第十章 dna、rna的生物合成 课件.ppt

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1、核酸的合成,分子生物学(分子遗传学)中心法则,反映了从DNARNA蛋白质的遗传信息主流，揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递和表达的规律。,转录,RNA,翻译,蛋白质,DNA,RNA（病毒）,复制,复制,翻译,蛋白质（病毒）,反转录,第一节 DNA的生物合成,DNADNA DNA复制,RNADNA 反转录,两种方式,复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。,一、DNA的复制,复制的方式,DNA的半保留复制,一、DNA的半保留复制,2.半保留复制的实验证据:,1.定义：,1958年Meselson和Stahl用同位素15N

2、标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。,以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。,第十二章 DNA复制与修复,DNA半保留复制,DNA的复制的方式-,1958,Messelson and Stahl实验证实,细菌的DNA双链,(蓝线的代表含15N),含15N-DNA的细菌,DNA半保留复制的证据,第一代,故可排除混合式复制方式,排除全保留式,细菌的DNA双链,(蓝线的代表含15N),(红线的代表含14N),含15N-DNA的细菌,DNA半保留复制的证据,排除混合式,Why?

3、,DNA的半保留复制的生物学意义：,DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。,必须具备的基本条件,模板：母链DNA 原料：dNTP(包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP)酶和蛋白质因子：引物：一小段RNA 能量（ATP）及某些无机离子,参与DNA复制的酶类与蛋白质因子及其主要作用,1.拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）,无ATP时：作用相当于Topo,但切割的是双链DNA某一部位(断双链)。有ATP时：使带断口、松弛状的DNA分子旋紧转变成负超螺旋结构，再连接断端。,不

4、需耗能(ATP)，切割(断)双链DNA中的一链，松解螺旋,封闭切口。又称切割封口酶。,Topo 的作用,Topo(又称旋转酶)的作用,拓扑异 构酶II+ATP,拓扑异 构酶I,DNA的松弛状态与超螺旋,2.解链酶(又称解螺旋酶或螺旋酶,helicase),作用：断裂互补碱基间的氢键,使DNA双链分离形成“复制叉”。,3.单链DNA结合蛋白(DNA结合蛋白)(single stranded DNA-binding protein,SSB),作用：防止重新形成双 链和防止单链模板被核酸酶水解,维持DNA单链状态和完整性,4.引物酶(Primase),RNA的合成：需引物酶，它是一种特殊的RNA聚合

5、酶。,DNA不能从无有合成，需在一小段RNA基础上合成DNA,5.DNA聚合酶（DNA polymerase,DNA pol）即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）,原核生物（E.coli）迄今已知只有3种：DNA pol、DNA pol、DNA pol。真核生物 亦发现有多种DDDP：DDDP、。其性质与功能,原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP dCTP dTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆 菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3-OH.合成方

6、向：5 3,(一)DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：,大肠杆菌中DNA聚合酶某些性质 DNA聚合酶 性 质-酶分子/细胞 400 40 20 酶分子量(kd)109 90 140 5 3 聚合功能 有 有 有 5 3 外切酶活性 有 有 无 3 5 外切酶活性 有 有 有 聚合核苷酸数/分钟/分子(37)1000 50 15000 主要功能 修复等 修复作用 复制,表13-2 真核细胞中DNA聚合酶的性质 DNA聚合酶 性质-分布 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 分子量(kd)250 36-

7、38 160-300 170 256 3 5外切酶活性 无 无 有 有 有 5 3聚合作用 有 有 有 有 有 主要功能 复制 损伤修复 复制 复制 复制,损伤修复(随从链)(领头链),DDDP 53聚合作用示意图,DDDP 的 53外切及35外切作用示意图,35外切,5 3外切,5,3,C,A,3,6.DNA连接酶(DNA Ligase),作用：在有模板指导的条件下，催化2个DNA片段(两片段间的距离为1个3,5-磷酸二酯键的键长)的连接。原理：在一个DNA片段的3-OH末端和另一个DNA片段的5-P末端形成3,5-磷酸二酯键，从而实现连接。特点：原核细胞:需辅助因子NAD+真核细胞:不需辅

