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1、论大豆矮秆突变基因的SSR标记摘要：高秆大豆9103经EMS诱变处理，获得矮秆突变系9103-127。高秆和矮秆亲本的基因组DNA经SSR引物PCR扩增检测，根据电泳条带差异，筛选出差异性引物。经杂交自交后获得F3群体，进行BSA分池，组建高秆群体基因池和矮秆群体基因池，对筛选出来的差异性SSR引物进行进一步验证，获得了与大豆矮秆突变基因连锁的特异性差异引物satt452，并计算出了可能的连锁距离。关键词：大豆，矮秆，突变基因，SSR，satt452，遗传距离Abstract：With high stem soybean 9103 being induced by EMS, we got dw
2、arf stem mutant line 9103-127. The genome DNA of parental high and dwarf stem soybean was amplified by PCR with SSR primer, then select the special primers according to the results of electrophoresis. We got F3 generation after hybridization and self-crossion, carried on the separation of BSA pools,
3、 then construct the high stem gene pool and dwarf stem gene pool. Test the selected SSR primer using the gene pool and calculate the possible linkage distance.Keyword：soybean，dwarf stem，mutant gene，SSR，satt452，genetical distance.1 绪论大豆Glycine max是一种有重要经济价值的饲料和油料作物。大豆种子中蛋白质与脂肪的含量可分别达40%和20%。目前，大豆已成为一
4、种重要的国际性经济作物，在美国、巴西、阿根廷、中国和印度等国家广为种植。1.1作物矮杆性状与矮化机制研究1.1.1作物矮杆性状从广义上讲，作物的矮生性是指成熟期作物株高比正常植株缩短的遗传特性。根据株高缩短的程度，可将广义的矮秆分成半矮秆、矮秆和极矮秆3种类型。矮秆(狭义)通常指成熟时植株高度等于或低于原正常植株高度一半的矮秆突变系；半矮秆则是指株高介于矮秆和正常高度之间的类型。作物经常发生矮秆变异，但在育种实践中并非任何矮秆变异都有良好的利用价值，通常将可利用的矮秆材料称为“矮源”。矮秆品种的选育和推广是20世纪育种工作最主要的成绩之一。但是，目前国内外育种可利用的矮源十分贫乏，矮秆基因的单
5、一化所引起的潜在危险性越来越引起育种工作者的重视。1.1.2作物的矮化机制植物矮化是一种重要性状，是孟德尔建立遗传规律时所用的性状之一。研究表明植株矮化是矮秆主基因表达作用的结果，同时也受到修饰基因或抑制基因的影响。一般认为植株的矮化是由于节间长度缩短或节间数减少的结果，也可能是两者共同作用的结果。研究发现节间长度与细胞数目呈高度正相关，而与细胞长度无显著相关性，表明节间的缩短可能是细胞数目减少的结果。矮秆基因对GA3的合成有阻碍作用，且在低温条件下这种作用增强，从而导致植株矮化；也可能是由于存在矮秆基因的抑制基因，该抑制基因在低温下不表达，因此在低温条件下才表现矮化。植物矮化突变总体上是由于
6、茎不能正常伸长引起的，因此，作物矮化应该和激素之间具有密切的联系。1.2大豆矮杆突变体1.2.1突变性状研究突变在作物育种和遗传研究中具有广泛应用价值。在育种上，诱发突变已成为各种作物创造原始材科的主要方法之一。突变在大豆育种中尤为重要，由于大豆人工杂交的效率很低，获很大量杂交种很困难，因此给大豆有益特征和性状的重组带来很大局限性。在遗传上，突变主要用作标志性状。目前大豆上已经获得许多具有育种利用和遗传研究价值的突变体。大豆突变体是大豆遗传研究和培育品种的物质基础，具有优良性状的突变，如矮秆、抗性等，不仅可以作为种质资源直接用于品种的遗传改良，而且，也可为分离和克隆相关基因提供基础材料，因此突
7、变体的诱导，筛选鉴定，将是功能基因组学研究的一项重要基础。1.2.2矮秆大豆的特征特性（1）株型紧凑收敛，适于高度密植研究指出：叶片越小，遮荫面积就越小；同样，茎与叶片的夹角越小，遮荫面积也就越小，群体内的透光性也就越好，有利于创高产。（2）群体光能利用率高，增产潜力大矮秆、半矮秆大豆株型紧凑适合高度密植，增加了绿色面积，即光合面积和最适叶面积系数增大，提高了群体光能利用率，因而能将更多的光合产物分配到结实器官中去，从而提高产量。由于矮秆、半矮秆大豆植株较矮，可使消耗于茎秆生长的营养物质相对减少，从而使雌性器官在生长发育过程中得到较多的养分供应，提高结实率，减少瘪荚率和瘪粒率，进而提高大豆籽粒
