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1、齐 齐 哈 尔 大 学毕 业 设 计（论 文）题 目 黑龙江省大豆主栽品种对四种腐霉菌的抗性分析学 院 生命科学与农林学院 专业班级 生物技术063 学生姓名 车广重 指导教师 成 绩 2010 年 6 月 20 日摘要大豆根腐病是一种分布较广，危害极其严重的世界性病害，是影响大豆生产的破坏性病害之一。大豆感染根腐病后，引起地上部分叶片逐渐变黄，感病植株矮化，结荚少；地下部侧根的根尖先受到侵染，继而主根下半部出现褐色条斑，表皮及皮层变黑，严重时主根下半部分全部腐烂，造成植株死亡，直接影响大豆产量。国内主要分布在东北和黄淮地区，传播方式为土传，一般减产10%-30%，重病地区可以减产60%，甚至
2、绝产。近年来随着大豆栽培面积的不断增加，大豆重迎茬状况日益加剧，导致大豆根腐病的危害逐年加重，对大豆产量和品质的影响越来越大。对黑龙江省20份大豆品种进行抗P.irregulare（畸雌腐霉）、P.sylvaticum（异宗配合腐霉种）、P.ultimum（终极腐霉）、P.aphanidermatum（瓜果腐霉）四种腐霉菌的鉴定，发现具有较丰富的抗病资源。不同大豆品种对不同腐霉菌的抗性存在着明显的差异。其中综合抗病性最高的品种为：腐-17、腐-4、腐-7；综合感病最高的为：腐-15、腐-9。关键词：大豆；腐霉菌；根腐病；抗性AbstractSoybean root rot is a kind
3、of worldwide serious disease, one of the destructive diseases, affecting soybean production. After infected by soybean root rot pathogen, the leaves gradually turned yellow, susceptible plants dwarfed, pods reduced, the tips of lateral root of the under-ground part were infected firstly and then bro
4、wn stripe fleck appeared on the underside of taproot, the darkening at the epidermis and cortex, the under part of taproot entirely rot, and the whole plant death gradually, directly affected on the soybean yield. The disease mainly distributed in the Northeast and the Huang-Huai region in China. So
5、il-borne is an important mode of transmission of the disease. The disease can lead to reduce ten to thirty percent of soybean production in generally, sixty percent in serious illness region, even total destruction. In recent years, with increasing the status of soybean continuous cropping, root rot
6、 become more and more serious, seriously affecting the yield and the quality of soybean.Carries on anti-P.irregulare, P.sylvaticum, P.ultimum, the P.aphanidermatum 4 kind of spoiled molds appraisals to the Heilongjiang Province 20 soybean varieties, discovered that has the rich disease-resistant res
