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1、毕 业 论 文（设计） 题 目： 葡萄WRKY13参与对植株生长调控 及对ABA的应答 目 录中文摘要.1Abstract.2引言.41 材料与方法.61.1 实验材料.61.1.1菌株及载体.61.1.2 常用酶、化学药品、试剂盒.61.1.3 实验仪器.61.2 实验方法.61.2.1 材料培养.61.2.2 材料处理.61.2.3 培养基的配置.71.2.4 重组质粒的鉴定.71.2.5 根癌农杆菌（GV3101）感受态细胞的制备及转化.71.2.6 花芽浸蘸法转化拟南芥及阳性植株的筛选.81.2.7 气孔开度测定.81.2.8 实时定量PCR.82 结果与分析.92.1 葡萄WKRY1
2、3的异源表达植株的获得.92.1.1 p-Super1300-WRKY13重组质粒的构建.92.1.1.1 p-Super1300-WRKY13重组质粒的菌落PCR鉴定.92.1.1.2 p-Super1300-WRKY13重组质粒的酶切鉴定.102.1.2 p-Super1300-WKRY13重组质粒转入农杆菌菌落PCR鉴定.102.1.3 转基因植株的筛选.112.1.4 转基因植株的PCR鉴定.112.1.5 转基因植株的WRKY13基因相对表达量.112.2 葡萄WRKY13异源表达植株生长的变化.122.2.1 葡萄WRKY13异源表达植株的种子萌发率.122.2.2 葡萄WRKY1
3、3异源表达植株根系的生长.132.2.3 葡萄WRKY13异源表达植株主根的长度.132.2.4 葡萄WRKY13异源表达植株侧根的数目.142.2.5 葡萄WRKY13异源表达植株侧根的长度.142.3 葡萄WRKY13异源表达植株对ABA的应答反应.142.3.1 ABA对WRKY13异源表达种子萌发率影响.152.3.2 ABA对WRKY13异源表达植株根系生长影响.152.3.3 ABA对WRKY13异源表达植株气孔开度的影响.162.3.4 葡萄WRKY13异源表达植株ABA相关基因的表达量.163 讨论.17致谢.19参考文献.20葡萄WRKY13参与对植株生长调控及对ABA的应答
4、摘要：葡萄作为一种具有高营养价值和经济价值的果树，对探明其生长发育的机制，提高产量和品质具有极为重要的现实意义。研究表明，转录因子和脱落酸(abscisic acid，ABA) 都能参与调控拟南芥植株生长发育，并且二者存在着联系，但尚未见葡萄转录因子WRKY13与ABA在调控植物生长发育作用的报道。本实验综合应用植物生理学和分子生物学等现代生物学技术，获得WRKY13异源表达植株，探究了葡萄WRKY13对植物生长发育的影响以及对ABA的应答反应。结果表明：葡萄WKRY13异源表达植株的种子萌发延迟，侧根数目增多并且种子萌发、根系和气孔表现出对ABA的不敏感性，ABA能够显著提高WKRY13异源
5、表达植株的ABA合成基因（ABA1、ABA2）和其信号途径的相关基因（ABI1、ABI3）的表达量，但差异不显著。关键词:葡萄;WRKY13;脱落酸;生长发育 VvWRKY13 regulates plant growth and responds to ABAStudent majoring in biological sciences Sun changming Tutor Prof. Liu XinAbstract: As a kind of high nutritional and economic value of fruit trees, grapes has very impor
6、tant practical significance to prove its growth mechanism and to improve the yield and quality. Previous study has shown that WRKY transcription factors and the plant hormone abscisic acid (ABA) in Arabidopsis thaliana could be involved in regulation of plants growth and development. In addition, th
7、e WRKY transcription factors could belocated in the process of ABA signaling pathways. But we yet cant see any reports about WRKY13 and ABA in grapes influencing plant growth and development. The study which applied plant physiology, molecular biology and other modern biology technology got VvWRKY13
