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1、 第5章 聚合物纳米粒载药系统5.1概述 近十年来，人们对一类新型的药物载体聚合物纳米粒（PNP）的研究赋予极大关注。早期的药物载体纳米粒主要是脂质体（详见本书第6章）。作为药物载体，脂质体具有许多优点，如保护药物不被降解、靶向给药及减少毒副作用。然而，脂质体在应用中也存在一些问题，例如低包封率、水溶性药物在血液中的快速释放以及贮存稳定性较低。目前，在药物传递和控释领域中，可生物降解的聚合物纳米粒作为药物载体日益受到重视。多种聚合物已应用于这方面的研究，这是由于聚合物纳米粒同样能有效地把药物输送到特定的靶部位，如器官或组织，从而增加疗效、降低毒副作用。同时，聚合物纳米粒与脂质体相比，能增强药物
2、特别是蛋白类药物的稳定性，并且具有较好的缓、控释特性。利用口服给药，它们能输送蛋白、多肽和基因，在基因治疗上可作为DNA的载体1。大量的研究已证明，纳米粒对于药物来说是一种良好的控释（CR）系统。在动物模型上对某些疾病已显示出极好的疗效，充分表明这类载药系统具有广阔的应用前景。药物负载在纳米粒载体上以颗粒的形式被肠吸收，并分布在淋巴结、血液和肝、脾、骨髓等器官中。它们被胃肠道吸收后仍然保持对某些部位的靶向性。尽管目前对纳米粒在胃肠道中吸收的机理研究还不充分，但已证明，药物在体内的吸收具有明显的粒径依赖性。粒径较小的纳米粒要比粒径较大的纳米粒容易吸收，而粒径在5m以上的粒子则很少被吸收。随着生物
3、技术的迅速发展，纳米粒载药系统作为基因转染的载体也成为研究的重点。这种非病毒途径的基因转染避免了使用病毒的危险，并且可以进行充分有效的基因转染。当然，这种非病毒基因治疗需要对输送DNA穿过生物膜的特性进行充分的研究。一般来说，聚合物纳米粒的尺寸大约在10nm1000nm之间。药物被溶解、包封或吸附在纳米粒基体上，采用这种方法可制备纳米粒、纳米囊。纳米囊是一个多孔体系，药物通过单一的聚合物膜被包在膜囊内；而纳米粒基本上是一个均相体系，药物能均匀分散在其中。近几年来，已开发出用于制备纳米囊和纳米粒的一些常见的聚合物，已报道的主要有2,3： 聚D，L-丙交酯、聚乳酸（PLA）、聚D，L-乙交酯（PL
4、G）、丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）以及聚氰基丙烯酸酯（PCA）、聚氰基丙烯酸烷基酯（PACA）。较早以前还有多糖、明胶、海藻酸钠等亲水性、可生物降解天然聚合物。PLA、PLG和PLGA这些生物相溶性聚合物早期被用于胃肠给药的药物载体。另外，还报道过聚-羟基已酸内酯（PCL）作为类固醇、抗麻醉药剂以及眼科药物的控释载体。现在，这些可生物降解聚合物在药物的控制释放方面的应用已得到肯定。已上市的还为数不多，但对某些药物，如疫苗、人生长激素、胰岛素、抗肿瘤药物、避孕药及其疫苗等的控制释放具有良好的应用前景。例如Lupron Depot。一个成功的载药系统能将药物输送到靶部位，纳米粒在体内的长循环是
5、关键。为了达到这一目的，对这些聚合物纳米粒进行表面改性，制备具有亲水性和疏水性特性的聚合物和共聚物至关重要。5.2 聚合物纳米粒载体的制备5.2.1 常用的聚合物聚烷基乙二醇（polyalkylene glycol），若用氧化物代替乙二醇，聚合物也可为聚氧烷撑（polyalkylene oxide），如聚氧乙烯是一类常用的亲水性聚合物，也常用作嵌段共聚物的亲水性嵌段。聚烷基乙二醇指的是分子式为HO(alkyl)OyOH，其中烷基（alkyl）指的是C1到C4之间的直链或支连烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基，y为大于4的整数，一般在8500之间，常用的在40500之间。聚烷基乙二
6、醇的典型例子有聚乙二醇（PEG）、聚1，2-丙二醇和聚1，3-丙二醇等。最常用的亲水性聚合物是PEG，其相对分子质量约为20,000。其它亲水性聚合物有聚吡咯烷酮（polypyrolidone）、葡聚糖（dextrans）和具有不同乙酰基含量的聚乙烯醇（polyvinyl alcohol）。例如目前常用的BASF公司的商业化产品是Pluronic F68，为聚氧乙烯（polyoxyethylene）和聚氧丙烯（polyoxyproplene）的共聚物，该产品已获美国食品和药物管理局（FDA）的批准。在共聚物中间含有疏水嵌段的聚合物应具有生物降解性和生物相容性，且应含有一个能与聚烷基乙二醇末端羟