7、ources. The different soybean variety has the obvious difference to the different spoiled molds resistance. And the synthesis disease resistance highest variety is rotten-17, rotten-4, rotten-7; the comprehensive susceptibility is highest is rotten-15, rotten-9.Key words: Soybean; Pyhtium; Root Rot;
8、 resistance目录摘要 Abstract 第1章 绪论11.1 国内外大豆及大豆根腐病研究进展概况11.1.1 国内大豆育种研究进展11.1.2 国内外大豆根腐病研究进展11.2 国内外腐霉研究进展概况21.2.1 国外腐霉研究进展21.2.2 国内腐霉病害种类21.3 研究意义4第2章 材料与方法52.1 供试材料与试剂配制52.1.1 供试材料52.1.1.1 大豆52.1.1.2 腐霉菌52.1.2 实验药品72.1.3 实验用品72.1.4 实验仪器72.1.5 试剂配制82.2 实验方法：种子腐烂法8第3章 结果与分析93.1 综合抗、感病 93.2 对单一腐霉菌的抗、感病性
9、133.3 同一大豆品种对四种腐霉菌存在差异性较大的高抗性及高感性19结论 29参考文献 30致谢 32第1章 绪论1.1 国内外大豆及大豆根腐病研究进展概况1.1.1 国内大豆育种研究进展大豆属于被子植物豆目，原产我国，中国古称菽，是一种富含多种蛋白质的豆科植物。我国自古栽培，至今已有5000年的种植史。现在全国普遍种植，在东北、华北、陕、川及长江下游地区均有出产，以长江流域及西南栽培较多，以东北大豆质量最优。世界各国栽培的大豆都起源于中国。由于其营养价值高，是数百种天然食物中最受营养学家推崇的食品。大豆不仅具有丰富的营养，而且具有增强机体免疫功能、防止血管硬化、降糖、降脂等防病保健的作用。
10、大豆不仅是人类重要的油料作物和粮食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要来源。中国是大豆的起源地，也是世界上主要的大豆生产国之一，目前我国大豆产量居世界第四1。我国大豆育种的主攻方向是高产育种，同时还要注意稳产性育种，突出产量，重视品质，强调抗性，特别是防御毁灭性病害的蔓延。在抗性育种方面，选育综合丰产性状好，适应性广的大豆抗性品种和优秀抗性种质材料。在抗主要病害上向抗多小种(株系)的稳定抗性发展，同时向兼抗一、二种病害和多种病害发展。所以，在抗病育种过程中，应始终注意对抗病育种材料农艺性状、生物学性状及品质、外观、商品价值等要求，这也是目前抗病育种工作的难度所在。但是，只要不断地扩大和充实抗
11、源，注意抗源农艺性状的改良和提高，合理地组配杂交亲本，并提高对后代的鉴定、筛选技术，是可以选育出高产、优质和抗病的品种的。1.1.2 国内外大豆根腐病研究进展在世界范围内危害大豆的病原菌有100多种，有35种能引起不同程度的经济损失。大豆根腐病是大豆生产中最严重的病害之一，它是一种分布较广、危害较重、病原物种类多、防治困难的世界性病害。在国内外大豆产区均有发生，是一种对大豆苗期危害较重的常发性病害，它于1955年由Suhovecky等人在美国俄亥俄州第一次报导，此后在日本、埃及、加拿大、俄罗斯、前苏联及我国等都相继报导了根腐病的发生2。此病的主要特点是分布广泛，国内主要分布在东北大豆产区和黄淮
