粘细菌胞外多糖提取纯化及其生物活性检测毕业论文.doc

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1、粘细菌胞外多糖提取纯化及其生物活性检测装订线摘要随着这几年来糖化学的迅速发展，微生物胞外多糖的理论和应用也受到了人们的重视。胞外多糖的提取纯化和组分分析的实验技术都已成熟，为本实验提供了理论基础和实验指导。本文通过观察粘细菌在CAS固体培养基平板上的菌落黏性圈，从79株粘细菌中筛选到6株胞外多糖产量高的菌株，并对其中4株粘细菌产生的胞外多糖进行了提取纯化。粘细菌经液体发酵培养后，将发酵液进行乙醇沉淀得到粗多糖的提取物。粗多糖经氯仿、三氯乙酸脱蛋白，过氧化氢脱色，得到白色粉状纯化物。纯化的粘细菌胞外多糖采用0.5mol/L盐酸水解后，经高效液相色谱分析，可确定菌株92033、93147、9401

2、6的胞外多糖中均含有葡萄糖、甘露糖，其他成分需进一步验证。4株粘细菌的胞外多糖纯化物的水溶液，经絮凝活性检测实验表明，均具有絮凝活性，其中菌株92033对4g/L的高岭土悬浊液的絮凝率达到92.84%，显示出良好的应用前景。关键词：糖化学胞外多糖粘细菌絮凝活性ABSTRACTAs the rapid development of sugar chemical over the past few years, the theory and application of the microbial exopolysaccharides were important for the people.

3、The extraction, purification and component analysis experimental technique of the exopolysaccharide had been mature, which provided a theoretical basis and experimental guidance. In this article, Myxobacteria which produced many polysaccharide were screened from the CAS solid medium by observing the

4、 stickiness of colony. We had got six strains which could produced high exopolysaccharide from the 79 strains, and four strains had been extracted and purificated. After liquid culture fermentation, we could obtained the crude polysaccharide extracts by alcohol precipitation methd from the fermentat

5、ion broth. We obtained the white powder of the polysaccharide by the chloroform and trichloroacetic acid removing protein and hydrogen peroxide detreated. After purified Myxobacteria exopolysaccharides 0.5mol/L hydrochloride hydrolysis, we could determine that the strains of 92033,93147,94016 which

6、containing glucose and mannose by high performance liquid chromatography analysis. Other components were proved by further validation. After the testing of the flocculating activity, the four myxobacteria aqueous solution of exopolysaccharide purification were all had flocculation activity. Strains

7、of the 92033 had an effct on 4g/L kaolin suspension and the flocculation rate rich to 92.84% and it showed a good application prospect.Key words:sugar chemicalexopolysaccharidesMyxobacteriaflocculation activity目录一前言11.1粘细菌简介11.2微生物胞外多糖概况11.3微生物胞外多糖的应用21.3.1胞外多糖的药用性21.3.2胞外多糖的絮凝性21.4国内外研究现状31.5本实验的研究

8、内容与意义3二本论42.1实验材料42.1.1菌种来源42.1.2实验所用培养基42.1.3主要仪器与试剂42.1.3.1仪器42.1.3.2试剂42.2实验方法52.2.1实验方案52.2.2粘细菌的发酵培养52.2.2.1菌种活化52.2.2.2产多糖菌株的筛选52.2.2.3产多糖菌株的种子液培养52.2.2.4种子液的发酵培养52.2.3粘细菌胞外多糖的粗提取62.2.4粘细菌胞外多糖的纯化62.2.4.1初步纯化62.2.4.2胞外多糖蛋白质的去除72.2.4.3胞外多糖脱色72.2.5胞外多糖的组分分析72.2.5.1胞外多糖的完全水解72.2.5.2胞外多糖的高效液相色谱分析72