7、基反应生成共价键的末端基团。据报道，聚乳酸和聚乙二醇的嵌段共聚物可用于生物活性物质的注射型控释系统。另外还发现，乳酸（lactic acid）与羟基乙酸（glycolic acid）的共聚物也可用于该系统。其它的聚合物还有聚酸酐（polyanhydrides）、聚羟基丁酸（polyhydroxybutyric acid）和聚原酸酯（polyorthoesters）等。不同种类PNP在体内药物释放速率和药物释放方式是不相同的。丙交酯（乳酸）和乙交酯（羟基乙酸）共聚物（PLGA）是聚酯类的一个代表性的例子。它可构成纳米粒的内核。这类聚合物也已被FDA批准。PLGA通过水解作用降解，体内降解速度可通
8、过体外降解的数据进行预测。PLGA降解产物为乳酸和羟基乙酸，这些产物在体内自然存在。另外，通过控制乳酸和羟基乙酸的摩尔比及其共聚物的相对分子质量，可得到不同的降解模式。需要指出的是，聚合物的相对分子质量和聚合物的化学组成及立体化学构型对于制备适用的纳米粒是非常重要的，这是因为这些因素不仅影响聚合物的结晶度，也会影响聚合物在不同有机溶剂中的溶解度。在这方面，丙交酯（乳酸）和乙交酯（羟基乙酸）共聚物（PLGA）是比较好的。为确保聚合物在体内被降解，PEG的相对分子质量应在20,000以下。从报道的几种PEG-PLGA二嵌段共聚物来看， PEG嵌段的相对分子质量一般为35020,000，PLGA相对
9、分子质量为350200,000。同时，注射型纳米粒中的亲水性部分和疏水性部分的质量比也可影响纳米粒的水溶解性能和在水中的稳定性。准弹性光散射（quasi elastic light scattering，QUELS）的研究发现，当PEG/PLGA的质量比为1/1时（PEG相对分子质量与PLGA相对分子质量均为5,000），可在水中以任意比例溶解，且可形成平均直径为20nm的胶束，如果要形成具有紧密核的更大的纳米粒，可增加疏水性聚合物PLGA的含量。当PLGA的相对分子质量从5,000增加到20,000时，该聚合物在水或磷酸缓冲溶液（pH7.4）中的溶解度将减小。可采用一种简单的乳化技术得到平均
10、直径为120nm140nm稳定的PLGA-PEG(20,0005,000)纳米粒。由于PLGA共聚物可溶于乙酸乙酯和丙酮，这两种有机溶剂在体内的毒性较二氯甲烷和氯仿小，故常被优先考虑采用。聚L-丙交酯是一种高结晶度聚合物，而聚D，L-丙交酯则具有较小的结晶度，并且在有机溶剂中有更好的溶解性。D，L-丙交酯和乙交酯在75/25的比例下制得的无规共聚物在易溶于有机溶剂特别是在乙酸乙酯中溶解性能非常好。这是一种完全无定形的共聚物，适合制备用于控释系统的纳米粒和微米粒。聚L-丙交酯的体外降解时间为几个月到几年。降解时间较长主要归因于其较高的结晶度，它阻止了外部的水渗入聚合物中。而聚D，L-丙交酯是无定
11、形的，其典型降解时间一般为一到几个月。聚乙交酯也具有结晶结构，其降解时间一般为一到数月。D，L-PLGA具有无定形结构，其体外降解时间为数星期到数月。当增加羟基乙酸的比例时，共聚物的降解速度也会随之提高。这是因为乳酸在a-碳（OCH（CH3CH）上有体积较大的甲基，使得水分子不易渗入；而羟基乙酸在a-碳（OCH2CO）上只有一个质子，使得水分子容易接近酯键。5.2.2 聚合物纳米粒的制备方法传统聚合物纳米粒的制备方法主要有两大类：其一是将现成的聚合物进行分散，例如将PLA、PLG、PLGA和聚(-羟基己酸内酯)等聚合物在介质中进行再分散制备纳米粒4。 其二是在单体聚合过程中直接制备纳米粒。现成
12、聚合物进行分散的方法主要有以下几种：1乳化蒸发法这种方法是将聚合物溶于有机溶剂中，如二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯，药物被溶于或被分散于聚合物溶液中；该混合液加入到水溶液中进行乳化形成水包油体系（o/w），所用乳化剂或其它表面活性剂有明胶、聚乙烯醇、司班-80和泊洛沙玛（poloxamer-188）等；形成稳定乳液后，通过升温、减压或不断搅拌以蒸发有机溶剂。关于此方法中各种工艺因素对纳米粒形成的影响，Scholes在制备聚丙交酯/乙交酯共聚物纳米粒作为靶向药物载体的报道中，已有详细讨论5。 Zambaux等采用双乳化法（w/o/w）制备了水溶性药物载体聚乳酸纳米粒6。以上两种方法都应用高速均质器或超