12、地区，传播方式为土传，危害较重，韩庆新和辛惠普报道大豆根腐病在黑龙江垦区发病率达75%-90%，减产10%-20%左右3，重病地区可以减产60%，甚至绝产；病原菌种类较多防治困难。当环境条件有利该病时，可导致大豆大幅度减产或绝产。近年来随着大豆栽培面积的不断增加，大豆种子的繁殖、调运和推广，大豆迎茬状况日益加剧，使大豆根腐病的为害逐年加重，至今，大豆根腐病已遍及我国的大部分大豆产区4，对大豆产量的影响也越来越大。黑龙江省大豆生产区大豆根腐病的主要病原菌为腐霉菌(Pythium spp)、镰刀菌(Fusarium spp)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)三大类真菌。5不同的病
13、原菌引起大豆根腐病的症状也不相同，其中腐霉菌能引起根部呈现褐色的湿腐病斑，病斑呈椭圆型，略凹陷，茎基部常呈水渍状，细缩变软，迅速猝倒死亡6。1.2 国内外腐霉研究进展概况1.2.1 国外腐霉研究进展在真菌学研究中，腐霉(Pythium)是藻物界(Chromista)卵菌纲(Oomycetes)中一个相当重要的大属7，遍布全世界，已被广泛承认的有120多种8。它既可腐生、寄生或兼性寄生，又可水生、陆生或水陆两栖生。多数腐霉在各种土壤和水生环境中营腐生生活，有些是重要的植物病原菌9；有些腐霉不仅对植物没有致病作用，还能诱导植物产生系统抗性10；有些则是动物的病原菌和昆虫的寄生菌11；还有一种腐霉P
14、ythiuminsidosum Cock是哺乳动物的病原菌，能引起人类疾病12。另外，有些腐霉还能合成维生素，有些可分泌果胶酶、纤维素酶等，还有些能转化w族化合物，对医药制造业具有重要的作用。腐霉是典型的土壤习居菌，主要以卵孢子或菌丝体在土壤及遗落在土中的病残体上存活越冬，带菌的植物残体、病土和病肥成为初侵染来源。病菌在田间借助灌溉水和雨水溅射而传播，以游动孢子作为初侵与再侵接种体侵染致病。通常日夜温差大（白天地温在1821，夜晚地温在1516，最易发病）及多雨的天气（田间持水量在80%以上）有利于发病。植地低洼积水，土壤过湿、土质粘重的地块发病重13。由于腐霉的寄主十分广泛，近几十年来，它已
15、经成为很多农作物苗期病害的重要致病病原菌之一。国外关于腐霉引起农作物病害的报道很多，例如E.N.Rosskop等人研究发现腐霉能引起Polygonum odoratum（廖属）的根腐病，经鉴定是Pythium helicoides 所引起的14；Bernard Paul报道在法国北部的里尔种植小麦区域发现腐霉的新种Pythium bifurcatum 并且发现它对Botrytis cinerea有拮抗作用15。这些研究不仅使人们更深入的认识了解腐霉，而且为今后研究腐霉、防治腐霉病害奠定了坚实的基础。1.2.2 国内腐霉病害种类各种植物腐霉病害有以下特点：由单一病原腐霉引起的病害有：番茄腐霉茎基
16、腐病（江苏）、条斑紫菜赤腐病（江浙一带沿海地区）、莲藕腐败病（陕西）、新宝剑凤梨根茎腐病（广东）、粉菠萝腐霉叶基茎基腐病（广东）、白术根茎腐烂病（湖南）、木瓜茎腐病（海南）、一品红根腐病（上海）、辣椒碎倒病（云南、广西）、水稻和棉花碎倒病（浙江）等10种。几种腐霉共同引起的病害有：番茄苗期碎倒病（浙江）、大麦小麦根腐病（浙江）、玉米茎腐病（北京、浙江、新疆）、烟草根茎病害（碎倒病、立枯病、根腐病和茎腐病）（云南）、草坪草腐霉枯萎病（北京、南京 、甘肃）及大豆碎倒病（浙江）等几种，其中，在云南的烟草根茎病害调查中发现在水肥条件好的烟区，烟草的根际土壤中腐霉的出现频率高，种类多。腐霉与其他病原菌复
17、合侵染，而且腐霉是主要致病菌的病害：茶根腐性苗枯病（广西）、番茄茎腐病（山东）、柑橘根腐病（四川）、火鹤花根腐病（海南）、甜菜根腐病（新疆）、玉米茎腐病（辽宁、黑龙江、山西、吉林、山东）等6种。在对广西的茶根腐性苗枯病病原菌进行调查时，赖传雅等（1998）在余次的分离过程中发现60%以上的病苗都同时分离出刺腐霉和腐皮镰孢两种病菌，因而推测该病在苗圃是以复合侵染为主。从山东发生的番茄茎腐病病株上还可分离到丝核菌、镰刀菌以及链格孢菌等真菌，但是只有腐霉菌对番茄植株有很强的致病性，其它分离物均不致病。四川柑橘产区内柑橘根腐病病原菌有腐皮镰孢、寄生疫霉、柑橘褐腐疫霉、德巴利腐霉、腐霉-1、棕榈疫霉、逸
