础过程，如图1-1中间虚线框所示，起始于乙酰CoA羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase，ACCase)催化乙酰CoA转化为丙二酰CoA，然后脂肪酸合酶(fatty acidsynthetase，FAS)便以丙二酰CoA为底物进行连续聚合反应。丙二酰CoA转移到FAS的亚基，即酰基载体蛋白(acyl-carrier protein，ACP)，与ACP上的硫醇基团形成硫酯产生丙二酰ACP;同样，乙酰CoA也与ACP形成乙酰AC
13、P，再转移到FAS上形成乙酰合酶。丙二酰ACP与乙酰合酶经FAS的另一个亚基，即-酮酰-ACP合酶催化缩合形成乙酰ACP，随后经过羰基还原、脱水、还原三步连续反应形成丁酰ACP。丁酰ACP取代乙酰ACP，与丙二酰ACP缩合，进入第二轮碳链延伸。这个循环不断重复，以每次循环增加两个碳的频率延长碳链，直到形成碳16或碳18的碳链，最后脂酰ACP硫酯酶切掉酰基链，释放脂肪酸7。油脂生物合成油脂在微生物细胞内以脂滴或脂肪粒形式储存于细胞质中8。油脂是以甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)和脂酰CoA为主要前体。如图1-1下部虚线框所示，首先G3P和脂酰CoA在甘油-3-磷
14、酸酰基转移酶(glycerol-sn-3-phosphate acyl-transferase，GPAT)作用下酰化形成溶血磷脂酸，然后在溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidate acyl-transferase，LPAT)作用下与另一个脂酰CoA进一步酰化形成磷脂酸，再由磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acidphosphatase，PAP)催化去磷酸化形成甘油二酯，最后二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyl-transferase，DGAT)催化将第三个脂酰CoA加到甘油二酯分子上形成油脂9。参照图1-1。1.1.4基因工程方法改造微藻乙酰Co
15、A羧化酶(ACCase) ACCase乙酰CoA+CO2+H2O+ATP丙二酰CoA+ADP+Pi (1)二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)DGAT甘油二酯+脂酰CoA甘油三酯+CoA (2)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)PEPC丙酮酸+CO2+H2O+ATP草酰乙酸+ADP+Pi (3)CO2储存 CO2 葡萄糖 C3系统 糖酵解 甘油醛-3-磷酸 糖酵解 磷酸烯醇丙酮酸盐（或酯） PEPC 苹果酸盐（或酯） ME 丙酮酸盐（或酯） 草酰乙酸盐（或酯） 醋酸盐；醋酸酯 ACS 乙酰辅酶A ACL 柠檬酸盐 ACCase 乙酰磷酸酶 丙二酰辅酶A 乙酰合成酶 FAS 丙二酰ACP 乙酰乙酰基
16、ACP 脂肪酸的生物合成 酮酰ACP 脂肪酸 3-磷酸甘油 反应 GPAT 脂肪酰基辅酶ALISO磷脂酸 LPAT 磷脂酸 TGA的生物合成 PAP 甘油二酯 DGAT 三酰基甘油图1-1 微藻脂肪酸和油脂生物合成途径1.2 课题研究目的和意义化石能源危机与二氧化碳排放已成为人类的两大难题，生物柴油是环境友好的可再生替代能源。在其原料中，藻类油脂产率高且容易培养，被认为是潜在的最佳生物柴油原料之一。国内外学者经过选育、诱变，获得了含油量达到2060%的微藻菌株；然而大多数微藻含油量并不高，为进一步提高含油量，尤其是适合低温生长的本地微藻。通过诱变与遗传转化等手段提高本地微藻菌株的产油量。尤其是
17、在对营养条件和培养条件的代谢途径优化方法上着手，会大大提高微藻在产油环节上的产油率。通过本课题实验，我们相信这会对提高微藻生物柴油的经济性提出一条极有可能实现工业化的潜在高效的生产途径。1.3国内外研究现状和发展趋势除了基因工程改造藻种，通过对营养条件和培养条件进行优化，也可引导细胞代谢进入脂合成过程，从而实现微藻高产油。表1显示了一定培养条件下不同微藻的生长和产油情况，以及氮浓度、温度、通气等对藻生长和产油的影响。实际生产中可以通过改善培养条件使产油率达到最高，如表1所示采用葡萄糖异养Chlorella protothecoides，藻的生长速度快、油含量高，产油率最高可达3 679.1mg