9、.2.6胞外多糖的生物活性检测72.3结果与讨论82.3.1高产胞外多糖的粘细菌菌株的筛选82.3.2胞外多糖的提取物92.3.3胞外多糖的组分分析92.3.4胞外多糖的活性检测12三结论14谢辞15参考文献16一前言1.1粘细菌简介粘细菌（Myxobacteria）是一类滑行运动，革兰氏染色阴性的单细胞细菌1。以二等分分裂繁殖2，严格好氧菌。最适生长温度在30左右。在全世界都有分布，典型的生境是土壤3，近年来发现极端环境和海水中也有粘细菌的存在4。由于其复杂的多细胞行为，能够在细胞间进行信号的传递与感应来进行摄食和运动5，被认为是高等的原核生物。粘细菌根据其利用底物能力的不同，分为两个生理亚

10、群：一类是可利用脂类、纤维素等多种大分子物质的溶纤维亚群，一类是以死的或活的细菌、真菌、藻类作为营养来源的溶菌亚群。但大多数粘细菌属于腐生菌，可在羊、兔等草食性动物的粪堆和腐烂树木里分离到粘细菌。粘细菌属于化能异养型的微生物，具有独特的生活史，分为两个阶段营养细胞生长期和细胞发育期。当营养细胞发育到一定阶段，或处于饥饿等不利环境的条件下，可能通过信号传递细胞开始聚集，在固体表面形成由细胞和粘液组成的，颜色鲜艳，肉眼可见的子实体，如图1-1。粘细菌种类不同，其子实体的形态也有所不同。有的形成松散的球块状，有的为一定形状的复杂形体。在子实体内形成粘孢子，对干燥，热，紫外线等具有较强的抗逆性，也可称

11、为休眠体，是理想的保存材料6，所以遇到适宜的环境又开始萌发为营养细胞。图1-1粘细菌子实体1.2微生物胞外多糖概况微生物多糖是指大部分细菌，少量真菌和藻类产生的多糖。分泌到细胞外的多糖，包括革兰氏阴性菌细胞膜外的多糖成分以及革兰氏阳性菌的肽聚糖7，称为胞外多糖，简称为EPS。目前已工业化的胞外多糖主要有以下几个8 黄原胶黄原胶,是由黄单胞菌属产生的一种阴离子型多糖生物聚合物。早在上个世纪50年代Jeanes就展开了黄原胶产生菌的筛选工作。由于黄原胶具有广泛的性能，如：增稠性、水溶性、悬浮性，所以黄原胶成为工业化的主要胞外多糖，而我国在80年代才开始小批量的生产。 硬葡聚糖硬葡聚糖，由真菌小核菌

12、发酵产生的聚合物。具有很强的增稠、抗温、抗剪切的能力，主要性能优于黄原胶。 结冷胶结冷胶，是由在有氧条件下，沼假单胞菌生产的一种线性阴离子杂多糖。1978年被发现,后投入批量生产。具有高粘性和高热稳定性，可形成类似琼脂的热可逆性凝胶，这一特性使其成为生物培养基的替代品。1.3微生物胞外多糖的应用多糖除对菌体本身具有重要的生物学意义，具有多效性、低毒性、来源广泛、天然绿色等优点。与现有药物的联合应用，除了可提高药物的作用范围和效力，还可推迟或防止耐药性的产生。另外，已报道过多糖可作为微生物絮凝剂的主要活性成分9。胞外多糖的这些优点吸引了研究者的注意力。1.3.1胞外多糖的药用性多糖的抗肿瘤活性多

13、糖的抗肿瘤活性是通过诱导免疫细胞因子和其受体基因的表达来增强机体的免疫力10。有些微生物来源的多糖与肿瘤细胞表面的糖类分子很相似，能抑制肿瘤细胞的粘附，从而抑制了肿瘤细胞的侵袭与转移。多糖的这一特性曾有报道：一株乳酸菌产生的胞外多糖可增强小鼠的抗肿瘤作用11。就多糖的抗肿瘤的作用而言，可将其分为两类，一是通过毒性直接杀死肿瘤细胞；二是增强机体的免疫能力间接杀死肿瘤细胞。多糖的抗病毒活性多糖的抗病毒作用已引起医药界的高度重视，尤其是在抗HIV方面，硫酸酯化多糖因为其活性明确，已成为研究热点12。多糖的抗炎活性主要通过抑制毛细血管的通透性，炎症介质的释放和纤维组织增生来抗炎的，对于急慢性及免疫性的

