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1、 SHANGHAI UNIVERSITY 毕业设计（论文）UNDERGRADUATE PROJECT (THESIS) 题 目: 四种核酸染料在琼脂糖凝胶 电泳中染色特性的比较分析学 院 生命科学学院 专 业 生物工程 学 号 09123303 学生姓名 沈四维 指导教师 华子义 起讫日期 02-25-06-04 毕业设计（论文）任务书指导教师 华子义 课题名称 四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中 染色特性的比较分析作业期限 2 月 25 日起 6 月 4 日止接受单位 上海大学生命科学学院 学生姓名 沈四维 学 号 09123303 所在专业 生物工程 二O 年 月 日(一)课题来源、意义与主要
2、内容：（注明自拟、科研、科技服务类别及任务提出单位）课题来源：生产实践意义与主要内容：核酸电泳作为分离、纯化、鉴别核酸的重要方法，是分子生物学的核心技术之一。核酸电泳常用溴化乙锭（EB）作染料。但EB具有成本高、毒性强、强致突变性、环境污染严重等缺点。本实验旨在通过将3种新型染料分别用于电泳染色，与传统染料EB对比，找出既染色效果好，又毒性小，不具致突变性的核酸染料，以期能替代EB成为实验用的普通染料。(二)目的要求和主要技术指标: 实验将选用新型染料GenGreen、GelRed、SYBR Green，以及传统染料EB，分别在缓冲液TAE和TBE中进行电泳，进行灵敏度、染色效果等方面的对比。
3、各方综合，选出最佳染料，确保改进后的方法不仅经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏，而且毒性低，更好地确保操作人员的健康和周围环境的安全。(三)进度计划:2-253-5 查阅文献资料。3-63-8 预实验，确定DNA的浓度梯度。3-93-29 以TAE为缓冲液，分别以4种染料染色，电泳。（胶染法、泡染法）4-14-30 以TBE为缓冲液，分别以4种染料染色，电泳。（胶染法、泡染法）5-16-4 写论文，准备答辩。 (四) 主要文献、资料和参考书：EB、银染和SYBR Green在DNA显示中的比较琼脂糖凝胶电泳常见问题的分析核酸染料的应用研究课题3中核酸染料应用于细菌脉冲场凝胶电泳染色的比较分
4、析EB和SYBR Green染色方法的比较（五）审批意见：系(教研室)负责人: 20 年 月 日（六）学生意见: 学生签名: 20 年 月 日（七）课题变动情况：负责人: 20 年 月 日（八）注意事项：1. 本任务书一式三份。（一）、（二）、（三）、（四）各项一般应在毕业作业开始前二周由指导教师认真填写，经系（教研室）负责人审查批准后，一份留系备查，一份由指导教师保存，一份下达给学生。2. 学生应在导师指导下，根据本任务书的要求具体制订实施计划，并积极完成任务。3. 课题内容如有变动，需经所属系或接受单位负责人同意。 毕业设计（论文）开题报告学 院 生命科学专 业 生物工程学 号 09123
5、303姓 名 沈四维指导教师 华子义日 期 二 13年 3 月 1 日课题名称四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中染色特性的比较分析课题来源生产实践一、课题背景及意义（课题的立题依据及研究意义）近年来分子生物学得到了迅速发展，聚合酶链式反应（PCR）是公认的一种简便、准确的核酸定量检测技术。核酸电泳作为分离、纯化、鉴别核酸的重要方法，是分子生物学的核心技术之一。然而，它所能检测的极限及精确度依赖于现实DNA的染色方法。核酸电泳常用溴化乙锭（EB）作染料。EB能使凝胶中的DNA合RNA很好得着色，但EB具有成本高、毒性强、强致突变性、环境污染严重等缺点。本实验旨在通过将3种新型染料分别用于电泳染色，与
6、传统染料EB对比，找出既染色效果好，又毒性小，不具致突变性的核酸染料，以期能替代EB成为实验用的普通染料。二、课题研究现状及发展趋势（课题研究领域的发展现状及可能的发展方向）现在研究者正在不断研究推出既染色效果好，又不具有致突变性的核酸染料，以期能替代EB成为实验用的普通染料，从而减少由EB染色带来的环境污染。如：GoldView、GelRed、GenGreen、SYBR Green等。其中，GoldView的灵敏度与EB相当，使用方法与EB相同，而毒性低于EB。SYBR Green的灵敏度为EB的十倍，使用方法与EB相同，且几乎无毒，不具有致突变性，可用于凝胶中的核酸染色，也可用于对细胞中的
7、核酸染色，但价格比较昂贵。该领域可能的发展方向是：EB将被逐渐替代，甚至淘汰。将有经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏、相关性好、样品用量少、时间成本低、而且更好地保障工作人员的健康和周围环境安全的染料，并形成标准化操作方案。三、研究内容及研究目标（对研究的内容进行说明，并阐明要达到的目标） 实验将选用新型染料GenGreen、GelRed、SYBR Green，以及传统染料EB，分别在缓冲液TAE和TBE中进行电泳，进行灵敏度、染色效果等方面的对比。各方综合，选出最佳染料，确保改进后的方法不仅经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏，而且毒性低，更好地确保操作人员的健康和周围环境的安全。四、