8、 ectopic expression of plants, explored VvWRKY13 how to impact on plants growth and development and responded to the ABA. In the study, VvWKRY13 ectopic expression of plant showed a delay in seed germination and a increase in lateral root number. Besides we find that seeds germination, root and stom
9、a showed no sensitivity to ABA. The expression of volume of ABAs synthetic genes (ABA1, ABA2) and signaling pathways related gene (ABI1, ABI3) were influenced by ABA to rise to different extent, but the difference was not significant. It can be showed that WRKY13 can participate in the regulation of
10、 plants growth and development as well as the ABA signal transduction.Key words: Vitis vinifera;WRKY13;Abscisic acid; Growth 缩略词对照表缩写英文名称中文名称ABAabscisic acid 脱落酸Ampampicillin氨苄青霉素ODoptical density光密度LBluria-bertani mediumLB培养基PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应X-gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-gala
11、ctoside5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷引言 葡萄是葡萄科（Vitaceae L.）葡萄属（Vitis L.）的藤本落叶果树，出现在白垩纪初期，是世界上最早驯化的水果之一，在古代，葡萄就已经被大量的栽培和用于酿酒1。据统计，现在世界葡萄栽培面积和产量居世界水果的第二位，并且我国葡萄产量居世界第五名。葡萄作为一种具有高营养价值和经济价值的果树，其生长发育过程中受到诸多不利的外界环境的影响。如夏季葡萄极易感染病害、秋季果实难以完全成熟和冬季花芽不能充分分化等等，导使我国的葡萄产量和质量无法达到较高层次，造成巨大的经济损失。葡萄生长发育的调控及其机制的研究受到科学工作者的关注，在生产过程中
12、，主要是通过对肥料和水利的控制，以及外施不同生长相关激素，从而达到对葡萄生长发育的调控。在研究方面，主要集中在葡萄花的形成、芽的分化以及果实成熟过程中相关基因表达量和生理指标的变化等方面。但是鲜见转录因子在葡萄激素调控植株生长过程中作用分子机制的研究报道。大量的研究发现证实在与种子萌发、叶片和根系生长、开花等发育相关的基因中存在WRKY结构域。最早发现的野生燕麦中的WRKY家族成员ABF1和ABF2参与了种子的萌发3；茄科中的转录因子ScWRKY1被证明在植物胚形成过程中发挥重要作用4；随后2005年Luo等发现拟南芥中WRKY转录因子参与了种子大小的形成5，特别是对拟南芥中WRKY2的功能进
13、行研究后，发现其可以调控种子萌发过程，其对脱落酸（abscisic acid，ABA）的敏感性增强，WRKY2可以调节由ABA诱导的幼苗生长停滞6；在最近的报道中，2013年Kang等发现拟南芥转录因子WRKY家族成员MINISEED可以调控SYG1类蛋白SHB1的活性，从而参与到种子发育过程7。而WRKY在植物花发育方面的研究也有相关的报道，在2011年Wang等发现转录因子WRKY参与了拟南芥的花粉形成8；而野生大豆的GsWRKY20异源过表达后，可通过影响花相关基因的表达量，从而影响了植物的开花时间9。但罕见在葡萄生长发育过程中WRKY转录因子的相关报道，Terrier等2005年进行了
14、葡萄浆果生长过程基因表达的研究，初步推测转录因子WRKY家族在这其中发挥重要作用10。 有报道称WRKY转录因子可以参与植株内激素等物质的生物合成，从而影响了植物的生长发育。在最新的研究中发现，转录因子WRKY是ABA信号途径的关键组分，特别是有关于某些WRKY是ABA诱导的对种子发芽起到负作用证明，但是转录因子WRKY在ABA信号途径其他方面的作用以及作用机制一直不是很清楚。ABA是一种重要的植物激素，在植物生长过程中发挥着重要作用，参与调控种子萌发，芽休眠，气孔运动，促进叶、花和果实脱落，引起块茎休眠、叶片衰老，促进果实产生乙烯和果实成熟等植物生长发育过程，同时参与植物体对干旱、盐胁迫和极