14、炎症有较好的治疗作用13。1.3.2胞外多糖的絮凝性微生物絮凝剂作为一种新型的絮凝剂，其无毒，无二次污染，廉价等优点越来越受到人们的重视。微生物絮凝剂有多糖、蛋白质等不同的成分，絮凝机理也有所不同。据陈盛，钱伟等14报道，通过对发酵获得的活性絮凝剂进行分离和提取纯化，进而通过高效液相色谱，薄层色谱等分析其组分，得出絮凝剂的主要成分为酸性多糖。这一发现为微生物絮凝剂活性成分的组分分析提供了实验技术和理论依据，也为微生物多糖的生物活性开拓了又一新的途径。1.4国内外研究现状微生物来源的多糖是至今研究得比较详细的一类多糖，其广泛的生物活性使得其已成为微生物药物一个重要的组成部分，且在新药研发中也越来

15、越受到重视。我国微生物胞外多糖产业起步较晚，但发展迅速，于“七五”、“八五”期间研究开发出了黄原胶、茁霉多糖、海藻酸盐、齐整小核菌多糖等微生物多糖，初步建立了我国微生物多糖产业。不过我国的主要研究工作还是集中在黄原胶这一产物，总的看来，国内多糖的研究与生产均落后于发达国家，其质量和产量远不能满足社会的需求，这就迫切需要人们改进工艺和产品性能或寻找替代品来满足实际的需要15。粘细菌虽然在1809年就已被发现，至今已经历了200年的研究历史16。由于粘细菌是一类难以操作和培养的细菌，所以当时他们还是把目光投向那些易于操作的微生物。直到1973年，人们首次分离得到粘细菌产生的能够抑制真菌孢子的发育活

16、性物质，特别是20世纪90年代德国学者发现由粘细菌产生的高效抗肿瘤抗生素埃博霉素(epothilones)以来，粘细菌才开始展现其重要的应用价值17,18。虽然近年来粘细菌的次级代谢产物在抗肿瘤机制上的多样性，使其成为抗真核生物类药物筛选的重要微生物类群19。然而对于粘细菌多糖的研究几乎处于空白，对粘细菌多糖的研究尚未引起足够重视，未见到系统的报道，在这方面具有很大的研究空间。同时，随着越来越多的具有药理和生物活性的次级代谢产物的发现，粘细菌也成为了药源微生物家族的重要成员。1.5本实验的研究内容与意义本实验的研究内容是通过对大量粘细菌的筛选，得到产胞外多糖多的菌株。经过液体发酵培养，使其大量

17、分泌胞外多糖，并对胞外多糖进行提取纯化和初步化学组成及生物活性的测定。粘细菌产生的胞外多糖除具有重要的药用价值外，以多糖为主要成分的粘液有润滑作用，可以推动粘细菌在物体表面运动，这一特性有望展现出了粘细菌多糖的更加广阔的潜在的应用价值。通过对粘细菌胞外多糖的研究，为粘细菌多糖理论及应用研究奠定的基础，为将来的可能工业化提供必要理论支持的实验数据，从而发现研究与开发价值的粘细菌胞外多糖。因此，对于粘细菌胞外多糖的系统研究将为这一类微生物资源的开发利用，起到重要的推动作用。二本论2.1实验材料2.1.1菌种来源本实验采用河北大学河北省微生物多样性研究与应用重点实验室保藏的粘细菌菌株。2.1.2实验