13、声乳化。这些方法在实验室规模的制备上还是可行的，但对于规模化的生产，应采用低耗能的乳化装置。有关具体制备过程见后述。2自乳化/溶剂扩散法此方法是对溶剂蒸发法进行相应的改进7，水溶性的溶剂如丙酮或甲醇，与不溶于水的有机溶剂如二氯甲烷或氯仿，均匀混合作为有机相。由于溶于水的丙酮或甲醇自发扩散进入水相，两相之间的界面发生紊乱，聚合物形成了一种微粒。随着水溶性溶剂浓度的增加，微粒粒径将相应降低。有关具体制备过程见后述。3纳米沉积法此方法的基本原理是将聚合物从一个亲脂性溶液中沉积出来。这个亲脂性溶液是一种半极性有机溶剂与水的混合物。有关具体制备过程见后述。4盐析及乳化扩散法 上述方法都需要使用有机溶剂，
14、这对环境或生理都是有害的。对于注射用胶体体系，美国FDA对有机溶剂的含量有严格的要求。为了满足这些要求，Allemann及其同事提出了两种制备纳米粒的方法：一是盐析法；二是乳化扩散法8。 5超临界流体技术制备纳米粒 具有一定物理化学特性的纳米粒有助于药物的靶向输送，这在药物领域已是一个重要的课题。象溶剂蒸发法、凝聚法及原位聚合法这些传统方法常常需要使用有毒的有机溶剂或表面活性剂。因此，为生产这类具有微米或纳米尺寸的微粒，目前主要集中在研究一种对环境安全的包囊方法。如果在纳米粒里有残留的有机溶剂，其本身就有毒性，并且还可能在聚合物基体里分解药物。现在，超临界流体技术已成为一种极具吸引力的方法，因
15、为它使用对环境友好的溶剂，而且这种技术有利于制备高纯度的粒子而无有机溶剂残留。现已有大量文献报道了采用这种技术制备药物载体微粒9。 在超临界溶液中，溶质溶解在超临界流体里，这里所用的超临界流体一般都是二氧化碳，在超临界状态下，二氧化碳处于液体状态。溶液是通过喷嘴而迅速膨胀，导致超临界流体的溶剂作用大大减弱而最终使溶质析出。这种技术是清洁干净的，因为析出的溶质完全无溶剂。遗憾的是大多数聚合物微溶、不溶于超临界流体中，因此，这种技术并不具有很大的实际应用价值。在20世纪80年代后期到90年代早期，超临界流体技术曾广泛用于制备可生物降解药物载体，如聚合物PLA微粒。对于相对分子质量低于10000的聚
16、合物，采用这种方法能够得到药物在聚合物基体中的均一分布。然而超临界流体技术不适用于相对分子质量较高的聚合物，这是因为它们在超临界流体中的溶解能力受到限制，正是因为这些原因，现在所见的关于这种技术的文献比过去67年的文献要少得多9。另一种超临界流体技术被称为超临界反溶剂(SAS)方法，在一个装有超临界流体的沉淀器中，将溶质溶于一有机溶剂中并加入到该沉淀器中。在高压下，大量的反溶剂进入到液相导致溶解能力降低，溶质析出。当达到最后的操作压力时，反溶剂从容器中流出来以去除残余的溶剂，当溶剂的量降到指定的范围时，排空泄压，就得到了固体产品。SAS法的路线图见图5-1。在改进的SAS技术中，固体首先溶解于
17、适宜的溶剂中，然后此液体通过一个狭窄的喷嘴快速加入到超临界流体中，这种流体可以完全提取溶剂，使超临界流体中不溶固体沉淀，并得到较好的粒子。这种方法也称为气体反溶剂(GAS)技术，它成功地应用于微粒和纳米粒的制备。图5-1 SAS技术工艺流程示意图6聚合法 采用单体聚合法也可制备纳米粒，可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯(PACA)由于与人体组织具有良好的相容性，已被用作外科手术中的组织粘合剂。早在上世纪70年代就有报道在酸性介质中，以聚山梨糖醇-20作为表面活性剂，没有采用辐射或引发剂，而是通过机械分散氰基丙烯酸甲基或乙基酯单体聚合制备了相应的纳米粒 (200nm)。具体做法是在室温下，将氰基丙烯
18、酸烷基酯单体加入到含有表面活性剂的水溶液（聚合介质）中，剧烈搅拌下进行阴离子聚合反应。药物既可在单体加入之前，也可在聚合反应之后，溶于聚合介质中。制得的纳米粒悬浮液通过超速离心或不含表面活性的介质中再分散的方法进行分离纯化。上述的聚合反应机理属于阴离子型聚合，在亲核基团，如OH -、CH3O -和CH3COO -的的引发下，由于聚合反应的快速进行，从而形成了低相对分子质量的纳米粒。这样的纳米粒降解得很快。为了解决这个问题并制备高相对分子质量及稳定的纳米粒，聚合反应必需在酸性介质(pH=1.03.5)中进行，在含表面活性剂及稳定剂的酸性水溶液介质中，在单体分散以后，聚合反应需继续反应34小时，并
