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1、华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文摘要氮是植物必需的一种大量元素，而硝酸盐作为植物根系吸收无机氮的主要来源之一，其吸收的信号调控则是植物氮素营养研究的热点问题。小麦是最重要的粮食作物之一，提高其氮的利用率对于增加粮食产量、减少化肥浪费和保护环境均具有重要意义。为识别调控小麦根系吸收硝酸盐的信号分子（包括正向前馈和负反馈信号分子），本研究采取了一种非侵害性的新技术用于测定硝酸盐净吸收量的变化。该技术是以正常生长的完整植株为实验材料，同时使测量具有实时监测性，为正确识别信号分子提供了可能。为识别调控硝酸盐吸收的正向前馈信号分子，本文研究了光照和碳水化合物对硝酸盐净吸收量影响的实时变化。
2、对于很多物种而言，地上部接受光照可以增加根系对硝酸盐的吸收，其机理可能是通过一种从韧皮部运输到根部的信号分子起作用的，这个信号分子最可能是一种糖。为识别该信号分子，我们比较了各种碳水化合物对小麦根系硝酸盐净吸收量影响的差异性，预期作为信号分子的糖，对硝酸盐净吸收量的影响应该比其他糖更迅速、更大。在分别添加 10 种碳水化合物（9 种糖以及甘露醇）后，发现只有蔗糖可以迅速引起硝酸盐净吸收量的增加，且比其他糖的作用更大，满足识别根部信号分子的标准。葡萄糖、果糖和棉子糖在经过一段或长或短的时滞后，可以引起较小的反应，L-和 D-阿拉伯糖、半乳糖、乳糖和甘露醇几乎没有影响，而甘露糖由于独特的生化特性，
3、引起了硝酸盐净吸收量的减小。为进一步弄清楚光照和蔗糖对硝酸盐吸收量的影响是否是通过同一机制作用的，本文又研究了光照和蔗糖的叠加作用。结果表明，在光照条件下添加外源蔗糖，硝酸盐净吸收量增加的比例比在黑暗条件下要小，暗示了光照与添加外源蔗糖对硝酸盐吸收的影响具有叠加相应，表明两者是通过同一个信号分子发生作用的，这个信号子最可能是根部细胞质中的蔗糖。从结果可知，蔗糖具有调控根吸收硝酸盐的信号分子的特征，而光照和添加外源蔗糖之间的相互作用为这一猜测提供了证据，表明给植株光照是通过韧皮部运输到根部的蔗糖来影响硝酸盐的吸收。本研究首次直接证明了蔗糖作为一种从光合作用到硝酸盐吸收的正向前馈信号分子起作用。事
4、实上，这I华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文种前馈信号分子还需要和其他类型的信号分子（主要是负反馈信号分子）相互作用从而克服环境的干扰。为识别调控硝酸盐吸收的负反馈信号分子，我们筛选并研究了 13 种氨基酸对小麦硝酸盐净吸收量影响的实时变化。结果表明，添加谷氨酸后，硝酸盐的吸收经过10 min 的时滞后就迅速减小甚至变为负值；添加天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸和赖氨酸后，硝酸盐吸收经过 0.5-1.5 h 的时滞后才开始减少；其他氨基酸的影响很小或甚至没有影响。由此可以推测谷氨酸最可能作为负反馈信号分子起作用，原因在于添加谷氨酸后，硝酸盐吸收量的变化速度最快且变化量较
5、大。谷氨酸作为一种负反馈调控，与蔗糖相比对硝酸盐吸收的影响较小，在植物体内协助蔗糖这种正向前馈信号分子从而共同调控小麦根系对硝酸盐的吸收。关键词：普通小麦; 硝酸盐吸收; 信号分子; 正向前馈; 负反馈; 非侵害性新技术; 蔗糖; 谷氨酸II华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文AbstractNitrogen is needed in large quantity by plants and nitrate, as one major form of N,was absorbed by plant roots. Therefore, nitrate uptake and its co
6、ntrolling signals haveattracted more and more attention so far. Wheat (Triticum aestivum) is one of the mostimportant food crops in the world, improving its efficiency of nitrate uptake is importantto increase yield, decrease the waste of fertilizer and protect the environment. Identifyingsignals, i
7、ncluding feed-forward and feedback signals controlling nitrate uptake by wheatroots, have been investigated. A new non-invasive technique has been used, by whichintact plants grow at the normal rate during the experiments.To identify feed-forward signal(s) controlling nitrate uptake, the effects of