18、见腐霉、齿孢腐霉、腐霉-2、尖镰孢、立枯丝核菌和甘薯基腐小菌核菌。其中前5种为主要种群，其余7种为次要种群。关于火鹤花根腐病，据报道，该病的病原为疫霉菌、腐霉菌和镰刀菌，在海南对该病的研究除分离出华丽腐霉外，还分离出腐皮镰孢，前者致病力强于后者。初步查明，新疆甜菜根腐病的病原种群，以镰刀菌、丝核菌和腐霉菌为主。既可单独由一种腐霉侵染又可由腐霉与其他病原菌复合侵染引起的病害有：杜鹃茎腐病（江苏），该病可由昆明腐霉和柑橘褐腐疫霉单独侵染或者两者复合侵染所致。未鉴定出腐霉种的病害有：腐霉起致病作用的棉苗烂根病（新疆）、柠檬流胶病（重庆、四川）、豌豆丝囊根腐病（甘肃）、观叶花烛碎倒病（广东）、草坪草腐
19、霉枯萎病（贵州、重庆、山西、湖北、天津、海南）等5种。柠檬流胶病（重庆、四川）的致病因子很复杂，腐霉是主要的病原真菌之一，还有其他致病因子参与，且受地理环境和气候因素的影响很大，但从病株上分离到的腐霉并未鉴定到种。王晓鸣等（1994）报道我国玉米茎腐病由棘腐霉、瓜果腐霉、强雄腐霉、禾生腐霉、肿囊腐霉、寡雄腐霉等6种腐霉引起，其中肿囊腐霉出现频率高，分布广泛。余永年（1998）记载腐霉56种，王家和（1997）在云南的烤烟上分离到德巴利腐霉，马家海（1996）对江浙一带海区的条斑紫菜赤腐病病原研究中鉴定出紫菜腐霉17，袁高庆和赖传雅（2003年）报道镰雄腐霉（Pythium falciforme
20、）和南宁腐霉（P.naningense）两个新种18,19以及苏晓庆（2006）报道贵阳腐霉，楼兵干和张炳欣（2004）分离到国内新记录腐霉种Pythium sylvaticum，迄今为止，我国共报道了62种腐霉，其中能侵染植物的占有40种。每一地区的腐霉种类和优势种可能与当地的土壤、水分状况及农作物种类、农业生产水平有关。由于这些条件的不同，全国各地的植物病原腐霉种类也有很大差异。国内植物病原腐霉的种类，青海、安徽、澳门和香港省区尚未有报道。蒋继志（1992）报道瓜果腐霉是宁夏黄瓜、茄子、辣椒等苗期的主要病原，刺腐霉是番茄、白菜等的主要病原。王宽仓和马国忠（1992）的调查结果显示终极腐霉是
21、宁夏农作物猝倒病或根腐病的主要病原菌，终极腐霉对茄果类的番茄、茄子、辣椒，十字花科的甘蓝和小油菜以及豆科的菜豆、豌豆致病性最强，瓜果腐霉对种瓜类和芹菜致病性最强。有报道说腐霉能引起俄亥俄州地区的大豆和玉米的根腐病和猝倒病20；目前，腐霉在大豆上的危害症状主要分为3 类：（1）侵染幼苗引起的猝倒；（2）侵染根和茎部引起根部及其根茎基部腐烂；（3）成株期危害。目前，已知可侵染大豆植株并且造成严重危害的腐霉主要有瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、终极腐霉(Pythium ultimum)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)等。1.3 研究意义当今，中国大力促进可
22、持续发展农业，大豆的种植面积不断增加，经调查，腐霉已从过去的次要病原菌上升为危害蔬菜的主要病原菌。因此，将成为今后研究大豆病害的重要方面。黑龙江省是我国大豆重要产区，大豆种植面积约260万hm2。近年来，我省有关大豆根腐病的发生已有数篇报道，该病已对这一地区的大豆生产构成潜在威胁21，22，23，如何有效控制其为害，将是大豆生产面临的重大问题之一。国外对于大豆根腐病的防治策略有:利用抗病品种、栽培措施、化学防治、生物防治、综合防治等措施。其中培育抗病品种是保障大豆高产优质、减免病害损失最为经济有效的措施。抗病品种可完全控制病害，并且抗性基因易于转育。美国、澳大利亚等国防治该病的主要途径也是通过
23、抗病品种的应用。目前我国对于该病的抗病育种工作还未见任何报道，因此对于抗腐霉根腐病材料的筛选是首要的工作，抗源筛选是育种工作的基础，筛选抗源为抗病育种提供亲本材料并为形成鉴定寄主提供理论依据。有了明显、稳定的抗感材料，就可以为进行抗感间比较和抗性机理研究提供试材。因此，本研究对黑龙省主栽大豆品种进行抗性鉴定，筛选对大豆腐霉菌的优良抗源，希望通过筛选获得高抗、多抗的大豆资源，为大豆抗病新基因的发掘与利用奠定基础，对大豆品种选育具有重要的意义，进而推进我国抗病育种的进程。第2章 材料与方法2.1 供试材料与试剂配制2.1.1 供试材料2.1.1.1 大豆由黑龙江省农科院大豆研究所育种二室提供的20