19、通过提高介质的pH来得到所需的纳米粒。在聚合反应中，使用各种不同的稳定剂如dextran-70/40/10，poloxamer-188/184/237等；另外，也可用各种表面活性剂，如聚山梨糖醇-20/40/80。纳米粒的粒径和相对分子质量取决于所用的表面活性剂及稳定剂的类型和浓度。图5-2描述了聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒的制备过程。纳米粒的粒径及相对分子质量与pH及聚合反应的介质有密切关系10。 当pH3.0时，不可能产生纳米粒。影响纳米粒形成的其它因素包括单体的浓度和搅拌速度。图5-2氰基丙烯酸烷基酯的阴离子型聚合制备纳米粒药物载体示意图7由亲水性聚合物制备纳米粒 亲水性聚合物如壳聚糖、明胶
20、和藻酸钠等也可用来制备纳米粒。Calvo等11报道了一种制备亲水性壳聚糖纳米粒的方法。这种方法涉及离子凝胶化，是两种水相的混合物：一种水相含有壳聚糖和二嵌段的氧化乙烯（EO）/氧化丙烯（PO）共聚物；另一种水相含有聚阴离子，三聚磷酸钠(TPP)。在这种方法中，壳聚糖的带正电荷的氨基基团与TPP的负电荷相互作用，通过改变壳聚糖与PEO-PPO二嵌段共聚物的组成，制备的壳聚糖纳米粒的粒径在200nm1000 nm，Zeta电势为+20mV+60mV。实验表明，这些纳米粒与蛋白质的结合性良好，如牛血清蛋白(BSA)、破伤风毒素、dipthaheria 类毒素、胰岛素和低聚核苷酸。Mao等12采用一个
21、复杂的共凝集技术制备DNA-壳聚糖纳米粒和DNA-明胶纳米粒，主要用于基因药物的胃肠道给药。实验表明，在负载免疫性的和抗肿瘤的蛋白质方面，壳聚糖纳米粒比明胶纳米粒更好。运用乳化共凝集技术也可制备壳聚糖纳米粒，在这种方法中，壳聚糖和所负载的药物都溶于水中，采用乳化剂在液体石蜡中制备w/o乳化液。 另一种新型的亲水性聚合物是可生物降解的聚酯，这种聚酯是由接枝在聚乙烯醇(PVA)，或电荷改性的丁基磺酸-聚乙烯醇(SB-PVA)上的短链聚内酯组成，它们是在不同的多元醇存在下，通过丙交酯和乙交酯的本体熔融聚合反应制备而来的。通过调节聚合物的组成，就可制备水溶性的梳状结构的聚酯，这些聚合物通过自组装得到纳
22、米粒，它能与许多蛋白，如牛血清蛋白、类毒素和细胞色素C等形成稳定的复合物。由这样的聚合物制备的纳米粒不需要加入溶剂或表面活性剂。8聚合物胶束技术制备纳米粒对于那些难溶于水的药物来说，采用聚合物胶束增溶技术也是一个行之有效的办法。聚合物胶束作为一种纳米药物载体，近来也受到极大关注。聚合物胶束的直径通常小于100nm， 并且具有不被单核吞噬细胞系统（MPS）所吞噬的能力。聚合物胶束是一种核-壳型结构，目前的研究主要集中在具有A-B结构的二嵌段型共聚物。这里，A表示亲水性外壳，而B表示疏水性内核。多嵌段型共聚物，如PEO-PPO-PEO（三嵌段型）也能聚集成为胶束。疏水性内核通常由一些可生物降解的聚
23、合物，如聚苄基天冬氨酸（PBLA）、聚乳酸、聚己内酯等构成；也可由某些水溶性聚合物构成，如聚天冬氨酸等，通过与疏水性药物以化学结合的方式，或者与带电荷的聚离子形成缔合物成为疏水性内核。图5-3为聚合物胶束的示意图。图5-3聚合物胶束示意图。左：二嵌段型共聚物；右：接枝型共聚物。折线表示疏水链段，曲线表示亲水链段，亲水性外壳由于涉及到胶束的稳定性，以及与血浆蛋白和细胞膜的相互作用，通常是由亲水性聚合物链构成，例如具有生物相容性的PEO等。另外，载体的生物分布也与亲水性外壳的性质有关。两亲性聚合物形成胶束的过程，类似小分子表面活性剂所形成的胶束。但是临界胶束浓度（CMC）要比小分子表面活性剂的CM
24、C低得多。例如PEO/PBLA的临界胶束浓度在0.0005%0.002%之间。两亲性聚合物可以形成两种不同类型的胶束，如图5-3所示，一种是疏水链无规地接枝在亲水聚合物上，另一种是亲水/疏水二嵌段型共聚物。前者的胶束尺寸小于后者。胶束尺寸的大小除与链结构有关外，另一主要因素是疏水相互作用。较强的疏水相互作用将限制胶束尺寸。当疏水端基发生缔合时，疏水链周围的水分子簇从疏水核内被排除。聚合物胶束的粒径一般在10nm100 nm之间，很少超过100 nm。其粒径大小取决于聚合物相对分子质量、亲水/疏水链的比例以及它们的聚集数。另外，对于温敏型的聚合物胶束，具有LCST特性（低临界溶液温度），即当温度