8、预计的研究难点（课题研究过程中可能遇到的理论难题或技术难点）保证实验的平行性。在实用不同的核酸染料电泳时，要保证其他的条件不变。如：相同的缓冲液、DNA、PH、温度等。点样时要快而精准，防止点入的样品溢出，飘散到缓冲液中，影响实验准确性。五、创新点（选题、观点、理论、材料、方法等创新点）通过查阅大量文献，还未发现同时比较GenGreen、GelRed、SYBR Green，以及传统染料EB这四种核酸染料的先例。在染色方法上，选用胶染法和泡染法两种方法。选择了不同的缓冲液：TAE和TBE。六、进度计划（根据研究内容及研究目标所预计的进度安排）2-253-5 查阅文献资料。3-63-8 预实验，确
9、定DNA的浓度梯度。3-93-29 以TAE为缓冲液，分别以4种染料染色，电泳。（胶染法、泡染法）4-14-30 以TBE为缓冲液，分别以4种染料染色，电泳。（胶染法、泡染法）5-16-4 写论文，准备答辩。 七、资料来源（指能够支持“课题背景”、“课题研究现状及发展趋势”所论述内容的主要文献资料）EB、银染和SYBR Green在DNA显示中的比较琼脂糖凝胶电泳常见问题的分析核酸染料的应用研究课题3中核酸染料应用于细菌脉冲场凝胶电泳染色的比较分析EB和SYBR Green染色方法的比较指导教师意见：（对课题的认可意见） 指导教师: 年 月 日 系（教研室）审查意见： 系（教研室）负责人： 年
10、 月 日 教务处制目录摘 要IABSTRACTII第一章 绪 论11 DNA的琼脂糖凝胶电泳11.1 琼脂糖凝胶电泳概况11.2 影响电泳因素11.3 电泳方法32选题背景42.1 立题依据及研究意义42.2 研究领域发展现状及展望53多种染料概况53.1 EB53.2 GelRed53.3 GenGreen63.4 SYBR Green6第二章 实验材料与方法81材料及仪器81.1实验试剂81.2实验仪器81.3实验用品92实验方法92.1 试剂准备与配制92.2 琼脂糖凝胶的制备102.3 点样与电泳122.4结果观察与记录13第三章 实验结果与分析141电泳分析141.1胶染法(TBE为
11、缓冲液)141.2胶染法、以TAE为缓冲液时181.3泡染法、以TBE为缓冲液时221.4 泡染法、以TAE为缓冲液时262不同染料比较分析302.1视觉效果302.2毒性322.3 对DNA的迁移影响332.4 可重复利用率332.5稳定性332.6时间成本342.7价格343实验结果34第四章 讨论361实验注意事项362问题及讨论37第五章 结 论39致 谢40参考文献41附页43摘 要本实验采用琼脂糖凝胶电泳法，以不同浓度的DNA作为样品，选用新型核酸荧光染料Gelred、GenGreen、SYBR Green，以及传统染料EB，分别在TAE、TBE中，分别采用胶染法、泡染法进行染色，
12、进行灵敏度、染色效果、染色时间等对比实验。首先将DNA母液稀释成多种浓度，通过预实验，确定了DNA的浓度梯度为0.1、0.3、0.5、0.8、1 、3、5ng/ul。然后将此浓度梯度的DNA溶液分别点样于TAE、TBE两种凝胶电泳体系中，进行电泳。另外采用胶染法和泡染法两种不同的染色方法。对染色效果、灵敏度、时间成本等进行对比分析。结果表明，新型染料GenGreen，不仅操作简便、条带清晰、定量灵敏、价格适中，而且无毒、低致突变性，能更好的保证操作人员的健康和周围环境的安全。在本实验体系中能完美替代EB。关键词：琼脂糖凝胶电泳；DNA；EB；GenGreen；GelRed；SYBR Green
13、ABSTRACTIn this study, agarose gel electrophoresis will be taken.With different concentrations of DNA as calibration solution,and 3 kinds of novel nucleic acid fluorescent dye:Gelred、GenGreen、SYBR Green,In addition to the traditional dye EB.There will be two kinds of buffer solution:TAE and TBE.Prec
14、ast gel staining and soak staining will be used.Sensitivity, dyeing effect, dyeing time and many other factors will be compared.First,the original liquor of DNA will be diluted to various concentrations. The concentration gradient of DNA is identified as 0.1,0.3,0.5,0.8,1, 3,5 ng / ul through the pr
15、e-experiments.Then the DNA solutions of different concentration will be spotted on two kinds of gel electrophoresis system of TAE and TBE.Using two different staining methods:precast gel staining and soak staining.After electrophoresis and staining,comparing and analyzing dyeing effect, sensitivity,