24、份黑龙江省主栽大豆品种样种。2.1.1.2 腐霉菌 由黑龙江省农业科学院大豆研究所育种二室提供的四种腐霉菌：P.aphanidermatum（瓜果腐霉）、P.irregulare（畸雌腐霉）、P.sylvaticum（异宗配合腐霉种）、P.ultimum（终极腐霉）。（1）P.aphanidermatum（瓜果腐霉） 菌落在CMA上无特殊形状；在PCA上也无特殊形状，产生絮状气生菌丝；具松散的气生菌丝。菌丝宽3.1-9.5m。孢子囊由菌丝状膨大、不规则分枝和裂片状的复合体组成。20-30下均能形成游动孢子，静止孢直径9.3-13.6m，平均10.8m。藏卵器光滑，球形，直径为23.8-31.3
25、m，平均28.3m，顶生，偶间生。雄器多间生，有时顶生，桶状、曲颈状、袋状或近球状，大小为10-16.38.5-16.6m，同丝生或异丝生，以顶端与藏卵器相接触，每个藏卵器具1-2个雄器，多数为1个，卵孢子光滑，球形，直径19.2-24.5m，平均20.6m，不满器。菌丝生长的最低、最适和最高温度分别为10、35和45，25条件下，菌丝在CMA上日生长速度为35mm，最适温度下在CMA上日生长速度为48mm。分离瓜果腐霉P.aphanidermatum最好在38，在20时很少分离到。P.aphanidermatum与P.butleri二者非常相似，区别是后者的孢子囊、游动孢子、藏卵器和卵孢子均
26、比前者大，Plaats-Niterink(1981)认为二者无区别，把P.butleri作为P.aphanidermatum的异名，Krywienczyk et al.(1980)的血清学实验和Wang & White(1997)的RFLP分析都证明二者无差异。P.aphanidermatum、P.deliense和P.indigoferae这三种腐霉均具有菌丝状膨大的孢子囊、间生的雄器和不满器的卵孢子，但后二种腐霉以藏卵器柄明显弯向雄器、卵孢子较小而区别于P.aphanidermatum。（2）P.irregulare（畸雌腐霉） 菌落在CMA和PCA上均无特殊形状，但都产生絮状气生菌丝。菌
27、丝宽20.60m，孢子囊球形，柠檬形，直径15.0-35.0m，平均22.5m，顶生或间生，室温下未见产生游动孢子。藏卵器球形、亚球形至不规则形，直径15.0-25.6m，平均18.5m，顶生或间生，壁通常光滑，偶具l-8个，多为1-3个乳头状、指状或钝锥状突起，长短不等，刺长2.5-10.5m，平均6.8m。每个藏卵器具1-2个雄器，多数同丝生具柄，偶见无柄或雄器下位，少数异丝生，雄器呈弯曲的棍棒状或镰刀状，以顶端与藏卵器相接触。卵孢子球形，不满器或近乎满器，直径12.8-17.6m，平均15.8m。菌丝生长的最低、最适、最高温度分别为5、30、40。最适温度下CMA上的日生长速度为32mm
28、。P.irregulare Buisman和P.ultimum Trow较为相似，两者的区别在于前者藏卵器壁上具O-8个指状突起，且雄器多数具柄，后者藏卵器壁是光滑的，雄器无柄紧挨藏卵器。P.irregulare与P.kunmingense Yu也较相似，区别是前者卵孢子多不满器、有下位生雄器，而后者则相反。本种最大的特征是藏卵器形状不规则，大小悬殊，有时壁上具各种突起物，突起物的数量在不同的分离物之间差异较大。尽管藏卵器上具突起物的特征是个不稳定的性状，常因环境条件不同而发生变化：如温度高于33时，具有突起物的藏卵器数目随之减少；而水培比固体培养基能形成更多具突起物的藏卵器。但Matsumo
29、to et al.(2000)基于ITS-RFLP、RAPD和ITS序列研究分析了48株来自不同寄主和地理位置的P.irregulare，结果是这48株分离物被分成、组，分组主要与藏卵器壁上的突起物的数量有关。、组的藏卵器上的突起物数量显著多于、组，、组只是偶而产生一个突起物。Matsumoto et al.(2000)认为、组与、组可能是二个种或者说在P.irregulare种内存在亚种。（3）P.sylvaticum（异宗配合腐霉种） 从发生猝倒的水稻苗中分离到菌株RHS4、棉花苗中分离到菌株CXS4、大豆苗中分离到菌株BXS9和BXS18，这4株腐霉菌单株培养时不形成有性器官，经两两对峙