18、所用培养基 液体CAS培养基(w/v%)酶解酪素 1， MgSO47H2O 0.1， pH 7.2。 固体CAS培养基(w/v%)酶解酪素 1， MgSO47H2O 0.1， 琼脂 1.2， pH 7.2 固体VY/2培养基(w/v%)酵母提取物 1， CaCl22H2O 0.2， 琼脂 1.2， pH 7.2 100 mL固体VY/2培养基加入0.05mg VB12。2.1.3主要仪器与试剂2.1.3.1仪器立式自动电热压力灭菌锅(上海申安医疗器械厂)新型恒温振荡器(ZHWY2102型，上海智诚分析仪器制造有限公司)旋转蒸发仪(Heizbad Wbdigit型)SIGMA冷冻离心机(Sigm

19、a 3K-15型)台式离心机(CT6E型，日本日立)高效液相色谱仪(L-7110 PUMP HITACHI，2000ES ELSD ALLTECH)回旋式振荡器(HY-5A型，金坛市杰瑞尔电器有限公司)紫外分光光度计(UV-2102C/PC/PCS型，上海尤尼柯仪器有限公司)超净工作台(BHC-1300A/B3，苏静集团安泰公司)电子天平(BN2615，上海民桥精密科学仪器有限公司)2.1.3.2试剂提取纯化试剂：95%乙醇，5%三氯乙酸，30%双氧水，氯仿。组分分析试剂：葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，鼠李糖，木糖，0.5mol/L盐酸，乙腈等。活性检测试剂：4g/L高岭土悬浊液，5%氯化钙，1m

20、ol/LNaOH溶液。2.2实验方法2.2.1实验方案菌种活化 (57d)种子液培养 （28 3-4d）发酵培养 （28 57d）离心，取上清 胞外多糖提取 样品检测2.2.2粘细菌的发酵培养2.2.2.1菌种活化从菌库中取出保藏的菌种，无菌操作接入已配制好的VY/2固体培养基斜面上，28恒温培养57天。2.2.2.2 产多糖菌株的筛选将活化好的菌种点接到固体CAS培养基上28恒温培养35天观察粘细菌在培养基上菌落黏性圈直径的大小。2.2.2.3产多糖菌株的种子液培养将初筛得到的菌种接入配制好的液体CAS培养基（250 mL三角瓶）中，28，210r/min振荡培养34天。2.2.2.4种子液

21、的发酵培养种子液培养好后，用移液管按10%接种量将种子液接入发酵CAS液体培养基中。28，210r/min振荡培养57天。2.2.3粘细菌胞外多糖的粗提取发酵液上清液浓缩发酵液沉淀物粗多糖溶液沉淀物 20，4800 r/min离心15min去菌体，取上清液 减压蒸馏 加两倍体积的95%乙醇，振荡，20，4800 r/min离心15min 加水溶解 加两倍体积的95%乙醇，振荡，20，4800 r/min离心15min2.2.4粘细菌胞外多糖的纯化2.2.4.1初步纯化将粗胞外多糖加水溶解，初步纯化的流程如下20：粗胞外多糖上清液上清液上清液上清液沉淀物上清液 20，10000 r/min离心2

22、0min去菌体，取上清液 加等体积的氯仿，振荡，20，10000 r/min离心10min 加等体积的氯仿，振荡，20，10000 r/min离心10min 加等体积的氯仿，振荡，20，10000 r/min离心10min 加两倍体积的95%乙醇，振荡，20，4800 r/min离心15min 加等体积水溶解，20，10000 r/min离心10min2.2.4.2胞外多糖蛋白质的去除采用TCA法21,22除去多糖中的蛋白质。将等体积的5%三氯乙酸加到多糖粗提物中，充分振摇，使样品中的游离杂蛋白与三氯乙酸充分作用，使杂蛋白变性成为不溶状态而沉淀，离心除去杂蛋白沉淀，重复操作，但其中一次操作要振