25、低于LCST时，聚合物是可溶的，而高于LCST时，聚合物会沉淀出来。这类聚合物胶束的粒径随着温度的升高会迅速增大，直至高于LCST时沉淀。这种胶束粒径与温度的关系是可逆的，当温度低于LCST时，胶束粒径恢复原来的状态。聚合物胶束的粒径及其分布可由光散射法直接测得，也可由原子力显微镜（AFM）、透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）测得。具有较长疏水链的聚合物胶束的稳定性通常较差，而较长亲水链通常能提高体外稳定性。类脂化合物的存在将增加聚合物胶束的体外稳定性，这是因为类脂化合物的脂酰基强化了胶束内核聚合物链之间的疏水相互作用。9聚合物纳米粒凝胶与上述聚合物纳米粒不同，近年来报道了一种新型的、作为
26、药物载体的聚合物纳米粒凝胶（Nanogel，与本书第七章所介绍的分子凝胶不同）13。据称，这种纳米粒凝胶与其他聚合物纳米粒相比，能显著增强药物的控制释放特性。聚合物纳米粒凝胶主要是由水溶性聚乙二醇（PEG）接枝聚乙烯亚胺（PEI）形成的交联结构产物，在结构上类似传统的聚合物水凝胶（Hydrogel）。纳米粒凝胶的尺寸范围在20nm220nm之间，而由传统的聚合物水凝胶制备的微球的尺寸范围在0.5m500m之间。纳米粒凝胶对于网状内皮系统是低敏的，但对组织和细胞却具有较好的渗透能力。由于PEI带正电荷，因此这种纳米粒凝胶能与带负电荷的分子作用，如寡核苷酸、蛋白、表面活性剂等。纳米粒凝胶的制备也采
27、用乳化/蒸发方法。一般过程如下：首先制备双活性端基的PEG。将市售的PEG与10倍过量的1，1-羰基二咪唑于40在无水乙睛中反应17小时。然后加水并在水中透析24小时，再经冻干处理。将具有双活性端基的PEG溶于二氯甲烷中，然后将此溶液滴加至PEI水溶液中，混合物超声处理30分钟。所得的白色乳液在减压下蒸出溶剂，产物为均匀的微乳白色悬浮液。在室温下维持搅拌17小时。较大的颗粒可通过离心分离，悬浮液再经水透析24小时。最后进行冻干处理。纳米粒凝胶与寡核苷酸的结合及其有关研究见后述。上述聚合物纳米粒制备方法见表5-1。表5-1 聚合物纳米粒制备方法聚合物适用的制备方法聚烷基甲基丙烯酸酯乳液聚合、溶剂
28、置换法、盐析法聚烷基氰基丙烯酸酯乳液聚合、界面聚合聚苯乙烯乳液聚合聚乙烯基吡啶乳液聚合聚丙烯醛乳液聚合聚戊二醛乳液聚合聚赖氨酸衍生物界面聚合聚乳酸乳化蒸发、溶剂置换法、盐析法、乳化扩散聚乙交酯/丙交酯共聚物乳化蒸发、溶剂置换法、盐析法、乳化扩散聚-己内酯乳化蒸发、溶剂置换法聚-羟基丁酸酯乳化蒸发乙基纤维素乳化蒸发、盐析法聚乙二醇/聚乙烯亚胺纳米粒凝胶乳化蒸发5.3 药物在聚合物纳米粒上的负载一个好的纳米载药系统应具有较大的载药量和较高的包封效率，以减少整个载药系统中载体的用量和药物的浪费。药物负载在纳米粒载体上通常采取两种方式：一是药物在纳米粒形成的同时与之结合，称之为包埋法；二是纳米粒形成以
29、后，在药物溶液中通过等温吸附与药物结合，称之为吸附法。大多数药物是采用前一方法与纳米粒载体结合。图5-4是药物在纳米粒上的负载示意图。从纳米粒/药物体系的吸附等温线可得到一些关于设计载药系统的重要信息，如纳米粒表面药物结合能力和被吸附的药物量。早期在研究聚氰基丙烯酸甲酯和聚氰基丙烯酸乙酯上吸附抗肿瘤药物放线菌素和氨甲蝶呤时，发现聚合物纳米粒结合氨甲蝶呤的量比结合放线菌素的量要少。一般说来，聚合物分子结构中烷基链越长，对药物的亲和性就越强，因此吸附量与聚合物的疏水基和纳米粒的特定区域有关。以包埋法为例，随着聚合单体浓度的增加，与药物缔合的能力也增大，但也有例外的报道。因此，对包囊药物来说，需要找
30、到一个最佳聚合单体的量。图5-4 药物在纳米粒上的负载状况。大黑点表示药物；斜线区域表示纳米粒的基体；小黑点区域表示表面活性剂。左图表示药物分散在基体中；中图表示药物被包封在基体内；右图表示药物吸附在基体表面。除了包埋法和吸附法外，Yoo等14报道了水溶性药物的负载新方法，在这种方法里，药物是以化学键的方式结合在纳米粒上。采用自乳化-溶剂扩散法分别制备了化学键合的阿霉素/PLGA和非化学键结合的阿霉素/PLGA纳米粒。前者的阿霉素包封率为96.6%，载药率为3.5%。而后者阿霉素包封率为6.7%，载药率为0.3%。5.3.1 脂溶性药物肠炎是一类常见病。以往的治疗方法需要每日服用抗炎药物，由于