30、培养后，观察到菌株BXS18分别与菌株RHS4、CXS4、BXS9形成白色交界线，在交界处菌株BXS18产生雄器，为雄性菌株，其余三株产生藏卵器，为雌性菌株，产生雄器的菌株其菌丝体向产生藏卵器菌株方向生长。菌落在CMA上产生絮状气生菌丝，在PCA上无絮状气生菌丝，菌落呈放射状。主菌丝宽10.5m，附着胞棒状或镰刀状，菌丝膨大体(孢子囊)球形、亚球形或柠檬形，顶生或间生图，球形菌丝膨大体直径14-25.3m，多为16.5-21.7，平均18.9m，亚球形或柠檬形菌丝膨大体大小为16.520.8-20.625.6m，平均为18.323.5m，不产生游动孢子，藏卵器光滑，多数间生，直径17.2-27
31、.2微米，平均22.3m，每个藏卵器上1-3个雄器，多数为2个，异丝生，雄器常在接近藏卵器处形成二叉状分枝，授精后雄器很快消失，卵孢子不满器，直径13.2-19.8m，平均16.5m，卵孢子壁1.5-2.5m。P.sylvaticum以菌丝膨大体(孢子囊)球形或柠檬形、藏卵器光滑、雄器异丝生、雄器常在接近藏卵器处形成二叉状分枝、卵孢子不满器为主要形态学特征。菌株的形态特征与Campbell & Hnedrix(1967)对该种的首次报道和Plaats-Niterink(1981)在其腐霉专著中对该种的描述基本一致，差别主要在于菌丝膨大体的大小。菌株的菌丝膨大体，因培养基和培养温度不同，球形直径
32、与Plaats-Niterink (1981)在其腐霉专著中有差异。关于每个藏卵器上的雄器数，Campbell & Hnedrix(1967)观察到该种每个藏卵器上有雄器1-3个，在Plaats-Niterink(1981)的腐霉专著中，该种每个藏卵器上有雄器2-4个，结果与Campbell & Hendrix(1967)一致。（4）P.ultimum（终极腐霉） 菌落在CMA上无特殊形状，在PCA上呈放射状，絮状气生菌丝发达。菌丝宽5.0-8.0m，平均6.5m。孢子囊球形、亚球形，直径10.0-25.0m，平均19.5m，顶生或间生。藏卵器球形、平滑，多顶生，较少间生，罕切生，直径13-3
33、0m，平均23m，每个藏卵器上具1-2个雄器，多数1个，典型同丝生，无柄紧挨藏卵器，少数异丝生有柄，罕见雄器下位和同丝生有柄。雄器细胞棒状、袋状。卵孢子球形，不满器，直径11.5-21.0m，平均19.4m。菌丝生长的最低、最适和最高温度分别为5、25和40。25条件下，菌丝在CMA上的日生长速度为32mm。分离P.ultimum最好在20或以下。P.ultimum Trow与P.debaryanum Hesse二者较接近，Plaats-Niterink认为后者是前者的同种异名，这二者的区别在于前者雄器同丝生时无柄紧挨藏卵器，后者雄器同丝生时典型有柄距藏卵器有一定距离。Drechsler主要根
34、据在室温下能形成游动孢子这一性状建立变种P.ultimum var.sporangiiferum，Plaats-Niterink(1981)因而将原来的P.ultimum Trow降为变种P.ultimum var.ultimum.Adaskaveg et al.(1988)与马国忠和余永年(1991)的蛋白质电泳图谱试验均表明：终极腐霉原变种P.ultimum Trow var. ultimum与终极腐霉产孢子囊变种P.ultimum Trow var.sporangiiferum Drechsler二者之间无区别。Francis & St.clair(1993)观察到仅形成菌丝膨大体的“H