8、light andcarbohydrates on time course of net nitrate influx have been studied. Illuminating theshoot stimulated nitrate uptake by the roots in many species, including wheat, as we reporthere. The mechanism is thought to be via a signal transported in the phloem, probably as akind of sugar. Sugars su
9、pplied directly to the root system also stimulate nitrate uptake,which is generally viewed as an expression of the same signalling process. Our aim is todetermine whether sucrose is a specific signalling molecule, and whether the light effectoccurs via sucrose. To identify a signalling molecule we h
10、ave compared the response ofnet nitrate influx to the supply of several sugars to the root system. A signal sugar shouldcause a rapid, large stimulus of net nitrate influx; other sugars acting indirectly shouldhave a smaller effect after a lag. A method of measuring net nitrate influx with a timeres
11、olution of minutes has enabled us to make this comparison. Amongst nine differentsugars and mannitol, sucrose alone caused an immediate, large stimulation of net nitrateinflux. Glucose, fructose and raffinose caused smaller responses with a lag. Other sugarsand mannitol had no effect (except mannose
12、 which has an effect related to itsbiochemistry). When the plant was in the light, the stimulation by external sucrose wasless than in the dark, indicating that light affects nitrate uptake co-operatively withexternally supplied sucrose. Sucrose showed the features of a specific molecule signallingI
13、II华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文to nitrate uptake by the root system. This has long been supposed but not previouslysupported experimentally. The interaction between light and externally supplied sucroseshowed that the mechanism of the light effect on nitrate uptake involved sucrose. Sucroseacts as a posit
14、ive feed forward signal, which must interact with other types of signal toovercome environmental perturbations.To seek the feedback signal(s) controlling nitrate uptake, the effects of thirteen aminoacids on time course of net nitrate influx have been studied. The results showed thatglutamate caused