31、较高的剂量而带来一些副作用。为避免这些副作用，过去曾采用固体剂型使药物在结肠释放。但这个方法因肠炎患者的腹泻而使药效大大降低。而药物载体颗粒尺寸在微米或纳米尺度时将极大改善这种现象。有报道称，最佳的载体颗粒尺寸在100nm1m之间。在这个范围内，载体颗粒在结肠炎症组织中的沉积量是无炎症组织中的56.5倍。这一方面可能归因于炎症组织的粘液分泌，另一方面归因于炎症组织中大量的巨噬细胞的吞噬。另外纳米载药系统在炎症部位的停留时间比常规药物明显增加，因此可相应减少药物剂量。 另外，由于纳米载体驻留在结肠的炎症部位，所用的聚合物必须是可生物降解的。文献上曾报道采用聚己内酯，这是一种具有生物相容性和可生物
32、降解性的合成聚合物。考虑到炎症组织含有较多带正电荷的蛋白，对带负电荷的物质有良好的亲和性。如果纳米粒表面带有较强的负电荷，这对纳米药物体系在炎症部位的驻留是有利的。因此可采用阴离子表面活性剂对纳米粒表面进行修饰。胆酸钠是一种生物相容性良好的阴离子表面活性剂，以往曾用于制备固体脂质纳米粒（SLN）。在这里，胆酸钠同样也可用于聚合物纳米粒的修饰。但是，在保护纳米粒经过胃肠道不被分解方面，高分子表面活性剂更为有效。下面以治疗肠炎的咯利普兰（Rolipram）为例15，介绍载药聚合物纳米粒的制备。Rolipram是一种特效静脉注射型磷酸二酯酶抑制剂，初期被用于抗镇静（抗精神失常）药。近来发现其在抗炎治
33、疗方面有良好的效果。由于Rolipram的亲脂性，在制备纳米药物时，可采用两种方法：1高压乳匀法（PHE） 在250 r/min转速搅拌下，将20mg的Rolipram溶于10mL含有125mg的聚己内酯的氯甲烷中。然后将混合溶液加入到100mL的PVA（或胆酸钠）水溶液中，通过高压均质器进行乳化。在2107Pa的压力下，循环3分钟。在旋转蒸发器上将氯甲烷蒸出。未包封的药物和游离的PVA（或胆酸钠）经无离子水透析12小时后被分离。所得聚合物纳米粒的粒径与所用表面活性剂的种类和浓度有关，如PVA浓度为1%时，粒径约为400nm左右，且单分散性较好。PVA浓度为4%时，粒径约为600nm左右。采用
34、胆酸钠时，粒径与浓度关系不大，浓度为0.5%5%时，粒径约为200 nm左右。2自乳化溶剂扩散法（SESD）在250r/min转速搅拌下，将125mg的聚己内酯和20mg的Rolipram溶于6mL丙酮中, 再滴加4 mL乙醇。在400r/min转速搅拌下，将此有机相加入到100mL的PVA（或胆酸钠）水相中，继续搅拌3分钟。然后在24000r/min，4离心20分钟。游离的药物和PVA（或胆酸钠）用超滤分出。分离得到的产物在超声池中用水再分散，然后冷冻干燥。与高压乳匀法相比，自乳化溶剂扩散法在以胆酸钠为表面活性剂时，所得聚合物纳米粒的粒径随所用胆酸钠的浓度的增高而下降（见图5-5）。胆酸钠浓
35、度为1%5%时，粒径约为280 nm左右。而Zeta电势与胆酸钠浓度没有明显的相关性（在所用浓度范围内）。图5-5 胆酸钠浓度与聚合物纳米粒的粒径、Zeta电势的关系（数据源自文献15）。：粒径；：Zeta电势。聚合物胶束负载的脂溶性药物见图5-6图5-6聚合物胶束负载脂溶性药物的示意图理论上，负载在聚合物胶束上的抗癌药物可用于各种给药方式。但实际上，目前几乎只有非肠胃的注射给药的报道。聚合物胶束负载的脂溶性药物，对于靶细胞或组织具有较高的传递效率，因此可降低在正常组织中的滞留，从而降低其毒副作用。作为静脉给药，由于聚合物胶束的小粒径和亲水的外壳大大减少了MPS的摄取，同时较高的相对分子质量也
36、减缓了通过肾脏被排泄的速度，因而延长了在体内的循环时间。据报道，在静脉给药几小时后，仍可从血浆中检测到完整的聚合物胶束。表5-2是聚合物胶束负载的脂溶性药物的部分实例。表5-2 部分脂溶性药物在聚合物胶束上的负载药物聚合物胶束粒径（nm）文献两性霉素BPEO-聚苄基天冬氨酸（PBLA）26 16反义寡核苷酸PEO-聚赖氨酸P(Lys)50 17顺铂PEO-聚天冬氨酸P(Asp)16 18吲哚美辛（镇痛消炎药）PEO-聚己内酯（PCL）145165 19安息香酸碘衍生物PEO-聚赖氨酸P(Lys)80 20质粒DNAPEO-聚赖氨酸P(Lys)140150 21阿霉素（DOX）PEO-聚苄基天冬