16、 time costs,and so on.The result of experiments show that GenGreen, is easy to operate , more sensitive and affordable,has clear bands.Whats more,it has non-toxic and low mutagenicity.It can ensure operators health and the environment.It can replace EB perfectly in this experimental system.Key words
17、：Agarose gel electrophoresis；DNA；EB；GenGreen；Gelred；SYBR Green第一章 绪 论1 DNA的琼脂糖凝胶电泳1.1 琼脂糖凝胶电泳概况琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸的重要方法1。是核酸研究工作中不可缺少的重要分析手段，广泛应用于基础理论研究、农业科学、医学卫生、工业生产、国防科研、法医学和商检等许多领域，在生物化学和分子生物学的教学和科研中具有重要作用25。琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的基本原理是基于DNA为多元酸，是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离6。核酸分子因而带负电荷，在中性或弱碱性
18、缓冲液中向阳极泳动。而琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分子2,使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子在从负极到阳极移动过程中的迁移率出现较大差异,从而达到分离的目的。1.2 影响电泳因素1.DNA分子大小及构型 DNA片段在琼脂糖凝胶中的迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物（marker）移动的距离与未知DNA片段的移动距离时行比较，便可测出未知DNA片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，很难通过琼脂糖分子之间的空隙，就很难在琼脂糖凝胶中迁徙，普通琼脂糖凝胶很难将它们分开。此时电泳的迁
19、移率不再依赖于分子大小，因此，用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。不同构型的DNA：共价超螺旋闭环DNA（）、直线DNA（）、开环的双链环状DNA（）在琼脂糖凝胶中的移动速度不同。在较低琼脂糖浓度中型比型迁移地更快，因为型可以扭曲蠕行快速通过较大的凝胶孔径。而在高浓度的凝胶中，顺序可能颠倒，由于超螺旋DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率较低，而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进7。可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 2.琼脂糖的浓度不同大小的DNA片段需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行
20、电泳分离。对DNA片段的分离范围与琼脂糖浓度有关8。分离小于0.4kb的DNA片段时凝胶浓度通常为1.21.5%，分离大于8kb的DNA分子所需胶浓度为0.30.7%，DNA片段大小位于两者之间则所需胶浓度为0.81%。具体琼脂糖浓度与DNA分离范围的关系如下表9所示：琼脂糖浓度/%0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1表1 琼脂糖浓度与DNA分离范围3. 电压在电场强度增加时，不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效
21、分离范围将缩小10,11。一般采用恒压电源,电压选择为5 V/cm左右(长度以两个电极之间的距离计算)。电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐、清晰，过高时会出现弯月形条带；相反，电压降低，电泳时间较长，核酸条带相对整齐、清晰。4. 缓冲液常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）。双链线状DNA片段在TAE中的迁移速率比在TBE中快，但这些系统的分辨能力几乎相同，只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率要比在TBE中更好。缓冲液浓度要适中，若浓度过低，溶液中缺少离子，电流太小，DNA迁移慢；反之，高离子强度的缓冲液由于电流太大会产生大量热
22、量12，严重时，会造成DNA的变性和凝胶熔化。电泳缓冲液一般可重复使用多次,但若出现浑浊情况就应及时更换，否则影响电泳分辨率9。5. 染料预制凝胶染色法即胶染法，由于在制备凝胶时直接将染料加在凝胶中，电泳时有些染料会嵌入DNA13，可能会影响DNA的迁移率。如当核酸和EB泳动到凝胶的适当位置时，EB染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，负电荷减少，使线状DNA迁移率降低15%7。1.3 电泳方法1.电泳类型琼脂糖凝胶电泳共有两种类型：垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。本实验选用的电泳方法是水平型，