15、 rapid a rapid and large decrease of net nitrate influx. Aspartic acid,asparagine, glutamine, arginine, serine and lysine caused a relatively slow decrease of netnitrate influx with a lag of 0.5-1.5 h. Other amino acids had a very small effect or even noeffect. It is speculated that glutamate is mos
16、t possible to be a negative feedback signalbecause the change of net nitrate influx is bigger and faster. Glutamate as a feedbacksignal, which has a smaller effect than sucrose, collaborates with sucrose (as afeed-forward signal) and controls nitrate uptake by wheat roots.Key Words: Triticum aestivu
17、m L.; nitrate uptake; signal molecule; positive feed-forward;negative feedback; new non-invasive technique; sucrose; amino acidsIV独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本
18、学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密 ，在_年解密后适用本授权书。不保密。（请在以上方框内打“”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日1绪论1.1问题的提出与研究意义植物生长主要取决于从空气中吸收的碳和从土壤中吸收的氮（碳氮比率大约是30 : 1），因此植物的同化机制是由光合作用和 N 的摄取量共同决定的。如果光合作用受到影响（
19、如，光强或者 CO2 浓度的改变），那么氮吸收的速率则会发生改变以维持氮供应，从而满足植物生长的需要。另一方面，如果氮的吸收速率发生改变，那么经过一段时间后最终会恢复到以前的量或者光合作用的速率会发生改变，以便使二者吻合。N 是影响粮食作物生产的主要制约因素，因此在生长过程中需要施用 N 肥。但是，N 不能被有效吸收，由此造成了严重的浪费并且会对环境产生不利影响。为使作物更有效地获取 N 并将其合成蛋白质，有必要理解 N 的吸收和同化过程，尤其是如何调控硝酸盐的转运过程。Raun 和 Johnson 指出，全球谷类作物的 N 利用率大约为 33%，意味着每年氮肥损失 159 亿美元1。Tilm
20、an2也提出氮肥损失导致严重的环境问题，如温室效应和饮用水的污染。小麦是最重要的谷类作物之一，全球大约 20%的氮肥用于提高小麦产量3，故提高小麦生产中的氮利用率对于农业生产的可持续发展就显得非常重要。N 是植物必需的最重要的大量元素之一。而硝酸盐作为植物生长的一种信号，是有氧条件下土壤中最主要的无机氮形式，也是可供小麦吸收的主要氮源。对小麦如何吸收硝酸盐及其同化作用的分子机制的理解，是提高氮利用率和减少氮损失的关键一环，因而对硝酸盐代谢的研究引起了广泛的关注。在植物体内，硝酸根首先通过硝酸盐转运系统跨膜运输，然后细胞质中一定比例的硝酸根离子被硝酸盐还原酶还原为亚硝酸根，进而参与体内代谢合成各
21、种各样的氨基酸，如谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸。现有研究表明，硝酸盐的吸收是通过质子共转运系统进行的，这些转运系统的热力学和动力学系统的特征已经得到了较为清楚的诠释，而且硝酸盐转运系统的基因也已经得以分离4-5。然而，对于硝酸盐这个植物体内最重要的无机物的转运调控，目前还难以给出令人满意的答案。因此，研究硝酸盐转运调控机制不仅具有重要的生理学意义，而且对于调节作物生态、提高氮肥利用和指导合理施肥等方面都具有重要的应用价值。1华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文1.21.2.1硝酸盐吸收的背景知识硝酸盐吸收的部位加快植物的 N 吸收速率对于提高氮肥利用率有着重要的意义，但对于如何高效吸收