18、L1d110，远超过其余几种培养结果;但异养微藻消耗葡萄糖等有机碳源，成本较高，并且释放CO2，不能转化太阳能和利用空气中CO2。如表1所示，氮源种类、氮源浓度、盐浓度、铁离子浓度和光强等都会影响细胞内油脂积累。黄建忠等3发现NH4NO3、尿素等适合细胞生长但不适合油脂合成;蛋白胨、牛肉膏不适合细胞生长但利于油脂合成;酵母膏不仅适宜细胞生长，也是油脂合成的最佳氮源。Li等11研究了氮源种类和浓度对Neochloris oleoabundans细胞生长和脂积累的影响，硝酸盐、氨、尿素是最普遍的氮源形式，其中NaNO3是该藻生长和脂积累的最适氮源，脂含量、脂产率、生物质产率分别出现在NaNO3浓度
19、为3mM、5mM和10mM时。Takagi等12在高盐条件下培养Dunaliella，当初始盐浓度从0.5M增至1M时，含油量由60%增至67%;当初始盐浓度为1M，并在对数期中期或末期加入0.5M或1M盐时，含油量可增至70%。刘志媛等13在高浓Fe3+条件下培养Chlorella vulgaris，改变了藻株的代谢途径，使油脂出现两次积累高峰，含油量提高了7倍，达细胞干重的56.6%，并且高Fe3+浓度对藻株生长影响不大。台湾成功大学Wu和Hsieh14采用嵌有透明隔间的敞口槽来自养培养Nannochlorosis oculata，在最适的盐度、氮源和光强下油脂含量达60%，比传统的分批培
20、养增加了76%。研究发现能源、碳源充足而其他营养成分(如氮、硅、磷)胁迫可诱导某些微藻积累油脂，其中氮是报道最多的营养限制因子。虽然处于“饥饿”状态的大部分微藻积累油脂，但此时藻体生长缓慢，导致产油率下降，实际生产中要使产油率最高，必须在微藻总生物量和细胞油脂含量间寻求平衡。营养成分胁迫诱导微藻积累油脂的可能原因是:氮是细胞大分子(如酶、膜)或细胞结构的成分，硅是硅藻细胞壁组成成分，氮硅胁迫使细胞分裂和增殖受到抑制，并且营养限制时细胞对碳的同化将更多地流向脂肪，其他非脂类成分也会逐渐向脂肪转化，油脂积累;磷对细胞能量的生物转化相关过程(如光合磷酸化)非常重要，光合作用需大量蛋白，蛋白合成需要富
21、含磷的核糖体，磷胁迫使光合作用受限，细胞代谢将倾向于脂合成。微藻产油脂可分为两个阶段，即藻体增殖期和油脂积累期，这两个阶段对营养盐要求不同。表1-1不同培养条件下部分微藻的产油脂情况种类培养条件生物生产力( mgL1 d1)脂质含量(%)生物生产力( mgL1 d1)参考bottyococcus藻10%CO226.55215.51655.5% CO2废气772420.65Chlorella emersonii足够的氮412510.2511低氮363412.24足够的氮27.9298.0910低氮79.36349.96微小小球藻足够的氮32.93110.2低氮15.7578.95杜氏盐藻高盐50
22、6733.560微绿球藻半连续自养49730.415123在15自养61.114.929.1171在20自养126.77.910.01在25自养72.713.8910.1自养在20/还原氮含量75%103.515.8616.41Neochloris oleoabundans硝酸钠作为氮源4003413359Pleurochrysis carterae户外滚道池塘长期培养1903362.721斜生栅藻10%CO2217.5920.65655.5% CO2废气2031839.44Nannochloris sp.足够的氮2253476.572低氮97.542.441.34微绿球藻属在连续光自养180
23、30.954.869在连续光自养21029.661在连续光自养17035.760.9种类培养条件生物生产力( mgL1 d1)脂质含量(%)生物生产力( mgL1 d1)参考Chlorella protothecoides在连续光自养1412异养性葡萄糖/分批培养548.657.8317.113异养性葡萄糖/初级2191.355.2 1 209.6异养性葡萄糖/改进的补料7314.350.33 679.1分批培养普通小球藻无Fe3+7.867高浓度Fe3+56.6自养15.3768异养性32.8510%CO2104.766.66.9165在连续光自养20018.436.969在连续光自养170