23、因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，从而节约凝胶和染料。2.缓冲液系统为了便于保存，电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。如：TAE配制成50的存储液，使用时稀释成1的工作液；TBE溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5溶液，使用时稀释成0.5的工作液。3.凝胶的制备以稀释好的缓冲工作液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入胶槽，插入梳子，自然冷却。胶染法染色时，要在稍冷却（60左右14）的琼脂糖溶液中滴入适量染料。泡染法则不用加染料。4.样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.2
24、5溴酚蓝或其他指示染料，含有10-15蔗糖或510甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。5.电泳在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。随着电场强度的增加，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此，在低浓度、低电压下，分离DNA片段效果较好。随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的迁移并没有显著的影响。因此，通常在室温下进行电泳即可，只有当凝胶浓度低于0.5时，为增加凝胶硬度，可在
25、4进行电泳15。6.染色和拍照胶染法电泳后直接在凝胶成像系统下观察DNA条带，拍照，输出照片，并进行有关的数据分析。泡染法要在电泳结束后，要将凝胶放置在配制好的染液中避光染色0.51小时左右。再取出进行观察拍照。2选题背景2.1 立题依据及研究意义近年来分子生物学得到了迅速发展，聚合酶链式反应（PCR）是公认的一种简便、准确的核酸定量检测技术。核酸电泳作为分离、纯化、鉴别核酸的重要方法，是分子生物学的核心技术之一。然而，它所能检测的极限及精确度依赖于显示DNA的染色方法。核酸电泳常用溴化乙锭（EB）作染料。EB能使凝胶中的DNA合RNA很好得着色，但EB具有成本高、毒性强、强致突变性、环境污染
26、严重等缺点。本实验旨在通过将3种新型染料分别用于电泳染色，与传统染料EB对比，找出既染色效果好，又毒性小，不具致突变性的核酸染料，以期能替代EB成为实验用的普通染料。2.2 研究领域发展现状及展望现在研究者正在不断研究推出既染色效果好，又不具有致突变性的核酸染料，以期能替代EB成为实验用的普通染料，从而减少由EB染色带来的环境污染。新型染料更是层出不穷，如：GoldView、GelRed、GelGreen、GenGreen、GeneFinder、SYBR Green、SYBR Green等。其中不乏染色效果堪比EB甚至超越EB的染料，然而有些在稳定性、对DNA的迁移影响、灵敏度个、毒性等方面还
27、存在一些问题。该领域可能的发展方向是：EB将被逐渐替代，甚至淘汰。将有经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏、相关性好、样品用量少、时间成本低、而且更好地保障工作人员的健康和周围环境安全的染料，并形成标准化操作方案。3多种染料概况3.1 EB溴化乙锭(EB)是核酸电泳最常用的染料。它能使凝胶中的DNA和RNA很好的着色，从而显示凝胶中核酸的相应位置。但EB具有灵敏度差、毒性强、难以降解转化、净化处理繁琐、环境污染严重等缺点。大量文献报道，包括果蝇、小鼠等的实验均证实小剂量的EB亦存在致突变、抑制细胞生长等问题，长期使用极有可能对操作人员造成危害。废液处理也存在生物安全隐患，污染环境1618。因
28、此实验结束后，应对含EB的溶液及其污染物进行净化处理再行弃置，以避免污染环境。3.2 GelRedGelRed 是一种无毒性的新型核酸染料。GelRed 独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果也表明，该染料的诱变性远远小于 EB。GelRed 灵敏度高，适用于各种大小片段的电泳染色，对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I。 GelRed稳定性高，适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶；室温下在酸或碱缓冲液中极其稳定，耐光性强。此外，它操作简单，EB 一样，与在预制胶和电泳过程中染料不降解；而电泳泡染色过程也只需30分钟且无需脱色或冲洗，即可直接用紫外