22、 N 的生理学机制还有待研究。一般认为，根系形态和硝酸盐吸收速率（硝酸盐转运系统活性）是决定作物吸收 N 能力的两个重要因素。另外，Scheible 等6指出根的生长率也与根部糖的含量相关，认为糖分布的变化可能是导致根茎生长发生变化的决定性因素。这说明根部的碳水化合物浓度决定根部的生长，必定会影响硝酸盐的吸收速率。根部是植物吸收矿质元素的主要器官，吸收部位以根毛区为主（图 1.1）7。吸收速率受一些外界因素的影响，如温度、土壤 pH 值、通气状况、水分状况以及溶液浓度。图 1.1 根毛区横切面示意图Fig. 1.1 Diagrammatic across section of the root
23、 hair zone2华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文1.2.2硝酸盐吸收的方式与硝酸盐转运系统植物细胞吸收矿质元素的方式有两种：第一，通过扩散作用和协助扩散（离子通道、载体）进行被动吸收；第二，通过 ATP 酶或共转运进行主动吸收。从热力学上看，硝酸根离子在植物体内不容易被吸收，而必须依赖于其代谢机制。硝酸盐通过主动运输，即载体介导的共转运系统，进入细胞7。Kabala 等8发现液泡膜上存在硝酸盐/质子的反向协同运输体系，并且认为这个反转运体中的亮氨酸残基对于硝酸盐转运进入液泡膜起着关键的作用。Zinovieva 等9指出，一种大小为 126 kDa 的转运蛋白参与硝酸盐通过质
24、膜的转运。植物离子吸收的快慢主要取决于根部离子转运系统的活性和地上部的光合作用速率的协调，但是这种协调机制在分子水平上却鲜为人知。在高等植物中，存在两种动力学不同的硝酸盐转运系统，即高亲和性转运系统（high-affinity transportsystem，HATS）和低亲和性转运系统（low-affinity transport system，LATS）4, 10。按照对硝酸盐诱导反应的不同，HATS 可进一步分为诱导型（inducible HATS，iHATS）和组成型（constitutive HATS，cHATS)。cHATS 的 Km 较低（通常为 6-20 M），而iHATS 的
25、 Km 则较高（通常为 20-100 M）。HATS 更可能是当土壤中的硝酸盐浓度很低时（250 M），对硝酸盐的吸收起作用11。通常认为，LATS 的转运能力比HATS 大，在植物中是组成型表达的，在 0.5 mM 以上显示出线性动力学的特征11-12。在很长一段时间内 LATS 被认为只有组成型的成分，然而最新的研究表明，LATS也存在组成型和诱导型，类似于拟南芥中的 iHATS 和 cHATS13-14。硝酸盐转运基因分为两大家族，即低亲和性的 NRT1 和高亲和性的 NRT2。目前，在真菌、藻类和植物中已经分离鉴定了硝酸盐转运基因，从小麦中也分离出了一些转运基因，如 TaNRT2.3
26、就是从小麦受硝酸盐诱导后的根系中分离出来的一个高亲和性的硝酸盐转运体15。Lejay 等16发现拟南芥中编码根部硝酸盐转运体的基因表达受到昼夜调节和糖供应的刺激。蔗糖、葡萄糖和果糖能够诱导离子转运基因的表达。光和蔗糖的诱导密切相关，可以认为是同一种调节机制（即，由光合产物刺激）。这种调控机制有着很重要的作用，这可以从拟南芥中 atnrt2 突变体的表型中体现出来。在该突变体中，糖诱导的硝酸盐转运体基因缺失使得根部高亲和性的硝酸盐摄入量受到光和糖的诱导后不会发生改变（但野生型的会提高）。值得注意的是，不管是在植物培养还是实验过程中，使用的营养液中的硝酸盐3华 中 科 技 大 学 博 士 学 位
27、论 文浓度都足以完全诱导硝酸盐转运蛋白（如 Goyal 和 Huffaker17）。在植物培养过程中，用 1/4 Long Ashton 营养液（含 1.5 mM 硝酸盐）提供植物生长所需的营养；待小麦幼苗长到 20-30 d 用于建立实验系统后，在预处理（至少 14 h）及随后的整个实验过程中始终使用 1/20 Long Ashton 营养液（含 0.3 mM 硝酸盐），因此可提供足够高的硝酸盐浓度。第二，鉴于诱导型和组成型的高亲和性硝酸盐转运系统的 Km值都在 20-50 M4，因此实验中使用的硝酸盐浓度足以使之饱和。另一方面，对于低亲和性转运系统而言（即使 Km 大于 1 mM），在 0
28、.3 mM 浓度的硝酸盐溶液中仅转运很少的份额。如在大麦中，低亲和性的硝酸盐转运系统的 Km 为 3.7 mM，占最大转运量的 4%，仅为在实验中测定的总硝酸盐的百分之几。因此，本研究主要关注能被充分诱导的、高亲和性的硝酸盐转运系统的生理特征。1.2.3硝酸盐吸收速率与植物相对生长速率有关硝酸盐的吸收速率取决于生长过程中对氮的需求与植物氮含量的比值。其中，植物生长过程中对氮的需求被定义为相对生长速率（relative growth rate，RGR），而净硝酸盐吸收量会随着 RGR 的增长而增加 18。硝酸盐净摄入量的最大值（maximum net influx of NO3，Imax）为 1
29、00 M 左右甚至更低，但 Imax 并不是恒定的，而是依赖于给定的变量，包括植物的年龄和 N 水平以及硝酸盐的可利用率。只要 N 的需求和新的生长之间是线性的（且根茎比保持不变），那么伴随着植物年龄的增长，Imax 就会减小，这与 RGR 密切相关。RGR 更可能反映了净 N 需求的硝酸盐吸收，具有一定的生理学意义。有证据表明，根系对硝酸盐的吸收是通过植物体内韧皮部和木质部运输的氨基酸转运库循环与地上部的需求相连。农作物的 N需求取决于其干物质的增加，通常情况下两者呈线性关系。当然，如果在农作物发育过程中干物质中 N 的临界值发生变化，或者 N 从较老的叶片再转运到分生组织时，两者就不呈线性