35、S”组腐霉(P.ultimum group HS)菌株单独培养时不能完成有性阶段，与终极腐霉P.ultimum菌株对峙培养时，形成卵孢子，说明“HS”组腐霉是终极腐霉的无性繁殖体。Francis et al.(1994)的RFLP试验分析表明上述三种终极腐霉的RFLP图谱也十分相似。242.1.2 实验药品蒸馏水、Agar、V8原汁、CaCO3、玉米粉琼脂、酒精、NaClO32.1.3 实验用品一次性塑料平皿、接种环、半径6mm打孔器、镊子、锡纸、封口膜、纱布、量筒、1l锥形瓶、500ml烧杯、黑布2.1.4 实验仪器超净工作台（日本SANOY MCV-131-BNF(T) ）、生化培养箱（哈
36、尔滨市东明医疗仪器厂 HP-250）、数码相机（日本SONY DSC-H50）2.1.5 试剂配制WA培养基：10gAgar+500ml蒸馏水V8培养基：85mlV8原汁+10gAgar+0.3gCaCO3+415ml蒸馏水CMA培养基：11g玉米粉琼脂+500ml蒸馏水2.2 实验方法：种子腐烂法从培养腐霉菌的V8培养基上取一个5mm2的小块，放在一个直径9cm的包含20ml WA培养基的平皿中心。3d后，将10粒大豆种子均匀的放在距离边缘2cm左右的位置。所有大豆种子都用10% NaClO3进行表面消毒1min，然后去离子水中浸泡12h。然后将平皿放置于培养箱（20）中，7d后记录每平皿中
37、腐烂的种子数。在这个实验中，分离群体造成的种子腐烂的百分数在30%，31%到69%，或70%，被分别称之为抗病类型、中间类型和感病类型。第3章 结果与分析3.1 综合抗、感病图3-1为20份大豆品种对四种腐霉菌的死亡率百分比柱形图，综合抗病排序前8位的大豆品种是：腐-17腐-4腐-7腐-3腐-11腐-2腐-8腐-19；综合感病最高大豆品种为：腐-15、腐-9。由大豆抗病性可间接得知，四种腐霉菌综合致病性也有所不同，致病性最强的为P.aphanidermatum（瓜果腐霉），致病性最弱的为P.sylvaticum（异宗配合腐霉种）。图3-1 20份大豆品种对四种腐霉菌的死亡率百分比柱形图表3-1
38、结果显示：供试材料中P.a抗病类型品种为6份，占实验材料的30%，中间类型品种为8份，占实验材料的40%，感病类型品种为6分，占实验材料的30%。供试材料中P.i抗病类型品种为3份，占实验材料的15%，中间类型品种为11份，占实验材料的55%，感病类型品种为6份，占实验材料的30%。供试材料中P.s抗病类型品种为15份，占实验材料的75%，中间类型品种为5份，占实验材料的25%，感病类型品种为0份，占实验材料的0%。供试材料中P.u抗病类型品种为13份，占实验材料的65%，中间类型品种为5份，占实验材料的25%，感病类型品种为2份，占实验材料的10%。表3-1 20份大豆品种抗病类型中间类型感
39、病类型列表抗病类型中间类型感病类型P.a腐-2、3、4、5、7、8腐-1、6、10、11、13、14、17、19腐-9、12、15、16、20、21P.i腐-11、17、19腐-1、2、3、4、7、8、12、13、14、16、21腐-5、6、9、10、15、20P.s腐-1、2、3、4、5、7、8、11、12、13、14、17、19、20、21腐-6、9、10、15、16无P.u腐-1、2、3、4、7、8、10、11、16、17、19、20、21腐-5、6、12、13、14腐-9、15图3-2为综合高抗腐-17在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-3为综合高感腐-15
40、在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-2腐-17对四种腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-3 腐-15对四种腐霉菌抗性与CK照片对比图3.2 对单一腐霉菌的抗、感病性图3-4为20份大豆品种对P.a腐霉菌的死亡率百分比柱形图，对P.a腐霉菌抗病性最高的大豆品种为腐-4；对P.a腐霉菌感病性最高的大豆品种为腐-15。图3-4 20份大豆品种最P.a腐霉菌的死亡率百分比柱形图图3-5为对P.a腐霉菌抗病性最高的腐-4在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-5 腐-4对P.a腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-6为对P.a腐霉菌感病性最高的腐-15在群体分离