15、端温度等胁迫响应11。ABA调控生长发育方面发挥重要作用，前期在进行水稻愈伤组织、不定胚发育及其植株再生的研究时发现，ABA可以促进细胞的再生12；ABA能够调节花芽分化时期，影响花的形成13；黄独试管苗的生长和发育受低浓度ABA的诱导，但高浓度ABA却表现出明显的毒害作用14；ABA可以调控侧根的起始基因的表达、活化侧根的分生组织15。近期关于ABA作用的研究有了更新的报道，内胚层的ABA可以促进盐胁迫调节下根系侧根（Quiescent center，QC）的细胞中细胞活性，从而影响胁迫16。水稻中的OsPYL/RCAR5可以在种子萌发和幼苗早期生长阶段起到促进作用17；Hoai Nguye
16、n Nguyen等2013年发现TTG1调节的植物内黄酮醇的生物合成可以减弱ABA对根系生长的抑制作用18；生长素在种子休眠调控因子ABI3上游发挥作用，而且生长素的反应因子10和16通过控制ABA信号途径中的ABI3的表达调控种子休眠19，同年Rongbin Hu等研究ABA调控的种子成熟和幼苗生长时，也发现TAP46是拟南芥中调控PP2A活性的相关蛋白，从而参与了这个过程20。 Xiao等发现水稻的 WRKY13参与调控拟南芥对生物胁迫和非生物相关的响应21；大豆的WRKY13异源过表达拟南芥株系对ABA敏感度下降，侧根数目和侧根长度明显优于野生型22。近期在拟南芥中已经将WRKY定位于A
17、BA信号途径过程中，并且在种子萌发过程中发挥这重要作用23。此外，在拟南芥中，两个ABA受体（PYL/ RCAR和ABAR-ABA）是WRKY的下游组分，这些新的发现表明一些WRKY转录因子可以正向的参与ABA诱导的气孔关闭以及抗干旱胁迫24。但是WRKY转录因子在ABA信号途径其他方面的作用以及机制还一直不是很清楚，而且至今未见WRKY13参与葡萄生长的研究报道以及葡萄生长过程中WRKY13和ABA之间的关系。那么在葡萄生长过程中是否有WRKY和ABA的参与？其功能又是如何？本实验通过获得WRKY13异源表达植株，探究了葡萄WRKY13对植物生长的影响以及葡萄WRKY13异源表达植株对ABA
18、的应答反应，对提高葡萄的产量和品质、增强我国葡萄在国际市场上的竞争力具有极为重要的现实意义。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1菌株及载体 菌株：大肠杆菌菌株E.coli DH5，农杆菌菌株GV3101由青岛农业大学植物逆境生理与分子生物学实验室提供。克隆载体：Super1300载体购自TaKaRa公司（大连）。拟南芥选用哥伦比亚型。1.1.2 常用酶、化学药品、试剂盒 限制性内切酶、Ribonuclease inhibitor、T4DNA ligase、solutionI、DNaseI、TaqDNA polymerase、dNTP、Reverse Transcriptase M-MLV、
19、DL2000 DNA Marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒等均购自Takara公司（大连）； 氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）、卡那霉素（Kanamycin Monosulfate，Kan）、利福平（Rifampicin，Rif）、潮霉素（Hygromycin，Hyp）等抗生素均购自Amerisco公司（U.S.A）； 其余化学试剂均为国产分析纯。1.1.3 实验仪器Bio-Rad MyCycler梯度PCR仪；Lightcycler 480罗氏荧光定量PCR；Sigma台式高速离心机；Eppendorf CENTRIFUGE 5430R高速冷冻离心机；Amersh
20、am电泳设备；SHIMADZU UV-mini 1240紫外分光光度计；自动型高温灭菌锅；-80 超低温冰箱；振荡培养箱；哈东联紫外超净工作台；pH1211 pH计；水浴锅；恒温金属浴；Thermo微量移液器等其他常规仪器等。1.2 实验方法1.2.1 材料培养大肠杆菌以LB培养基进行培养，添加相应抗生素后进行转化株系的筛选。农杆菌菌以YEB培养基进行培养，添加相应抗生素后进行转化株系的筛选。在MS固体培养基培养转基因拟南芥，添加相应的抗生素后进行筛选。1.2.2 材料处理将同时期收获的经过在4条件下处理2-4d打破休眠的野生型和过表达种子（每种约150粒），点种于无菌1/2MS固体培养基，光
21、照培养箱 (22 ，14 h/10 h光周期) 垂直生长，分别测定0、6、12、24、36、48、60、72、84、108h的种子的萌发率。取同时期收获的经过在4条件下处理2-4d打破休眠的野生型和过表达种子，点种于无菌1/2MS，光照培养箱 (22 ，14 h/10 h光周期) 垂直生长约3d，挑选生长一致的幼苗，移到另外无菌的1/2 MS培养基上，光照培养箱 (22 ，14 h/10 h光周期) 垂直生长10 d，每天记录拟南芥的侧根数量，测定最长侧根和主根长度。将同时期收获的经过在4条件下处理2-4d打破休眠的野生型和过表达种子（每种约150粒），点种于含有不同浓度的ABA（0、5和10