30、关系。光照和温度影响植物生长，因此也影响作物的 N 需求，这些关系都可以用数学模型来描述19。另外，Chen 等20研究了硝酸盐供应如何影响三种叶类蔬菜的生长速率、硝酸盐的浓度和硝酸盐还原酶的活性，从而知道了供应多少硝酸盐最为合适。1.3硝酸盐吸收调控的相关研究N 是植物需求量最大的矿质元素，而硝酸盐是主要的 N 源21，其吸收调控机制4华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文已经引起了学者的广泛关注，尤其是在提高农业生产中 N 的利用率从而尽可能减少化肥浪费和污染等方面。N 需求受到多种信号的调控，包括激素、硝酸盐、糖、有机酸和氨基酸。过去十年间，对于这些信号的本质和整合作用的研究揭示
31、了调控系统是一个复杂的网络系统22。首先，由于 N 吸收和光合作用速率相互匹配，故 N 吸收必定受到光合作用的调节，而光合作用又涉及到光照及在光照条件下合成的碳水化合物的调节。现有研究表明，植物根部对硝酸盐的吸收速度在黑暗条件下会下降而在光照条件下会上升，这符合硝酸盐吸收速率变化必须与光合作用速率的改变相一致的观点。给植物根系供给糖类（蔗糖、葡萄糖和果糖，不包括糖衍生物）后，通过韧皮部运输到根部的新合成的光合产物作为一种信号分子起作用5, 16, 23，这被称之为正向前馈控制。其次，在 N 代谢的过程中会生成各种各样的氨基酸，这些氨基酸反过来又会对N 的吸收速率产生一定的调节作用。也就是说，如
32、果光合作用和植物生长加快，根部吸收的氮很快就会被消耗掉，随后游离氨基酸和其他氮化合物的浓度就会下降，最后还原性氮化合物运输到根部的速度也会减慢。而这种还原性氮化合物的减少可以作为一种信号，增加硝酸盐的吸收和转运速率5, 23-25，这被称之为负反馈控制。理解来自环境的正调控和负调控信号的转导途径如何影响编码硝酸盐同化途径的基因表达也是非常重要的26。沟通地上部的 N 需求和根部吸收 N 快慢的信号必须是在一个整合的调控系统中。除了韧皮部的可移动性，这些信号分子必须有潜力在转录或转录后水平能够阻止或促进硝酸盐的吸收。1.3.11.3.1.1光照和碳水化合物的调节光照和黑暗的调节（不同于昼夜变化）
33、研究结果表明在已被研究的所有物种中，地上部接受光照可以增加根部对硝酸盐的吸收，但反应程度因物种、环境条件和光照强度不同而异。例如，将大麦从黑暗移到光照条件下几小时后，硝酸盐的吸收量增加了 20-40%且趋于稳定27-28；将烟草和大豆从光照转到黑暗条件下，硝酸盐吸收量减低了与之相似的程度。延长在黑暗中的时间，硝酸盐的吸收量会进一步减低29-32。在西红柿中，硝酸盐吸收量发生初级反应的时间较长，即在光照中持续增加或黑暗中持续减低的时间长达 6 h 甚至更长31。虽然已知光照可以促进硝酸盐的吸收，但还没有详细的动力学分析，因5华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文此本文致力于研究光照条件改
34、变后硝酸盐净吸收量的实时变化。真正的光暗影响（改变地上部接受的光照强度），不同于内在的昼夜变化（生物钟），虽然它也会对 N 的吸收产生一定影响（如 Ourry 等的研究33）。为了更清晰地理解两者的不同，文中系统地总结了硝酸盐吸收量变化受光暗影响和昼夜调节的研究概况（见表 1.1）。其中，对拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、西红柿（Lycopersicon esculentum）的相关研究，有些结果反映了光照影响，有些结果反映了昼夜变化，这说明植物既受光照的影响也受昼夜变化（即生物钟）的调节，因此在研究光照影响时就有必要排除昼夜变化这一影响因素
35、。对羊茅（Festucaovina）、草甸羊茅（Festuca pratensis）、棉花（Gossypium barbadense 和 Gossypiumhirsutum）、鸭茅（Dactylis glomerata）、发草（Deschampsia flexuosa）、绒毛草（Holcuslanatus）、胡桃（Juglans nigra）、黑麦草（Lolium perenne）、猫尾草（又名梯牧草，Phleum pratense）、杨树（Populus tremula）、蓖麻（Ricinus communis）、烟草（Nicotianatabacum）等的研究清晰地表明了是昼夜变化而非光暗
36、的影响。而对大麦（Hordeumvulgare）、莴苣（ Lactuca ativa）、小麦（ Triticum aestivum）和高羊茅（ Festucaarundinacea）等的相关研究表明了光照 /黑暗也存在相似的影响，如 Peuke 和Jeschke29的研究表明大麦的硝酸盐吸收量变化受光照的影响。6华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 2.1 硝酸盐的吸收受光照和生物钟的调节Table 2.1 Nitrate uptake is affected by light/Dark rather than diel responseLight effectSpeciesdis