29、凝胶透射仪观察。GelRed适用范围广，可选择电泳胶染色（胶染法）或电泳泡染色（泡染法） ；适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳；可用于 dsDNA、ssDNA 或 RNA 染色。 3.3 GenGreenGenGreen稳定性极好，适用于使用微波或其他方法加热，可以在室温下保存。其独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果表明，该染料的诱变性远小于EB。适应性广泛，适用于预制凝胶和凝胶电泳泡染色，适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，可用于 dsDNA、ssDNA或 RNA染色。染色过程简单，与 EB 一样，在预制胶和电泳过程中不必担心染料降解；而电泳泡染色过程也
30、只需 30 分钟且无需脱色或冲洗，即可直接用可见光凝胶透射仪观察。3.4 SYBR GreenSYBR Green是一种新推出的核酸荧光染料，灵敏度非常高，至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25100倍19。适用于各种电泳分析，操作简单，无须脱色或冲洗。在凝胶核酸染色中的使用方法跟EB完全相同，但不具有EB的强致突变性、强致癌性。用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低，可适用于多种电泳分析。可用于对凝胶中的核酸染色，也可用于对细胞中的核酸染色，是相对比较安全的染料。第二章 实验材料与方法1材料及仪器1.1实验试剂1）0.5ug/ulDNA （北京鼎国昌盛生物技术
31、有限责任公司）2） GelRed（10,000 水溶液）3） GelRed3 染色液4） GenGreen 10,000（鼎国）5） GenGreen3 染色液6） SYBR Green 10,000 ,DMSO( DH392-2,Invitrogen分装)7） SYBR Green3 染色液8） EB(NEP028,鼎国)9） NaOH10） EDTA11） Tris碱12） 硼酸13） 冰乙酸14） 琼脂糖（Agarose)15） 6 loading buffer以上实验药品和试剂均为分析纯。915的试剂和药品均购自国药集团化学试剂有限公司。1.2实验仪器1） 高温高压灭菌锅 TOMY S
32、X-5002） 电热恒温干燥箱 恒宇 JB/T5520-913） 电子天平 METTLER TOLEDO AL1044） 基础型电泳电源 CAVOY5） 水平电泳槽 上海天能科技有限公司6） 微波炉 美的7） 恒温水浴锅 精宏实验设备有限公司8） 凝胶成像系统（312nm激发） BIO-RAD 9） PH计 Mettler Toledo10） 0.22ul移液枪 Thermo11） 220ul移液枪 Thermo12） 20200ul移液枪 Thermo13） 1001000ul移液枪 Thermo 14） 计算机 Lenovo1.3实验用品1）250ml三角烧瓶 2）1000ml广口瓶 3）
33、100ml量筒 4） 聚丙烯塑料盒 5） 铝箔 6） 药勺 7） PE手套 8） 橡胶手套 9） EP管 10） 枪头 11） 报纸 12） 梳子 13） 胶槽 14） 保鲜膜15） 报纸 2实验方法2.1 试剂准备与配制1.DNA浓度梯度稀释1） EP管、枪头连盒放入高压灭菌锅中灭菌20min，再放入烘箱中8h烘干。2） 取10ul的0.5ug/ulDNA母液于EP管中，加入990ul的ddH2O，稀释成5ng/ul溶液。3）按照下表配制不同浓度（0.1、0.3、0.5、0.8、1ng/ul）的DNA溶液。然后放入4冰箱保存。管号1234567VDNA(5ng/ul)/ul261016206
34、0100VddH20/ul9894908480400表2 DNA浓度梯度配制表2. 0.5mol/l EDTA溶液的配制1） 在电子天平上称取14.612gEDTA，置于100ml三角烧瓶中。2） 在三角烧瓶中加入约80ml的ddH2O，在水浴锅中60适当加热，在磁力搅拌器上充分搅拌。3） 边搅拌边用NaOH调解PH至8。（约用2gNaOH）4） 搅拌至固体完全溶解。5） 待溶液冷却后，再用NaOH调解PH至8。6） 在三角烧瓶中加ddH2O，定容到100ml。7） 高温高压灭菌后，室温保存。3. 5TBE的配制1）在电子天平上称取Tris碱27g、硼酸13.75g。置于1000ml广口瓶中。
35、2）加入10ml的0.5mol/L EDTA。3）加水补足500ml。4）使用时稀释成0.5的工作液即可使用。4. 50TAE的配制1） 在电子天平上称取Tris碱60.5g。置于1000ml广口瓶中。2） 加入50ml的0.5mol/L EDTA。3） 加入14.275ml冰乙酸。4） 加水补足250ml。5） 使用时稀释成1的工作液即可使用。5. 染色液的配制 用H2O将GelRed 10,000储液（或GenGreen、SYBR Green储液）稀释约3,300倍到0.1M NaCl中，制成 3 染色液。（例如将15L GelRed 10,000储液和5mL 1M NaCl加到 45mL
36、 H2O 中）。 2.2 琼脂糖凝胶的制备2.2.1胶染法（胶染法）琼脂糖凝胶的制备1.以TBE为电泳缓冲液1）称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g，倒入150ml三角烧瓶中。2）熔胶 在锥形瓶中加入35ml的0.5TBE缓冲液，与琼脂糖干粉混合，配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热23次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。3）倒胶 琼脂糖浆正在冷却时，在干净的胶槽内摆好合适的梳子，形成加样孔。 待熔化的凝胶稍冷却后，在三角烧瓶中滴加2L核酸染料。轻轻地摇动以便充分混匀。 冷却至不烫手（60C），浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。4）拔梳 待胶完全凝结后，轻轻拔掉梳子。2.以TAE为