8、助因子NAD+,但需耗能(ATP),表13-4 参与DNA复制的酶及蛋白质 酶或蛋白质 主要作用 拓扑异构酶类 克服解链时打结及缠绕、松驰或引 进负超螺旋 解链酶类 解开DNA双链 单链DNA结合蛋白 维持已解开单链DNA的稳定 引物酶 合成RNA引物 DNA聚合酶 DNA复制 DNA聚合酶 水解引物、填补空隙、修复作用 DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图,DNA的复制过程 复制的起始 链的延长 复制的终止,复制的起始,1.在拓扑异构酶、解链酶及单链DNA 结合蛋白的共同作用下，DNA解旋、解链，形成复制叉。2.依赖于单链模板，由引物酶催化

9、按碱基配对规律合成一小段RNA引物(原核细胞引物长50-100个碱基，真核约10个碱基)。,DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）,复制的终止：,复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成,链的延伸：,复制起始阶段的特点,真核细胞：具有多个 起始位点,原核细胞：仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制,链的延长,引物合成后，由DNA pol（真核细胞为DNA聚合酶或)催化，在引物3-OH末端逐一添加与模板链对应互补的脱氧核苷磷酸,使新合成的链不断延长。前导链:链的延长方向(5 3)与解链方向(复制叉移动方向)相同,为连续合成。随从链:链的延长方向(53)与解链方向(复制叉移动方向

10、)相反，为不连续合成。分段合成的DNA片段,最初被命名为冈崎片段,III,三、DNA复制的半不连续性,前导链,滞后链,冈崎片段,前导链：以3 5 方向的亲代链为模板连续合成的子代链。,滞后链：以5 3方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。,DNA链的延伸,在DNA聚合酶的催化下，以四种5-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。,前导链 滞后链 冈崎片段 半不连续复制,冈崎模型,复制的终止,1.水解引物及填补空隙 冈崎片段合成后，由DNA pol(真核

11、细胞可能是DNA聚合酶)水解去除RNA引物，并填补留下的空隙(5 3)聚合。2.完整双链DNA分子的形成 填补空隙后，DNA片段与片段之间还有一个缺口(一个3,5-磷酸二酯键的长度),由DNA连接酶催化连接成完整的链，从而产生完整的双链DNA分子。,DNA复制的精确性（高保真复制）,1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。3、DNA的损伤修复系统。,DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/1091/1010，即每1091010个

12、核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制100010000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：,二、反转录(reverse transcription),概念 以RNA为模板，dNTP为原料，反转录酶催化，按碱基配对规律合成DNA的过程。反转录酶,又称为依赖RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase,RDDP),DNA,RNA,RNA(病毒),病毒RNA,RNA-DNA 杂化分子,cDNA,前病毒(双链DNA),酶催化反应示意图,反向转录酶存在于所有致癌RNA病毒中,其功能可能与病毒的恶性转化作用有关;,但它也存在于

13、某些正常细胞中，在细胞分化与胚胎发生中可能起某些作用。,反转录病毒和反转录酶的发现,提出了一个重要的医学问题病毒致癌及癌基因,反转录的医学意义,反转录的医学意义,癌基因(oncogene):能在体外引起细胞恶性转化,在体内诱发肿瘤的基因.,细胞癌基因(c-onc)或原癌基因(pro-onc):存在于生物正常细胞基因组中的癌基因.正常情况下基因处于静止或低表达的状态.当受到致癌刺激被活化并发生异常时则可发生细胞癌变.,病毒癌基因(v-onc):存在于致瘤病毒中的能使靶细胞发生恶性转化的基因.,用三个小写字母表示癌基因名称,如myc,fos,ras,src等,抑癌基因:是一类抑制细胞过度生长,增殖

14、从而遏制肿瘤形成的基因.如Rb,P53,P16等,癌基因与抑癌基因之间一般处于动态平衡状态,是一种反转录病毒,可引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS,艾滋病).,反转录酶在基因工程,分子病的基因治疗方面也有重要作用.,人类免疫缺陷病毒(HIV),反转录的医学意义,第二节 DNA的损伤与修复,一、DNA的损伤,生物体受某些理化和生物等外源性因素或机体内环境改变的影响，引起DNA分子结构的任何异常改变称为DNA损伤(DNA damage),概念,UV,引起DNA损伤的因素,紫外线(常产生嘧啶二聚体)电离辐射(断磷酸二酯键),物理因素,胸腺嘧啶二聚体的产生,化学因素：均能干扰复制与转录功能,烷化剂：(