8、产量。（3）植株粗矮、节间短，抗倒伏能力强矮秆大豆植株较矮主要是由于节间长度缩短造成的，节间数并未减少，从而降低了植株的重心位置，表现出高度的抗倒伏性。矮秆大豆并非越矮越好，植株过矮会引起叶层过于郁密，光合性能降低，通风不良，病害蔓延，茎叶早衰，植株过矮也不利于机械化收获，一般说来，植株高度以5070厘米为宜。1.3 SSR标记及其应用1.3.1微卫星标记新型的分子标记生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列。重复序列又可分为串联重复序列和散布重复序列。其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、成串排列而成的。目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成的(如r
9、RNA和组蛋白基因)；另一类是由无功能的序列组成的。根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由16个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，
10、基于这一想法，人们发展了SSR标记。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的
11、多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量大；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物序列决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构理、目标基因的标定、指纹图的绘制等研究中。但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应用价值，且种属特异性较强，目前在一些主要的农作物中SSR标记研究取得了很大的进展。1.3.2大豆中的微卫星标记大豆的基因组约为1100Mb，其中40-60%
12、是重复序列（Gurley et al 1979），这就决定了大豆基因组研究的困难性。Akkaya等（1992）首先对大豆中微卫星进行了研究，证明其不仅大量存在并且具有高度的多态性。人们发现在大豆基因组中，（AT）n和（ATT）n比例较高，估算每40kb就有一个(AT)n微卫星DNA。迄今为止，大豆上已公开了900多个SSR标记的引物序列，20个连锁群，这20个连锁群很有可能对应于大豆的20对染色体。通过SSR的桥梁作用，合并后的遗传图谱上，除有443个SSR标记外，还有500个RFLP，98个RAPD，10个AFLP，12个同功酶及22个形态性状标记(Cregan et a1。，1999)。1
13、.3.3微卫星标记的应用（1）构建大豆分子遗传图谱在大豆的遗传图谱建立时，RFLP是比较常用的一种，但是由于RFLP分子标记很少有多于2个以上的等位基因且多数RFLP标记住往检测到多个DNA片段，使得RFLP所构建的连锁图往往含糊不清。SSR分子标记可克服上述RFLP标记的不足。首先。单个位点具有多个等位基因，而每一遗传型中仅有一个等位基因的特点。在大豆上，SSR分子标记的多态性已经得到充分证实(Akkaya et a1,1992)，某些位点具有多达26个等位基因。其次，在引物设计与选择时，仅保留那些在纯系中扩增出一个片段，淘汰那些扩增出多于一个片段的引物。（2）品种鉴定和种质保存遗传多样性与
14、遗传距离的研究采用快捷、精确、可靠的方法对大豆种质资源进行遗传多样性分析，明确其间的遗传距离，对于大豆资源的充分利用、遗传学研究及育种实践均有重要价值。（3）数量性状基因分析SSR位点随机均匀分布在大豆基因组中，利用QTLs和SSRs位点存在的连锁关系，对其基因进行分析。（4）分子标记辅助育种用分子标记指示重要农艺性状，为育种提供服务，是SSR技术运用最广泛的一个领域。抗南方根结线虫病，抗疫霉根腐病，抗灰班病，抗鳞翅目昆虫，抗涝，抗酸性土壤，抗铅，亚麻酸，棕搁酸等基因的SSR标记均见报道总之，运用SSR技术标记有重要利用价值的大豆基因是当前研究热点，也是其发展方向之一。SSR技术在大豆中应用的