37、氨酸（PBLA）37 225.3.2 水溶性药物盐酸普鲁卡因23是一种水溶性药物。据报道，在D，L-聚丙交酯/乙交酯共聚物（PLGA）纳米粒上，其载药量可达到10%。相应的包封率在5%14%左右。聚合物纳米粒的尺寸在150nm210nm之间。制备方法是采取溶剂置换法（纳米沉淀法）。其原理是基于界面沉析，聚合物从一个半极性、与水相容的溶剂中，通过加入一定量的水，使之沉析出来。精确称取D，L-聚丙交酯/乙交酯共聚物（PLGA）50mg以及特定量的药物盐酸普鲁卡因溶于5 mL的乙睛中，在室温、搅拌下，将此有机相混合物滴加至15 mL水相中，维持搅拌直到有机溶剂完全挥发。水相的pH值在这一制备过程中十
38、分重要。水相pH值的增加，将导致盐酸普鲁卡因溶解性的降低。当水相pH值从5.8到9.3时，载药量从11%增加到58%。这可能归因与盐酸普鲁卡因在pH9.3时的离子化程度（溶解性）的改变，在pH9.3仅有33.4%的盐酸普鲁卡因离子化，而在pH5.8时，其离子化程度高达99%。因此，降低药物向pH9.3的水相的迁移，对于增加药物在纳米粒上负载量是有意义的。图5-7为不同载药量的PLGA纳米粒的TEM照片。 图5-7不同载药量的PLGA纳米粒的TEM照片。左：2%载药量；中：4%载药量；右：10%载药量。为了增加水溶性药物与聚合物基体的结合性，可在聚合物基体中加入聚天冬氨酸，其作用相当于一种络合剂
39、。 这是由于阳离子的药物与聚天冬氨酸结构上的羧基发生静电相互作用，增加药物与聚合物基体的结合性。但是实验发现，在加入聚天冬氨酸后，盐酸普鲁卡因的载药量并没有明显的增加。而另一种阳离子水溶性药物，二咪那嗪醋酸酯（一种抗寄生虫药）的载药量从0.26%增加到0.58%，包封率从5.9%增加到21.8%。尽管这两种药物均为阳离子型，分子结构上均有胺基可与聚天冬氨酸结构上的羧基发生静电相互作用，但与聚合物基体的结合性上存在较大差异。通过等温滴定微量热的进一步研究，发现两种药物与聚天冬氨酸复合物的热行为不同。盐酸普鲁卡因与聚天冬氨酸作用时，是吸热过程。而对二咪那嗪醋酸酯来说则是放热过程。这个结果表明两种药
40、物与聚天冬氨酸的亲和性不同。这一点可从二者的化学结构差异得到解释：二咪那嗪醋酸酯的分子结构上含有更多的胺基，因而具有更高的电荷密度，这有利于增强与聚天冬氨酸的相互作用。 紫杉醇（paclitaxel），是一种从太平洋紫杉树的树皮和针叶中提取的抗癌药，具有明显的抗肿瘤作用。对子宫癌和乳腺癌、小核细胞和大核细胞肺癌、脑瘤、颈瘤和转移性黑色素瘤等有明显的效果。紫杉醇在临床应用上的主要困难是它不溶于水（大约1g/mL）。 典型的紫杉醇制剂是一种聚氧乙基化蓖麻油（Cremophor EL）和无水乙醇的浓缩液（每毫升含有6毫克的紫杉醇），在使用之前必须稀释。为了达到足够剂量的紫杉醇，聚氧乙基化蓖麻油的使用
41、量较大。现已发现某些毒副作用，包括血管舒张、呼吸困难和血压过低都归因于聚氧乙基化蓖麻油。动物实验和临床试验表明这种载体能够引起严重的过敏症状。事实上，通过静脉将药物紫杉醇注射到大鼠体内的急性致死毒性主要是由聚氧乙基化蓖麻油所引起的。 这种紫杉醇制剂在临床上并非对所有肿瘤都有疗效，这可能是由于上述紫杉醇制剂不具有靶向性，故未进入某些肿瘤细胞组织。 制备水溶性的紫杉醇通常在紫杉醇的2-羟基或者7-羟基处引入可溶性基团（见图5-8），如琥珀酸盐和氨基酸得到紫杉醇前药。但是这些前药缺乏足够的化学稳定性。为了克服上述缺点，美国专利提出，在紫杉醇或紫杉萜的2-羟基或者7-羟基处（见图5-8）与水溶性聚合物
42、（如聚谷氨酸，聚天冬氨酸）反应。这些复合物的抗肿瘤效果十分明显。再将此复合物按一般纳米粒制备方法制成纳米剂型。该专利所描述的方法也可用于制备其它药物与水溶性聚合物的复合物，例如eropside、 teniposide,、fludarabine（抗肿瘤药）、 阿霉素、 红比霉素、大黄素、5-氟尿嘧啶、FUDR、雌二醇、喜树碱、维生素A酸、异搏定，epothilones和环孢菌素等，这些具有羟基的化合物能象紫杉醇（paclitaxel）一样通过类似的化学反应与水溶性聚合物反应。这种反应在化学中已经研究得比较成熟。 图5-8 紫杉醇化学结构（R1，R2：H） 5.3.3 蛋白、肽、核酸类1多肽类药物