37、电泳缓冲液1）称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g，倒入150ml三角烧瓶中。2）熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1TAE缓冲液，与琼脂糖干粉混合，配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热23次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。3）倒胶 琼脂糖浆正在冷却时，在干净的胶槽内摆好合适的梳子，形成加样孔。 待熔化的凝胶稍冷却后，在三角烧瓶中滴加2L核酸染料。轻轻地摇动以便充分混匀。 冷却至不烫手（60C），浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。4）拔梳 待胶完全凝结后，轻轻拔掉梳子。2.2.2 泡染法（泡染法）琼脂糖凝胶的制备1.以TBE为电泳缓冲液1）称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.35
38、0g，倒入150ml三角烧瓶中。2）熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1TBE缓冲液，与琼脂糖干粉混合，配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热23次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。3）倒胶 琼脂糖浆正在冷却时，在干净的胶槽内摆好合适的梳子，形成加样孔。 冷却至不烫手（60C），浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。4）拔梳 待胶完全凝结后，轻轻拔掉梳子。2.以TAE为电泳缓冲液1）称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g，倒入150ml三角烧瓶中。2）熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1TAE缓冲液，与琼脂糖干粉混合，配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热23次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。
39、3）倒胶 琼脂糖浆正在冷却时，在干净的胶槽内摆好合适的梳子，形成加样孔。 冷却至不烫手（60C），浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。4）拔梳 待胶完全凝结后，轻轻拔掉梳子。2.3 点样与电泳1）在水平电泳槽中加入电泳缓冲液。2）将凝胶安放在电泳槽内，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。3）在EP管内或保鲜薄膜上混合10LDNA样品和2L的6上样缓冲液。每个浓度混合2个。4）用微量移液器将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。每个浓度点2个孔。5）关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极侧移动。电压给于100V。6）待染料到适当距离时停止电泳。7）关上电源，拔出电极插头，打开电泳槽盖。2.4结果观察
40、与记录2.4.1 泡染法（泡染法）电泳泡染色将凝胶小心地放入聚丙烯容器中。缓慢加入足量的3染色液浸没凝胶。室温避光染色30min左右，最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有 不同。染色时间通常介于30min到1h。胶染法（胶染法）电泳后可直接观察结果，无需再染色。2.4.2 紫外光下观察拍照1） 在紫外凝胶成像仪上铺上保鲜膜。2） 取出凝胶，在紫外凝胶成像仪上成像拍照，输出照片，观察结果。 第三章 实验结果与分析1电泳分析 1.1胶染法(TBE为缓冲液) 1.1.1 EB染色电泳图图1.胶染法、以TBE为缓冲液、EB为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见8ng背景荧光信号较强DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.1.2 GelRed染色电泳图图2.胶染法、以TBE为缓冲液、GelRed为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见3ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲浓度高时轻微扭曲边缘是否清晰锐利是1.1.3 GenGreen染色电泳图图3.胶染法、以TBE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见3ng背景荧光信号弱D