22、mol/L）的无菌1/2 MS固体培养基，光照培养箱 中(22 ，14 h/10 h光周期) 垂直生长，分别测定0、6、12、24、36、48、60、72、84和108h的种子的萌发率。取同时期收获的经过在4条件下处理2-4d打破休眠的野生型和过表达种子，点种于无菌1/2MS，光照培养箱 (22 ，14 h/10 h光周期) 垂直生长约3 d，挑选生长一致的幼苗，移到含有不同ABA浓度（0、5和10mol/L）无菌1/2MS固体培养基，光照培养箱 (22 ，14 h/10 h光周期) 垂直生长10d，每天记录拟南芥的侧根数量主根长度。 每个试验重复3次，每次试验设置三个重复。1.2.3 培养基
23、的配置MS 培养基：MS4.4 g/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 1 %，pH 5.8，121高压灭菌20min，后倒平板。LB 液体培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，灭菌锅中121高压灭菌20 min。YEB 液体培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 1 g/L，蔗糖 5 g/L，MgSO47H2O 0.5 g/L，pH 7.0，装瓶后在灭菌锅中121高压灭菌20 min。基上，铺板，37 倒置培养1016 h后观察结果。1.2.4 重组质粒的鉴定 提取质粒：使用质粒小量抽提试剂回收目的条带（参见Takara试剂盒说明书） P
24、CR鉴定：以质粒DNA为模板，按相应的PCR体系与程序进行PCR鉴定，以无菌ddH2O为模板作为阴性对照。 酶切鉴定：取质粒DNA 4 L加入相应的限制性内切酶各0.5 L和2 L缓冲液，在20 L的反应体系中于37 酶切反应30min，电泳检测酶切效果。1.2.5 根癌农杆菌（GV3101）感受态细胞的制备及转化 活化-80超低温保存根癌农杆菌（GV3101）接种于3 mL YEB液体培养基中（含50mg/L Rif），28 振荡培养箱中振荡培养过夜。活化后取500 L菌液加入到50 mLYEB液体培养基中，28 振荡培养箱中振荡至OD600为0.5左右（4 ，5000 rpm）离心5 mi
25、n，收集菌体，放于10 mL预冷的0.15 mol/L NaCl溶液悬浮，冰浴片刻，4 ，5000 rpm离心5 min。取1 mL预冷的20 mmol/L CaCl2重悬菌体，分装成每管200 L，液氮中速冻1 min，置-80 保存备用。1.2.6 花芽浸蘸法转化拟南芥及阳性植株的筛选正常条件下培养的拟南芥，在抽薹4-5 cm时剪去顶端花序，使腋生花序生长，约4-5 d后进行转化，转化前去除已经开放及露白的花蕾，同时剪去角果。将拟南芥整株与花盆一起倒扣在菌液中浸苗3-5 min，转化完毕后取出花盆，侧放于托盘中，避光培养24 h后，直立放置花盆，进行正常的光照培养。收取已成熟的T1代种子，
26、点播在含50 mg/L Hyg的MS培养基中，4 处理3 d后移入光照培养箱。8-10 d后挑选转化体，将苗移入土中培养，以收获T2代种子。将T2代种子继续种于含有Hyg的MS选择培养基上，选择接近3:1分离群体的抗性植株，种植收获T3。若T3代种子在选择性培养基中全部具抗性，则对应的T3代种子便是纯合体。提取其叶片RNA，用基因的特异引物进行RT-PCR检测。1.2.7 气孔开度测定取生长良好的4-5周龄拟南芥植株完全展开的莲座叶，光下（光强200mol/m2/s）60 min 诱导气孔张开。取叶片下表皮，去除叶肉细胞，放置于含有ABA处理的MES溶液中，在光下（光强200mol/m2/s）
27、处理60 min，放置于显微镜下，随机取3个视野测量，再在每个视野中随机选取10个气孔，用显微测微尺测量记录气孔孔径。1.2.8 实时定量PCRCTAB法提取处理后的葡萄总RNA，M-MLV反转录试剂盒合成cDNA第一条链作为模板。Real-time PCR程序为：95 60 sec，95 10 sec，56 20 sec，72 15 sec，40个循环；Melt曲线从72 至99 ，第1步维持45 sec，以后每升高1 维持5 sec。每个样品进行3次重复。以ACTIN为内参对基因进行相对定量，Real-time PCR引物。定量实验所用引物如表1所示。表1 Real-time PCR引物基
28、因名称引物序列VvWRKY13FP: CGACTCGTTTCTTTACGCRP: AGTGAGGTGGATGTTCTTGVvactinFP: AATGAGAGATGGCTGGAAGAGRP: TACGAGCAAGAGCTGGAAAAtABA1FP: TATGAAGGTGATCTGCTTGTGGRP: CGTGTAACAAGTGTAGCCTGAAtABA2FP: TGGAGGAGCCACAGGGATARP: TTGGACTCACCACGAAGCAAtABI1FP: GCCTTTGTATGGTTTTACTTCGRP: GGATCAAACCGACCATCTAACAtABI3FP: AGCCAGAGT