15、如氮芥类,CTX)，使鸟嘌呤的 N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点,亚硝酸盐：使碱基脱氨,原G-C配对最终变为A-T配对，导致错配,CU,AI,GX,化学因素：均能干扰复制与转录功能,烷化剂：(如氮芥类,CTX)，使鸟嘌呤的 N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点,亚硝酸盐：使碱基脱氨,原G-C配对最终变为A-T配对，导致错配,CU,AI,GX,丝裂霉素：与DNA共价连接引起链交联,目前多指病毒,糖苷键自行断裂；自发脱氨基作用,CU，AI。,生物因素,生理因素 机率极低,突变(mutation)：有机体基因组可遗传的改变，即DNA序列的改变.,根据引发的原因，可将突变分为：诱发突变和自发突变。

16、,缺失,根据 DNA分子的改变，突变可分为4类：,点突变,缺失或插入的碱基数不是3的整倍数时，则引起移码突变,插入,倒位(或易位),基因突变可能出现的后果,生物体致死 生物体某些功能丧失 仅改变基因型，表现型不受影响 改变生物物种，出现新的生物特征,DNA复制过程所发生的突变(碱基配对错误)，由核内DNA聚合酶以其校读功能予以纠正.,若碱基错配频频发生或损伤范围大，则需采用以下修复方式进行修复.,二、DNA损伤的修复,T+T,DNA修复方式,1.光修复:,2.切除修复：由3种酶共同参与完成。,DNA pol I,DNA连接酶,重组修复过程,3.重组修复：亦称复制后修复,4.SOS修复：DNA分

17、子受到较大范围的损伤，细胞对危急状态所作出的反应。,机制,引起DNA较长期的、广泛的突变。,SOS调节网诱导产生的DNA聚合酶特异性低，识别碱基能力差,使修复部位仍存在较多错配的碱基，但细胞能继续生存。,后果,第二节 RNA的生物合成,DNARNA 转录,RNARNA RNA复制,两种方式,存在于绝大多数生物体,存在于某些病毒体内,一、转 录,（一）概念,在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以DNA的模板链为模板，4种NTP为原料，按碱基配对规律(T-A,A-U,G-C)合成一条与模板链互补的RNA链的过程。,RNA聚合酶,常称为转录酶(transcriptase),其全称为：DNA依赖的RNA

18、聚合酶,(DNA-dependent RNA polymerase,DDRP),E.Coli的DDRP 由 5 个亚基组成,（二）参与转录的酶和有关因子,+因子,2(核心酶),2(全酶),表13-6 大肠杆菌RNA聚合酶亚基组成及其功能 类型 亚基/酶分子 主 要 功 能 2 决定哪些基因被转录,1 参与转录的全过程,1 与模板DNA结合 被利福平,1 识别转录起始点 被利福霉素,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,真核生物DDRP的种类与功能,种类 存在部位 转录产物 对鹅膏蕈碱 的敏感性,RNA聚合酶 核仁 45S rRNA

19、不敏感,RNA聚合酶 核质 hnRNA和snRNA 极敏感,RNA聚合酶 核质 tRNA和5S-rRNA 中度敏感,DDRP无3 5外切酶活性,有什么结果?,RNA聚合酶的主要功能,能识别并结合于DNA模板的启动子部位（真核生物还需要转录因子的帮助）解开转录起始点下游一小段(约 17bp)DNA双螺旋，产生单链模板;不需引物，催化形成第一个3,5-磷酸二酯键，沿 53方向延伸RNA链 能识别DNA模板上的转录终止信号(依赖于因子)在基因表达中，参与转录水平的调控,因子(Rho factor),功能,(1)能帮助 DDRP识别终止信号并停止转录,(2)具有ATP酶和解链酶活性，使RNA-DNA杂

20、化分子解链，从而释放转录产物RNA分子,3.转录的DNA模板,细胞内DNA不是其全长都可作为转录模板 DNA双链中，可作为模板转录成 RNA 的一条链，称为模板链(或反意义链)同一DNA双链中与模板链相对(互补)的一条链称为编码链(或有意义链)，可见转录是不对称的 模板链=反意义链=负链 编码链=有意义链=正链,为何称模板链为反意义链，编码链为有意义链？,可从下图理解：,GCA GTA CAT GTC 3 编码链,3 CGT CAT GTA CAG 模板链,DNA,转录,GCA GUA CAU GUC 3 mRNA,翻译,N 丙 缬 组 缬 C 肽,比较编码链和 RNA 链的碱基序列可见，除了