23、荡过夜，取上清液。2.2.4.3胞外多糖脱色上述上清液加入等体积的30%的过氧化氢，调pH至8.8，置于45水浴锅中水浴4h。取出置4冰箱保存。2.2.5胞外多糖的组分分析2.2.5.1胞外多糖的完全水解将已提取纯化的粘细菌菌株91022、92033、93147、94016的胞外多糖采用0.5mol/L盐酸水解，以获得胞外多糖的水解物。取50mg胞外多糖，研磨成粉末状，加入200L的0.5mol/L盐酸，115水解30 min，将水解液置烘箱烘干，加入无菌水，再烘干，反复操作，调pH至2.5-3.0，10000 r/min离心10min取上清液，进行组分分析。2.2.5.2胞外多糖的高效液相色

24、谱分析仪器：高效液相色谱仪(L-7110 PUMP HITACHI，2000ES ELSD ALLTECH)；色谱柱：糖柱(Prevail Carbohydrate ES 5u,250mm4.6mm，ALLTECH)；流动相：CAN(乙腈):水=33:1；流速：1mL/min；柱温：室温；漂移管温度：80载气流量：2L/min将胞外多糖水解物与标准品溶液进行高效液相色谱分析。根据出峰时间的不同，比对样品和标准品以确定胞外多糖水解物中的组分。2.2.6胞外多糖的生物活性检测絮凝活性检测23：配制4g/L的高岭土悬浊液，1%的CaCl2的溶液，200mg多糖样品研磨成粉末，加入1mL水制成多糖溶液

25、。取46.5mL的高岭土悬浊液加入1mL多糖水溶液，空白对照加入1mL无菌水。取2.5mL CaCl2溶液，调pH至7.0。180r/min快速振荡30s，然后80r/min慢振5min，同时观察现象。静置5min后，观察现象，后取上清液测OD550值。2.3结果与讨论2.3.1高产胞外多糖的粘细菌菌株的筛选本实验共对79株菌进行了点接筛选，通过观察粘细菌菌落黏性圈直径大小可知不同的粘细菌菌株的胞外多糖含量不同，总共筛选出6株可产生较多胞外多糖的粘细菌菌株。见表2-1表2-1对79株粘细菌的菌落黏性圈的观察菌株号菌落黏性圈菌株号菌落黏性圈菌株号菌落黏性圈菌株号菌落黏性圈90002+91242+

26、93112+93179+90016+91243+93120+93180+90023+91245+93121+93181+90027+91247+93134+93182+90032+91249+93141+93307+91015+91251+93147+93310+91016+91251+93150+93315+91022+91253+93153+93326+91024+91254+93157+93329+91028+91256+93158+93357+91040+91257+93163+93358+91053+91258+93165+93359+91063+91259+93166+93360+

27、91076+91261+93171+93361+91086+91262+93172+93362+91116+91263+93174+94015+91167+91264+93175+94016+91168+91265+93176+94023+91188+92033+93177+94025+91241+92042+93178+：表示该菌株的菌落黏性圈存在，但很小+：表示该菌株的菌落黏性圈存在且较大+：表示该菌株的菌落黏性圈存在直径很大2.3.2胞外多糖的提取物筛选得到6株菌可高产胞外多糖，已对其中4株菌进行了提取纯化，分别为EPS1（菌株91022）、EPS2（菌株92033）、EPS3（菌株93

28、147）、EPS4（菌株94016），多为白色粉末状物质。图2-1，2-2为部分纯化胞外多糖。图2-1胞外多糖EPS2 图2-2胞外多糖EPS12.3.3胞外多糖的组分分析54321图2-3标准品的高效液相色谱图1:鼠李糖；2：阿拉伯糖；3：木糖；4：甘露糖；5：葡萄糖图2-4胞外多糖EPS1水解物的高效液相色谱图54图2-5胞外多糖EPS2水解物的高效液相色谱图4：甘露糖；5：葡萄糖5451图2-6胞外多糖EPS3水解物的高效液相色谱图4：甘露糖；5：葡萄糖45图2-7胞外多糖EPS4水解物的高效液相色谱图4：甘露糖；5：葡萄糖经过比较样品水解物和标准品的高效液相色谱图，可以确定EPS2水解