29、TCCTTCCTTTARP: TTGGTACGGATTCATGTTGT2 结果与分析2.1 葡萄WKRY13的异源表达植株的获得2.1.1 p-Super1300-WRKY13重组质粒的构建 bp20001000750500250100S2M2.1.1.1 p-Super1300-WRKY13重组质粒的菌落PCR鉴定图1 p-Super1300-WRKY13重组质粒的菌落PCR鉴定Fig.1Analysis of PCR products of recombinant plasmids of p-Super1300-WRKY13 注：M：DL 2000 DNA Marker； S1和S2：两个
30、样品 将双酶切得到的WRKY13片段回收，分别与同样双酶切回收的Super1300载体连接转入大肠杆菌DH5中，挑取单菌落PCR鉴定。结果显示，扩增得到大小约700 bp左右的片段（图1），说明样品中包含带有目的片段WRKY13的重组质粒。2.1.1.2 p-Super1300-WRKY13重组质粒的酶切鉴定 S1bp20001000750500250100M 图2 p-Super1300-WRKY13重组质粒酶切鉴定Fig.2 Analysis restriction digestion analysis of recombinant plasmids of p-Super1300-WRKY
31、13注：M：DL 2000 DNA Marker； S1和S2：两个样品 选取阳性克隆，提取质粒，经Xba和Kpn双酶切鉴定，片段大小一致，测序正确（图2）。2.1.2 p-Super1300-WKRY13重组质粒转入农杆菌菌落PCR鉴定 bp20001000750500250100S2MS1图3 p-Super1300-WRKY13重组质粒转农杆菌GV3101菌落 PCR鉴定Fig.3Analysis of PCR products of recombinant plasmids of p-Super1300-WRKY13注：M：DL 2000 DNA Marker； S1和S2：两个样品
32、将正确的p-Super1300-WKRY13重组质粒转化农杆菌GV3101，挑取单菌落，进行PCR鉴定，显示片段大小正确（图3），说明菌落包含重组质粒的农杆菌。2.1.3 转基因植株的筛选 图4转基因植株在抗性MS培养基上的生长情况 Fig.4 The growth of transgenic plants on MS-Hyp 利用花芽浸蘸法转化拟南芥，收获T0代种子，用50 mg/L的Hyp对转基因拟南芥种子进行筛选，观测转基因植株在抗性MS培养基上的生长情况（图4），挑选生长状态良好，根系发达的幼苗移苗培养，进行后续鉴定。2.1.4 转基因植株的PCR鉴定bp200010007505002
33、50100S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 M图5 转基因过表达拟南芥抗性植株PCR鉴定Fig.5 Analysis of PCR products of transgenic plants 注：M：DL 2000 DNA Marker； S：多个个样品 抗性培养基上生长良好的拟南芥幼苗，移植在营养土中进行培养，提取四周龄植株叶片的中DNA，进行PCR鉴定，结果显示大小正确，条带单一（图5）。结果表明获得WRKY13基因的异源过表达拟南芥植株。2.1.5 转基因植株的WRKY13基因相对表达量图6 转基因植株WRKY13的基因相对表达量Fig.6 Quant
34、itative RTPCR analysis of WRKY13 expression of transgenic plants 利用实时定量PCR技术对转基因植株不同的株系中的WRKY13的表达量进行了检测，从图6得知，转基因植株中各个株系均有不同程度的过量表达，但不同的株系之间基因的表达量差异明显，选择了OEWR13A和OEWR13B两个过表达株系进行后续实验2.2 葡萄WRKY13异源表达植株生长的变化2.2.1 葡萄WRKY13异源表达植株的种子萌发速率图7 葡萄WRKY13异源表达植株的种子萌发速率Fig.7 Germination of WRKY13 overexpression
35、plants in grapevine 由图7得知，虽在60 h时野生型和异源表达种子都全部萌发，但WRKY13异源表达植株种子的萌发时间延迟，野生型萌发的最早时期是6 h，而过表达株系萌发的最早时期是12h；在第36 h时野生型和过表达的萌发率差异最显著，推测葡萄WRKY13延缓了种子萌发的过程。 WT OEWR13A OEWR13B 图8葡萄WRKY13异源表达植株根系生长的情况Fig.8 The root growth of WRKY13 overexpression plants in grapevine2.2.2 葡萄WRKY13异源表达植株根系的生长 从图8可以看出，异源表达植株拟南芥的侧根数