21、以代外，其余均一致。基因组序列均以编码链(正链)表示.,不对称转录的两方面含义：,模板链（含结构基因）,编码链,DNA 分子上的一条链可转录，另一条不转录 模板链并非永远在同一单链上,1.启动子（promoter）,RNA 聚合酶与模板DNA结合的特定部位，是基因转录的开始部位。,一般可分为 两类,DDRP 能直接识别的启动子,需蛋白质辅助因子的帮助，DDRP 才能识别的启动子,（四）启动子及终止信号,确保转录精确而有效地起始的DNA 序列,原核生物启动子的3个功能部位,转录起始点,常标以+1,第1个核苷酸为嘌呤核苷酸(A或G).上游或下游,+或-表示 结合部位,长度为7bp,位于-10bp处

22、,有一共有序列(-TATAAT-,Pribnow盒)RNA聚合酶的识别部位,由约6bp,位于-35bp,也有共有序列(-TTGACA-),原核生物启动子,真核生物启动子,2.终止信号(终止子),DNA分子中决定RNA聚合酶终止转录的特定碱基序列。,原核生物终止信号碱基组成特点,有反向重复序列,决定转录产物的回折形成茎-环(或称发夹)结构,AT富集区,GC富集区,AT富集区,GC富集区,一般认为由终止子引导的转录终止是不依赖因子的,(五)转录过程,起始 延长 终止,(以大肠杆菌的转录为例）,1.转录起始,形成转录空泡（DNA解链长约20bp),DDRP(亚基)辨认并结合于启动子部位,由DDRP催

23、化，头2 个NTP直接在起始点形成 第一个磷酸二酯键(不需引物，由模板指导),形成转录起始复合物,亚基脱落（参与下一轮转录）,由核心酶(2)催化链的延伸,第一个总是GTP,全酶(2)-DNA模板(启动子)-pppGpN-OH,5pppGpN,转录起始时pppGpN-OH的生成,起始,2.链的延长,转录起始时形成的“转录泡”仍保留 RNA链的延长由核心酶催化 核心酶沿模板链35方向移动，RNA链按碱基配对规律沿53方向延伸 新生链与模板链形成杂化双链(该杂化分子结构不稳定，RNA链游离后，DNA双链重新形成)随“转录泡”和DDRP不断移动(单链模板不断暴露)，转录连续不断地进行,要 点,3.转录

24、终止,依赖 因子的终止 不依赖于因子的终止,依赖 因子的 终止作用机理,作用机理：终止信号区特殊碱基 序列决定RNA形成发夹形二级结构，这是阻止转录继续向下游推进的关键；RNA-DNA杂化双链不稳定因素：DNA复性，RNA自身形成双链；RNA3端，连续多个不稳定的rU：dA 碱基配对，使转录复合体解体。,不依赖因子的终止,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-lo

25、op)/发夹(hairpin)结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,转录过程,二、真核生物的转录后修饰,几种主要的修饰方式,1.剪接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),一、真核生物mRNA的转录后加工,（一）首、尾修饰,5端形成 帽子结构(m7GpppGp)3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),帽子结构,5 pppGp,帽子结构的生成,（二）mRNA内含子的剪接 1.hnRNA 和 snRNA 核内的初级mRNA称为杂化核RNA(het

26、ero-nuclear RNA,hnRNA)snRNA(small nuclear RNA),真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,2.断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,目 录,

27、鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,目 录,3.内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因；II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,4.mRNA的剪接,套索剪接模式,(1)内含子两端的序列：5GUAG 35GU可结合U1-snRNA分支点A可结合U2-snRNA(2)U1-snRNA,U2-snRNA等形成并接体将内含子切除,（三）mRNA编辑(mRNA editing),RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。,二、tRNA的转录后加工,（一）剪接和剪切（二）3端添加CCA（三）化学修饰,（一）剪接和剪切,（三）化学修饰,三、rRNA的转录后加工,