41、中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-6 腐-15对P.a腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-7为20份大豆品种对P.i腐霉菌的死亡率百分比柱形图，对P.i腐霉菌抗病性最高的大豆品种为腐-17；对P.i腐霉菌感病性最高的大豆品种为腐-15。图3-7 20份大豆品种最P.i腐霉菌的死亡率百分比柱形图图3-8为对P.i腐霉菌抗病性最高的腐-17在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-8 腐-17对P.i腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-9为对P.i腐霉菌感病性最高的腐-15在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-9 腐-15对P.i腐霉菌抗
42、性与CK照片对比图图3-10为20份大豆品种对P.s腐霉菌的死亡率百分比柱形图，对P.s腐霉菌抗病性最高的大豆品种为腐-17；对P.s腐霉菌感病性最高的大豆品种为腐-9。图3-10 20份大豆品种最P.s腐霉菌的死亡率百分比柱形图图3-11为对P.s腐霉菌抗病性最高的腐-17在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-11 腐-17对P.s腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-12为对P.s腐霉菌感病性最高的腐-9在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-12 腐-9对P.s腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-13为20份大豆品种对P.u腐霉菌的死亡率百分比柱形
43、图，对P.u腐霉菌抗病性最高的大豆品种为腐-17；对P.u腐霉菌感病性最高的大豆品种为腐-15。图3-13 20份大豆品种最P.u腐霉菌的死亡率百分比柱形图图3-14为对P.u腐霉菌抗病性最高的腐-17在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-14 腐-17对P.u腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-15为对P.u腐霉菌感病性最高的腐-15在群体分离中对四种腐霉菌死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-15 腐-15对P.u腐霉菌抗性与CK照片对比图3.3 同一大豆品种对四种腐霉菌存在差异性较大的高抗性及高感性图3-16为腐-5对四种腐霉菌死亡率百分比柱形图，由图可知腐-5对
44、P.a 腐霉菌和P.s腐霉菌有较高抗病性，对P.a腐霉菌的死亡率为25.00%，对P.s腐霉菌的死亡率为30.00%。对P.i腐霉菌有较高的感病性，对P.i腐霉菌的死亡率为77.50%。最高抗与最高感死亡率相差52.50%。图3-16 腐-5对四种腐霉菌死亡率百分比柱形图图3-17至图3-19为腐-5对P.a、P.s、P.i腐霉菌在群体分离中死亡率最高的平皿与CK照片对比图。图3-17 腐-5对P.a腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-18 腐-5对P.s腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-19 腐-5对P.i腐霉菌抗性与CK照片对比图图3-20为腐-10对四种腐霉菌死亡率百分比柱形图，由图可知腐-10对P.u 腐霉菌有较高