29、物中含有葡萄糖和甘露糖，如图2-5；EPS3水解物中含有葡萄糖和甘露糖，如图2-6；EPS4水解物中也含有葡萄糖和甘露糖，如图2-7；而EPS1水解物中不含有葡萄糖，甘露糖这两种单糖，如图2-4。对于EPS1、EPS2、EPS3、EPS4水解物中其他组分需进一步实验验证。2.3.4胞外多糖的活性检测图2-8EPS1水溶液的絮凝活性检测（注 1：菌株91022 5：空白对照）图2-9EPS2水溶液的絮凝活性检测（注 2：菌株92033 5：空白对照）图2-10EPS3水溶液的絮凝活性检测（注 3：菌株93147 5：空白对照）图2-11EPS4水溶液的絮凝活性检测（注 4：菌株94016 5：空

30、白对照）表2-2四株粘细菌胞外多糖的絮凝活性检测试验菌株絮凝活性测定絮凝率（%）试验1试验2试验3平均值对照2.54262.53352.53352.5365EPS40.88950.88890.88890.889164.95%EPS10.83540.83360.83230.833867.13%EPS30.83480.83440.83270.834067.12%EPS20.18210.18180.18130.181792.84%注：絮凝活性（）=(A-B)/A100%A为对照上清液的吸光度 B为样品上清液吸光度从图2-8，2-9，2-10，2-11中可以看出：空白对照（5）中，高岭土悬浊液仍呈混浊

31、状态；在分别加入EPS1（1）、EPS2（2）、EPS3（3）、EPS4（4）的多糖水溶液后，出现了高岭土絮凝沉淀的现象，说明EPS1、EPS2、EPS3、EPS4的水溶液均具有絮凝的活性。通过絮凝率来表征絮凝活性，表2-2中EPS1、EPS2、EPS3、EPS4的水溶液的絮凝率可进一步确定其絮凝活性，而且EPS2的絮凝活性达到92.84%。三结论1、通过发酵培养筛选得到的粘细菌菌株，然后通过乙醇沉淀的方法得到91022、92033、93147、94016等4株菌的胞外多糖EPS1、EPS2、EPS3、EPS4。2、EPS1、EPS2、EPS3、EPS4经0.5mol/L盐酸水解，水解物经高效

32、液相色谱分析，可知EPS2、EPS3、EPS4均含有葡萄糖和甘露糖。3、絮凝活性检测可知，EPS1、EPS2、EPS3、EPS4的水溶液都具有絮凝活性且EPS2絮凝活性最好，达到了92.84%。谢辞本论文是在导师张利平教授的悉心指导下完成的。感谢张老师从论文的选题，实验的设计到实验中的指导及论文的修改等方面给予我的付出。张老师严谨的治学态度和敏锐的洞察力给我留下了深刻的印象，对我孜孜不倦的教诲将使我终身受益。在实验过程中，本实验室的吕志堂老师、郭立格老师、杨润蕾老师、赵丽坤老师、石楠老师给予了大力的帮助和支持；同时，师兄贾宏、程付强、郭晓冬、陈明生，师姐王芊、董鑫、苏少娟在实验中给予的协助，还

33、有同组同学张龙、吕玮、王丹、王文涛等的帮助，在此一并致以诚挚的谢意。最后，再次向所有帮助过我的人致以最诚挚的感谢。参考文献1 方晓梅,张利平.粘细菌生态多样性的初步研究.生物多样性,2001,9,3:2072132 朱蕴兰.粘细菌研究.徐州工程学院学报,2005,20,5:25263 郝光飞,张利平.神农架样品中粘细菌的分离与纯化.安徽农业科学,2008,36,14:583958414 丁彦博.粘细菌的分离纯化和分类鉴定.硕士学位论文,河北大学:2004,25 李越中,李健,周璐等.我国粘细菌资源的分离与鉴定.微生物学报,2000,40,6:6526556 王海英,张利平.粘细菌,一类重要的微

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