24、19.232.6自养15d36.6726.719.7570自养20d4329.5312.77在25条件下自养13614.720.2271在30条件下自养1365.98.16自养在30/还原氮含量75%132.615.3120.3足够的氮29.3185.2710低氮37.14014.84足够的氮402811.211低氮245813.921.4 主要研究内容与技术路线1.4.1 主要研究内容本课题以前期工作者完成的微藻吸收高浓CO2的研究为基础，着重微藻的选育和高浓度培养。其研究内容主要包括以下几个方面：（1）高浓度微藻的分离纯化。（2）苏丹黑B法测定微藻的油脂含量。（3）不同碳氮比培养基微藻的生
25、长状态和油脂含量。1.4.2 实验中遇到的困难和解决办法1.4.2.1 实验中遇到的困难（1）从自然界中分离并纯化得出优良藻种；（2）细胞增殖期是微藻消耗培养基中的氮源，吸收利用蛋白质，以保证藻体代谢旺盛;当藻体细胞增殖率剧增，以消耗碳、氮源为主，并合成积累大量油脂。所以对微藻产油过程中培养基中最佳的碳氮比、温度以及酸碱度等有待研究；（3）初期培养时因气温低而生长缓慢。1.4.2.2 解决办法（1）采用稀释法再接种的方法实现分离，在改变影响因素的代谢条件中生长完成对其代谢的驯化；（2）针对各种影响条件还需做大量的正交试验来得出所需的数据；培养前期宜采用完全培养使细胞快速生长获取大量藻体，产油阶
26、段宜采用营养盐限制以积累更多脂肪。（3）使用苏丹黑染色法将其染色，利用分光光度计测出不同代谢环境藻的吸收峰值，经行对比得出最高值，进而得出该峰值所对应的代谢条件为最优。1.4.3 采用的技术路线 分离 扩大培养 离心藻类 纯化 实验用藻 正 苏丹黑染色 测量吸光度 交 实 整理数据 比较吸收峰max 改变代谢环境因素 验 当下吸收峰对应的代谢环境最优 利用酸热萃取法提取，测含油量图1-2 实验技术路线示意图第2章 实验材料和方法2.1实验材料2.1.1藻类培养基的配制方法本实验使用的是从自然界中采集的普通藻类，通过查阅大量文献，培养基的配制方法是水生四号培养基。培养基配方如表2-1：（1）要有
27、适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。（2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。（3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。（4）要加入各种藻类需要的微量元素（土壤浸提液）。（5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。（6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（土壤浸提液）。表2-1为水生四号培养基配方化学药品用量NH4NO30.2gLCa(H2PO4)20.03gLMgSO40.08gLKCl0.025gLNaHCO30.1gLK2HPO4 . 3H2O0.01gLFeCl31%水溶液1滴L土壤浸提液0.50mLL2.1.2实验所用试剂本实
28、验所用药品及试剂见表2-2：表2-2为本实验所用试剂名称纯度生产商氢氧化钠（颗粒状）分析纯天津市北方天医化学试剂厂氯化钠分析纯天津市北方天医化学试剂厂硝酸钠分析纯天津市北方天医化学试剂厂铁氰化钾分析纯天津市北方天医化学试剂厂氯化钾分析纯天津市北方天医化学试剂厂磷酸氢二钾分析纯沈阳市华东试剂厂磷酸二氢钾分析纯沈阳市华东试剂厂硫酸镁分析纯天津市北方天医化学试剂厂氯化钙分析纯天津市北方天医化学试剂厂三氯化铁分析纯天津市北方天医化学试剂厂酵母膏分析纯天津市北方天医化学试剂厂(NH4)6Mo7O24 . 4H2O分析纯天津市北方天医化学试剂厂EDTA分析纯天津市北方天医化学试剂厂2.2 微藻藻种采集分离