43、的输送体系 随着生物技术的发展，多肽类药物日益受到重视，尤其是DNA重组技术的发展使得这类药物能以较大规模进行生产。然而多肽药物在实际应用中受到一定的限制，这是由于肽在胃肠里被蛋白酶迅速降解。因此，它们通常采取静脉给药方式。又由于肽的生物半衰期很短，故需频繁给药。同时，多肽类药物穿过生物屏障的能力较弱，这归因于它的弱扩散作用和低分配系数。为了解决这些问题，对于多肽类药物的安全而可控静脉内给药，人们提出了生物降解纳米粒为载体的载药系统。 由于丙交酯/乙交酯共聚物（PLGA ）的疏水性和酸性，蛋白和多肽在PLGA中是不稳定的。此外,蛋白类药物从PLGA基体中释放时，存在一个爆释现象。对此，人们采用
44、不同的方法改变聚合物纳米粒的表面特性，研制了一些新的纳米粒载药系统。在这些研究中，最初是将牛血清白蛋白（BSA）负载在聚乙烯醇（PVA）纳米粒上，其后是负载在PLGA-PVA复合物纳米粒上。Gasper等24的最新研究表明，PLGA的末端羰基具有较高的负载蛋白的能力，负载量可达质量分数为4.68%，并且连续释放约为20天；另一方面，而末端酯化的羰基负载能力较低 (质量分数为2.65% )，并且释放时间约为14天。还有报道采用自乳化/溶剂置换技术，制备了负载PGDF受体（PGDFR）、AG-1295的聚乳酸纳米粒，并研究了它们的释放动力学、体外释放速率以及纳米粒尺寸的影响。在对负载胰岛素的PLG
45、A纳米粒（400nm）的肺部给药系统的研究中，也是应用乳化溶液分散方法制备纳米粒。与胰岛素的水溶液喷雾相比，通过雾化法把PLGA纳米粒的水分散体输送到豚鼠中，48小时后，血糖水平明显降低。在初始释放期，从纳米粒中释放的药物约为85%，药物的释放个可达数小时。 应用相转变纳米包囊技术，胰岛素也成功包裹在不同的聚酯和聚酸酐纳米粒上。被包囊的胰岛素保持了它的生物活性，释放胰岛素的时间超过6h。在含有富马酸酐齐聚物和氧化铁添加剂的PLGA纳米粒中，1.6%的胰岛素锌口服具有活性，同样具有控制血糖水平的功能。2核酸的输送和释放近年来，基因疗法已经成为一种治疗疾病的新方法，但在临床实践中较难取得成功，主要
46、原因在于缺乏一种有效的、定向的基因载体。因此，基因的输送也是对载药系统研究领域的一个挑战性任务。可生物降解聚合物是一种有潜力的载药系统。其优势是高分子体系的稳定性、易处理性。用聚合物纳米控释系统输送核苷酸有许多优越性，如能保护核苷酸，防止降解；有助于核苷酸转染细胞，并可起到定位作用；能够靶向输送核苷酸。有研究表明，负载寡核苷酸的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒，无论在缓冲液还是在细胞培养基中，结合在纳米粒上的寡核苷酸都具有对抗核酸酶的作用，防止了核苷酸的降解，并通过细胞对纳米粒的吞噬作用而增加了寡核苷酸进入细胞内的量，同时增强了其在细胞内的稳定性。Godard等25将胆固醇结合到十二聚体的寡脱氧核糖核
47、酸上，形成复合物，该复合物通过胆固醇基团吸附到聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒上，然后转染人类膀胱癌细胞T24，该复合物能与Ha-ras原癌基因mRNA变异区互补而形成双螺旋，从而起到反义效果，抑制人类膀胱癌细胞T24在培养基中的增生。纳米控释系统在体内同样能保护寡核苷酸，防止降解，例如将33P-pdT16特异地输送到肝脏，可减少其在肾和骨髓中的分布。静脉注射5分钟，纳米粒能部分地保护pdT16，防止其在血浆和肝脏中降解，而游离的pdT16在此时已经完全降解。一般说来，这些纳米粒都在150nm以下，并且至少30%的纳米粒都在100nm以下。 在负载核酸的纳米粒的制备中，沉淀/溶剂蒸发法是常用的方法。一
48、般制备过程中是将聚合物溶解于含凝结剂和药物的溶剂中（如三氟乙醇，TFE），再加入非溶剂使其沉淀出来。尤其是对剪切敏感分子（如DNA），这种方法可避免机械应力作用对DNA的破坏。用于制备这类纳米粒的高分子材料包括丙交酯/乙交酯共聚物（PLGA）、聚-己内酯、聚羟基丁酯和其它聚酯类。另外，在制备这类纳米粒时，还使用某些凝结剂，常用的有聚L-赖氨酸、聚d-赖氨酸、肌胺、亚麻酸、乳酸/赖氨酸共聚物、1，2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷（TAP）、1，2-二酰基-3-二甲基铵-丙烷（DAP）、二甲基二十八烷基溴化铵（DDAB）等。 另外，吸附于纳米粒表面上的修饰物，可以防止被特定细胞表面识别，故能用于静脉给药。聚乙二醇（P