37、tinct fromReferenceNotediel responseArabidopsis thalianaBrassica napusLolium perenneLolium multiflorumTriticum aestivumyes. fig. 8nonoCheng et al. 199234Lejay et al. 200316Lejay et al. 199935Palenchar et al. 200436Macduff and Wild 198837Dactylis glomerataDeschampsia flexuosaFestuca ovinaHolcus lanat
38、usnoScheurwater et al. 199938Festuca arundinaceayesGastal and Saugier 198939Light/CO2/humidity,showed nitrate uptakewas independent oftranspirationandrelatedtonewphotosynthesisFestuca pratensisPhleum pratensenonoMacduff et al. 199740Macduff and Bakken 200341Glycine maxyesDelhon et al. 1996a42Changei
39、nlightintensityandCO2availabilitynitrate influxchangednoDelhon et al. 1996b437华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文nonoDelhon et al. 1995a44Delhon et al. 1995b45Raper et al. 199146Rideout and Raper 199447Vessey et al. 199048Gossypium barbadenseGossypium hirsutumnoAslam et al. 2001b49Helianthus annuusHordeum vulga
40、reHordeum vulgareZea maysyesGutschick 199350Aslam et al. 197927Peuke and Jeschke 199829Rao and Rains 197651Sehtiya and Goyal 200052Juglans nigraLactuca ativaLolium multiflorumTrifolium repensLolium perennenoyesnoDelaire et al. 200553Wheeler et al. 199854Macduff and Jackson 199230Ourry et al. 199633L
41、ycopersicon esculentumyesCrdenas-Navarroetal.199831noCrdenas-Navarroetal.199955noOno et al. 200056Nicotiana tabacumOryza sativaPennisetum americanumZea maysPopulus tremulaRicinus communisnononoSthr and Mck 200157Raman et al. 199558Pearson et al. 198159Siebrecht et al. 200360Herdel et al. 200161Sorgh
42、um SudaneseHallmarkandHuffaker8华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文197862Spinacia oleraceaScaifeandSchloemer199463Triticum aestivumyesAbdellaoui et al. 200164Effluxaffectedbylight interacting withdefoliation or apexremoval.1.3.1.2no碳水化合物的调节Sivasankar and Oaks 199665translocation of C-14to the roots地上部接受光照对刺激根部硝酸盐吸收的影响被认为是受到光合作用产物（例如被运输到根韧皮部的蔗糖）的正调控作用。将外源蔗糖直接添加到根部周围的营养液时，可以刺激硝酸盐的吸收（如 Delhon 等42；Geler 等66；Rufty 等32；Stitt和 Krapp67）和硝酸盐转运基因的表达35。在根系中，糖类为硝酸盐的同化过