15、潜力巨大，简化其引物设计程序，寻找更多SSR位点，充分发挥该技术优点，探索新的应用领域，是未来研究的主要任务。同时也应注意到它的进步给开拓大豆新的分子标记，如SNP(single nucleotide polymorphisms)奠定了坚实的甚础。2 材料与方法2.1实验材料高杆大豆9103经烷化剂EMS诱变处理，多代选育出矮秆突变体，经种植纯化后，得到稳定遗传的矮杆突变系，定名为9103-127。9103-127除矮化外，其它性状与原亲本9103相同，由亲本9103与突变系9103-12杂交及后代自交得到F2、F3群体。2.2实验方法本实验的实验流程可用下图来表示：2.2.1基因组DNA的提
16、取在田间高矮秆亲本及F3衍生系群体各株系内随机选择等量的叶片。参照SDS方法（Tai 等,1990）提取亲本及群体基因组DNA。1、取0.5g叶片，液氮中研成粉末，加入到含1mL65预热的SDS提取液100mM Tris-HCl （pH8.0）， 50mM EDTA （pH8.0）， 500mM NaCl， 2%SDS， PVP-K30 0.01g， -巯基乙醇2L(临用前加入)的离心管中。65 保温20-30 min2、加入1/5体积的5M醋酸钾（pH7.0）混匀，冰浴20 min以上3、4，12000rpm，离心10min，移取上清，加入等体积的苯酚:氯仿异戊醇（25241），混匀抽提4、
17、4，8000rpm，离心10 min，移出上清，加入2/3体积的异丙醇，-20 30 min，沉淀DNA5、4，4000rpm，离心5 min，弃上清，沉淀用80%的乙醇浸洗后，吹干6、溶解于100L TE10mM Tris-HCl （pH8.0）, 1mM EDTA中，完全溶解后，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25241），混匀抽提7、4，12000rpm，离心10 min，吸取上清，加入等体积的氯仿，抽提8、4，12000rpm，离心5 min，吸取上清，加入1/3体积的10M NH4AC混匀，加入2倍体积的无水乙醇，混匀5 min， -20 30min以上9、4，4000rpm，离心3
18、 min，弃上清，70%乙醇浸洗2-3次，吹干或冷冻干燥10、适量的TE溶解，-20保存待用。2.2.2 BSA分池从高杆9103、矮秆突变系9103-127两个F3衍生系群体中，依据目标性状表型的差异，将株系分成两组，高秆群体共118个单株，矮秆群体111个单株，从两个亲本（高杆、矮秆）的群体基因组DNA中，任取20份DNA，每株取5L(50ng/L)等量混合形成相对的DNA近等基因池（高秆基因池和矮秆突变体基因池）2.2.3微卫星或SSR标记分析按照soybase 网址上提供的大豆微卫星序列合成引物，由上海生工合成。PCR反应体系及扩增条件主要参照Cregan等（1994）报道的方法稍加改
19、进。大豆SSR扩增的PCR反应体系为25L。50ng大豆基因组DNA，2.5L 10Buffer50mM KCl，10mM Tris-HCl( pH9.0)，0.1% TritonX-100，1.5mM MgCl2，0.8M/L SSR引物（5端和3端），0.7mM/L dNTP，2.5U Taq聚合酶，超纯水补齐。扩增的反应条件为：预变性94 5min ，94 变性1min ，4654复性1 min，72 延伸1min，35次循环后，72 10min，反应在Biometra型PCR仪上进行，PCR产物加1倍体积的加样缓冲液（9%甲酰胺，10m mol/L EDTA，0.025%二甲苯菁），2
20、.5L 94变性5min 后置于冰上。PCR产物（4L/line）进行标准测序胶分离。2.2.4聚丙烯酰胺变性凝胶和琼脂糖凝胶电泳8%聚丙烯酰胺变性凝胶50mL（7M/L 尿素，1TBE，25%甲酰胺，200L 20% 过硫酸铵，50LTEMED）电极缓冲液为1TBE，在DYY-10C型电泳仪以80W的功率预电泳30分后，点样，两小时后，将凝胶用快速银染法分析结果。琼脂糖凝胶系统扩增体系与聚丙烯酰胺变性凝胶扩增体系一致，但扩增产物不用变性处理，取扩增样品15L在3.0%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）在3-5V/cm电压下电泳分离，在琼脂糖凝胶成像系统下观察记录并统计分析。聚丙烯酰胺变性凝胶的制备（P
21、reparation of the Gel）（1）玻璃板的清洗玻璃板洗干净，再用酒精擦一遍，晾干。凹口玻璃涂疏水硅烷,不带凹口的玻璃板涂亲合硅烷。晾干（2）电泳槽组装，（3）胶的配置 8.0%PA胶 50mL10%过硫酸胺 200L TEMED 50L 迅速摇匀（4）灌胶把胶沿灌胶口灌进去，防止出现气泡。待胶流动到底部，在顶部插入梳子，切忌气泡。聚合两小时以上。（5）电泳（Running the Gel）扩增后的样品加入2L Loading Buffer ,混合，95变性5min后立刻转移到冰中迅速冷却后，点样。清除气泡后，加入3L样品，80W恒功率电泳至第一条loading Buffer 带