29、纯种培养及保存方法 2.2.1藻种采集及富集培养水样的采集主要通过对池塘水进行收集。将水样取到实验室以后，这时立刻将水样转移到宽大的水生生物专用的培养箱内。采样和预备培养：采集含有所需分离的微藻水样，并在显微镜下检查。若发现所需微藻含量较多，则可立即分离；否则，需进行预备培养，待其增多，再分离。预备培养应注意，当培养液含有不同的微藻，对于难以培养的微藻，加入土壤抽出液有利于培养。一般的预备培养液营养成分浓度较低，为原配方的1/41/2。当水样中含有多种微藻，最好使用几种不同的培养液，提高微藻遇到适合其繁殖的培养液的几率，从而促进微藻在其中的繁殖。在三角烧瓶或试管中加入容量的1/41/3的培养液
30、，然后把经筛绢过，滤除了大型浮游生物的水样接种进去，然后将其放在室内靠北窗口下培养，同时保持温度合适。根据培养微藻不同，每天采用不同操作，例如，对于附着藻，容器可静置不动，而对于浮游藻，每天应摇动一次。通过以下方法得到土壤抽出液：在试管底部加入高1cm左右的土壤（需要腐殖话的农田或庭院土），之后加入水至5cm处，塞上棉塞，121摄氏度高压蒸汽灭菌20分钟。2.2.2藻种的分离稀释分离法 清洗灭菌五只试管，标号1-5号，1号试管中加入9mL无菌水，2-5号试管分别加入8mL无菌水。无菌工作台上取1mL样藻加入1号试管，摇匀后再取2mL加入到2号试管中，重复操作至5号试管。依次将五只试管取样在显微
31、镜下血球计数，得到将样藻稀释106倍时视野中存在6个细胞。以此为基础，取8支试管标明1-8号，1-5号分别装入10mL无菌水，另配制水生四号培养基100mL。无菌环境下取100uL样藻于1号管内，摇晃均匀后从1号管内取100uL于2号管，重复操作至三管。将三号管取样置于显微镜下镜检，拍照。计算后取3号管中200uL于4号管中摇匀，再取1mL于5号管中，摇匀。将锥形瓶中水生四号培养基取各自加入6、7、8号试管中，每只试管中加入5mL培养基，再分别接种5号试管中的样藻1mL。将6、7、8号试管放入培养箱中观察培养，得到纯种微藻。之后倒入250mL锥形瓶中培养。图2-1 显微镜下分离后的球形微藻2.
32、2.3藻种的纯化培养当获得单种培养后，一方面需要进一步扩大培养，另一方面也可把藻种作较长时间保存，当需要时随时取出使用。对于藻种培养要求还是比较严格，所有培养容器可用各种不同大小的三角烧瓶，容量应该有100、300、500、1000毫升，这样适于逐渐扩大培养。所有的培养容器和工具都需经煮沸灭菌或者使用化学药品灭菌后，接着用煮沸水冲洗，并且培养液也用加热灭菌法灭菌。最后按种后瓶口用灭菌纸包扎封口，将其放在适宜光、温条件下培养，每天轻轻摇动二次。这样大约二周后进行一次移植。而且藻种在培养过程中必须定期用显微镜检查，保持不受其他生物污染，保证收获到较纯的单种微藻。2.2.4藻种的保藏扩培好的微藻可接
33、在固体培养基上，在常温、弱光下通常可以保藏半年到一年；也可在低温下（比如冰箱内）保藏，但是每天接受短时间（比如几个小时）的弱光，可保藏23年；但是如不照光，则只能保藏几个月。所有保藏藻种所用培养基的营养成分的浓度应比正常培养基高一些，通常一般可增加一倍，其中琼脂量为11.5。同时也可在固体培养基上，之后再加培养液，然后接种到培养液中，就可以避免固体培养基的干涸，使用保藏效果比单用固体好。2.3筛选获得实验藻类根据目前藻类处理烟气方面的文献，经过综合考虑后，本课题实验研究选用东北电力大学池塘里的微藻作为实验研究的藻种。图2-1和图2-2是实验中两种藻类细胞的图片。 图2-2为线形微藻细胞显微图片
34、 图2-3为球形微藻细胞显微图片2.4实验流程实验流程如下：水样采集藻种分离纯化扩大培养形成实验用藻接种不同营养环境下驯化苏丹黑染色测吸光度比较分析最佳代谢环境测含油量。2.4.1接种 在将所需药品、设备等准备好后，根据实验将锥形瓶编辑号码（从1至9），根据所需数据称量药品，注意氮源所取不同，配置1L培养基9瓶，塞棉花绑线封口，放入灭菌锅中进行灭菌，根据灭菌锅的安全使用操作完成操作，保持在121124MPa,20min，自然冷却至一定温度，取出放入洁净工作台，在配制的培养基温度降至30左右时，开启紫外灯照射灭菌20min后，开始经行接种。用酒精棉擦拭双手及工作台，点燃酒精灯，打开培养基的封口，
35、并用枪头吸取分离后经行第一次扩大培养的藻液，按2%（V/V）的接种量接种，再一次完成所有的接种实验操作，封口处理，清理实验工作台。放到阳光充足的地方。2.4.2不同代谢条件驯化4月份以后，温度保持2527（基本上培养地点在寝室、化学楼二楼）实验操作按照表2-3完成。表2-3改变碳氮驯化实验数据表序号NH4NO3(g)CaCl2(g)MgSO4(g)KCl(g)NaHCO3(g)FeCl(aq)K2HPO43H2O(g)10.10.030.080.0250.11滴0.0120.120.030.080.0250.11滴0.0130.140.030.080.0250.11滴0.0140.160.03
36、0.080.0250.11滴0.0150.180.030.080.0250.11滴0.0160.20.030.080.0250.11滴0.0170.220.030.080.0250.11滴0.0180.240.030.080.0250.11滴0.0190.260.030.080.0250.11滴0.012.4.3苏丹黑染色2.4.2.1苏丹黑 B染色液的配制称取0.3 g苏丹黑B粉末,溶于100 mL70% (V /V,下同)乙醇中，室温下放置 46 d,期间经常摇动,让其充分溶解后过滤,于4下保存备用。3.2.2染色后微藻细胞的吸光值与油脂含量将分离、纯化后的藻液置于光照强度为3 5007
37、000Lx；温度为 2027；pH = 7. 68. 2环境下，称取0.5g经脱盐处理的湿藻样,加入50ml的蒸馏水,充分混合均匀,然后按体积比1：2、1：3、1：4、1：5、1：10稀释成5个藻浓度. 每个浓度分别取2支试管,各加入5mL藻液和5mlHCl溶液（1m oL/L）,充分混合后,一管加入0.4mL的苏丹黑B染色液,另一管(对照管)加入0.4mL70% 乙醇,充分混匀,在沸水浴中加热10min(不时摇动,使加热均匀),冷却后于10000 r/min下离心10min.取出微藻细胞沉淀物,用50%（V /V,下同)乙醇洗涤3次后,加入5mL70%乙醇混匀微藻细胞,在645nm波长光下测
38、定其吸光值(染色后的微藻细胞在此波长光下具有最大吸收峰值),比色皿光程为1 cm。图2-4苏丹黑法染色后的藻细胞实物图2.4.4测量含油量采用常规的酸热萃取法，测定微藻细胞油脂含量。称取一定质量微藻细胞湿重，按每克藻体加入15 mL盐酸溶液（4 m oL/L）的比例混和均匀，室温下静置25 h；然后沸水浴中加热30 m in，冷却后分别加入等体积的氯仿和甲醇，混匀摇动、充分萃取,离心后取上层液，在旋转蒸发器上挥发除去溶剂后得到微藻油脂，称取微藻油脂重量。基于微藻湿重,微藻细胞油脂含量单位为 m g /g。第3章 不同碳氮比下培养微藻产油结果实验流程如下：水样采集藻种分离纯化扩大培养接种不同营养
39、环境下驯化苏丹黑染色测吸光度比较分析最佳代谢环境测定含油量。3.1 不同代谢条件驯化实验材料：锥形瓶9（1L）、棉花塞、量筒（1000mL）、移液枪、灭菌锅等。实验方法：配制不同碳氮比的水生四号培养基于1L锥形瓶中，并进行高压蒸汽灭菌，之后无菌条件下分别接种纯种样藻，3月份时，因为室温温度过低，造成藻类生长过慢；4月份以后，温度保持2527（基本上培养地点在寝室、化学楼二楼）；5月份，得到大量不同条件驯化下的藻类，为染色准备；驯化实验数据如表3-1：表3-1 驯化实验数据表序号NH4NO3(g)CaCl2(g)MgSO4(g)KCl(g)NaHCO3(g)FeCl(aq)K2HPO43H2O(
40、g)10.10.030.080.0250.11滴0.0120.120.030.080.0250.11滴0.0130.140.030.080.0250.11滴0.0140.160.030.080.0250.11滴0.0150.180.030.080.0250.11滴0.0160.20.030.080.0250.11滴0.0170.220.030.080.0250.11滴0.0180.240.030.080.0250.11滴0.0190.260.030.080.0250.11滴0.01不同条件下培养大约3周，得到大量微藻以进行后续测量实验。1、7、8、9组的生长情况不好，在第一周的时间内，发生大量死亡现象，瓶中呈现白灰色。3.2苏丹黑B染色测微藻油脂实验材料：锥形瓶（250mL）、小试管8、移液枪、.水浴锅、量筒（500mL）、分析天平、离心机、分光光度计、滤纸、漏斗等。实验方法：取0.18g/LN