22、至胶板的另一前沿。（2h）。（6）银染显色3、结果分析3.1.矮秆突变体9103-127基因组DNA的多态性检测根据大豆数据库中已公布的序列，共合成了433对SSR引物，引物基本覆盖了大豆的全基因组，平均每个连锁群近22个标记座位。由于时间关系，我承担了筛选其中6对引物（satt180，sat_084，satt185，satt172，satt045，satt452）的任务。用这6对引物对矮秆突变体9103-127及其亲本9103的基因组DNA进行多态性PCR检测分析，扩增产物在3.0%的琼脂糖凝胶上分离。这六对引物均能扩增出条带，其中satt180和satt452有明显的差异。（图一）图一：六
23、对SSR引物在亲本9103和矮秆突变体9103-127多态性筛选结果采用3.0%的琼脂糖凝胶分离。H代表亲本9103；D代表矮秆突变体9103-127。差异引物置于条带下方3.2 矮秆突变体9103-127的BSA分池PCR检测结果用筛选出的可能的差异引物satt180和satt452对高秆9103和矮秆突变体9103-127的BSA分池基因组DNA进行多态性分析。扩增产物在3.0%的琼脂糖凝胶上分离，结果发现，satt180表现为无差异，而satt452在BSA分池的两基因组DNA之间仍呈现多态性（图二），表明satt452与矮秆突变基因之间可能存在连锁关系。图二：satt180和satt4
24、52的BSA分池的多态性检测结果采用3.0%的琼脂糖凝胶分离。H代表亲本9103混合的BSA池；D代表矮秆突变体9103-127混合的BSA池。标记引物置于条带下方3.3群体分析将在BSA分池上具有多态性差异的引物satt452在矮秆突变体F3群体进行分离分析，结果见（图三，表1）。从分离比例的结果来分析，satt452这个基因座在矮秆突变体F3代的重组率为6.70%，在F3群体中，矮秆突变体带型几乎接近亲本9103-127矮秆突变体，说明矮秆突变基因为隐性基因，亲本9103-127为隐性纯合矮秆突变体，表明该矮秆突变是受一个主效基因控制的。HD H图3：satt452 在矮秆突变体9103-
25、127、F3衍生系群体中的PCR扩增结果（6.0%聚丙烯酰胺变性凝胶,H：9103高杆亲本，D:9103-127矮秆突变体）表1：引物satt452在矮秆突变基因群体中的检测结果引物序列总株数H带型D带型无条带rcMsatt45211379886.70%6.74引物Satt452的详细资料见表2：表2 与大豆矮杆突变基因相关的SSR引物satt452SSRLocusLinkageGroup (LG)MotifUpper primersequence (5-3)Lower primersequence (5-3)satt452E(ATT)12GCGGTCGCTGCGTTCAATATGCGCCCA
26、ATTATCATGGTAGA4 讨论目前国内在大豆矮秆突变体领域所做的工作不多，主要原因是没有合适的材料，由于矮秆突变性状是一个多基因性状，其中又有主效和微效基因之分，所以，如果没有合适的具有明显株高差异的纯系对比材料，是很难开展研究工作的，也不可能做出重大成果，而我们所使用的材料为由高杆9103进行EMS诱变处理后获得的9103-127矮秆突变体，其生理生化性状除了高矮不同外，其它性状均相同。由于时间有限，在两个多月的时间里，我只做了其中六对引物的筛选。幸运的是，在这六对引物中存在特异性差异引物satt452。由于矮秆突变基因的特殊性，我们可以得出，在433对引物中，应该能存在不少的特异性差
27、异引物，找到这些引物后，我们再根据各个引物的检测结果进行连锁分析，可以构建大豆矮秆突变基因的遗传连锁图并进行基因定位。大豆微卫星DNA的简单重复序列一般为(AT)n或(ATT)n，由于引物序列中A-T比例较高，因此在PCR反应时退火温度相对于其它作物较低，一般为4647。扩增产物中除了SSR座位预期的等位基因以外，有的产生了一些非特异性的弱带，但这些带一般都大于300-400bp，不影响SSR分析。实验中发现发现重复单位中核苷酸数目的不同，造成了PCR扩增产物带型的差异。一般来说，单核苷酸和二核苷酸重复单位的扩增产物带型比较复杂，除一条主带，周围有较多的弱带，而三核苷酸重复单位的扩增产物带型则较为简单。因此在利用指纹分析时，应尽量使用三核苷酸重复单位的SSR标记，这样更容易分辨大小差异较小的等位基因。在对基因准确定位后，我们可以对DNA片段进行琼脂糖凝胶回收，再通过测序、克隆、转化等工作，通过模式植物或大豆转基因操作，生产转基因矮秆大豆，这对于大豆遗传育种，改良大豆品质等具有重大的理论和现实意义！
