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1、第十三章 RNA生物合成（RNA Biosynthesis）大连医科大学生物化学教研室 崔秀云,转录的特点真核生物RNA聚合酶及转录因子转录的转录过程：起始：（启动子），延长，终止转录后的加工：剪切，添加及修饰原核生物的转录,第一节 参加RNA合成的酶类与蛋白因子,一DNA指导的RNA聚合酶（DNA directed RNA polymerase，DDRP）是RNA合成中最主要的酶类,RNA聚合酶催化如下反应：1.双链DNA中的一条链作为RNA合成的模板。2四种核糖核苷三磷酸（即ATP、GTP、CTP和UTP）是该酶的底物。3 需要二价金属离子，如Mg2+和Mn2+。n(NTP)pppN(pN
2、)n+(n-1)PPi,DNA,RNA聚合酶,表13-1 真核生物RNA聚合酶的种类和性质,种类 I型（或A）II型（或B）III型（或C）线粒体（Mt型）分子量 5.5105 6105 6105 6.46.8104 分布 核仁 核质 核质 线粒体 转录产物 5.8S、18S、mRNA前体 tRNA前体 线粒体RNA 28S rRNA前体 5S rRNA对利福平 不敏感 不敏感 不敏感 敏感 敏感性对鹅膏蕈碱 不敏感 非常敏感 敏感 不敏感的敏感性,二转录因子,分类I 型转录因子（transcription factor I，TF l）能够促进RNA聚合酶 l 转录。Il 型转录因子（TF l
3、l）促进RNA聚合酶 ll转录.包括TFIIA，B，D，E，F，H等。III 型转录因子（TFIII）促进RNA聚合酶III 转录。,真核生物转录过程还需要一些蛋白质因子参与，这些因子能结合到DNA的特殊序列并且与RNA聚合酶结合,促进转录,这些蛋白因子称转录因子（transcription factors),三终止蛋白,终止蛋白能与RNA聚合酶结合，阻止RNA聚合酶越过终止信号而使转录终止。,第二节 真核生物的转录过程,一 转录的特点 RNA的合成与DNA的合成有相似之处，其合成的方向均为53,聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3,5-磷酸二酯键，使核苷酸链延长，同时释放出焦磷酸。,图13-1
4、 RNA链中3,5-磷酸二酯键的形成,RNA合成不同于DNA合成之处主要有：,1.RNA聚合酶不需要引物。2.RNA聚合酶没有核酸酶的活性，在RNA合成过程 不起校对作用。3转录是不对称的，即仅用DNA双链中某一条链作 为模板进行转录。有时是这条链的某区段，有时是 另一条链的某区域具有模板作用。通常将模板链称 为有意义链，将其互补链称为反意义链或编码链。4转录后DNA模板成分无改变。5.对于一个基因组来讲，转录只发生在一部分基因，而且每一个基因的转录都受到相对独立的控制。,二、真核生物的转录过程,（一）转录的基本过程 转录过程可分为三个阶段：起始、延长和终止。1起始阶段（initiation）
5、启动子（promoter）是DNA上的特殊的序列，它包括一些保守顺序，其中最重要的顺序称TATA(box)盒子。,图13-2 某些真核启动子区TATA保守序列真核生物一些启动子顺序，同源顺序用阴影表示.,兔-珠蛋白,小鼠-珠蛋白,图13-3 真核启动子区示意图 转录起始点以“+1”表示，在其上游的核苷酸序列以“”表示。启动子区框内表示与转录有关的保守顺序。,2.RNA链的延长（elongation）,（A)RNA聚合酶复合物识别DNA模板上的启动子序列，并与其结合。（B）RNA聚合酶在转录因子的辅助下，将双链DNA解开一段，形成转录泡。在聚合酶的作用下以NTP为底物，与模板链的碱基互补开始合成
6、RNA。（C）RNA聚合酶继续合成RNA，以U替代T，A-U、C-G配对。（D）随着RNA链的延长，RNA聚合酶沿着模板链不断滑动，直到遇到终止信号合成则停止。DNA双螺旋重新形成。,图13-4 RNA链的延长,a,3.RNA合成的终止（termination）,RNA生成后，暂时与DNA模板链形成DNA-RNA杂交体（长度约12个碱基对），此杂交体结合不紧密，RNA很容易从模板DNA上脱落。于是，DNA模板链与编码链又重新形成双链。DNA模板上的终止信号是由于DNA特殊的结构而起作用，此处DNA多存在着反向重复顺序。此区域容易形成发夹形结构，有助于转录的终止。5-GCCGCCAG-CTGGC
7、GGC-3 3-CGGCGGTC-GACCGCCG-5 DNA 反向重复顺序,（二）几种RNA的合成特点1mRNA的合成,2.rRNA的合成,rRNA基因位于染色体的特殊区域称核仁组织者（nucleolar organizer）。每一个转录单位包括28S，5.8S及18S rRNA。RNA 聚合酶I识别位于非转录间隔区上的启动子，其序列大约位于-40到+10和-150到-110。首先TFI结合到启动子上，为此，导致RNA 聚合酶I识别启动子。当RNA聚合酶I达到下一个转录单位的启动子时，转录便在非转录间隔区终止。,3.5S RNA 和tRNA的合成,第三节 转录后核糖核酸的加工过程,几乎所有真
8、核生物RNA转录的初级产物都需经过一系列变化后才能生成具有生物活性的RNA分子。这一系列变化过程称为转录后的RNA加工(RNA processing)。加工过程包括核苷酸部分水解、连接反应、末端核苷酸“戴帽”、“接尾”，以及核苷的修饰。,一、信使RNA的加工,真核生物mRNA的前体是核不均一RNA（heterogenous nuclear RNA,hnRNA），其核苷酸顺序中约有5075%不出现在成熟的mRNA中。此部分在转录产物的加工过程中被切除。被切除的部分称为内含子（intron）。内含子是不编码蛋白质的核苷酸序列。未被切除的部分称外显子(exon)，是编码蛋白质的部分。,图13-7 m
9、RNA的剪接机制 一些小核核蛋白（snRNP）与RNA前体形成剪接体（spliceosome）。U1 RNA和U2 RNA 分别为snRNP的组份。U1 RNA的核苷酸序列与 mRNA前体内含子中的GU顺序（称连接供体位点）相配对。U2 RNA识别内含子3端连接受体位点。拼接体利用ATP做能量，除去内含子。,图13-8 mRNA 5帽端的结构5端第一个核苷酸是7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸,第二个和第三个核苷酸的核糖2羟基甲基化。,mRNA加工:5端帽子结构,图13-9 mRNA的加工过程示意图,二.核糖体RNA的加工,45S,41S,28S,转录,图13-12 tRNA的加工示意图tRNA的初级转
10、录物被RNase P 和3外切核酸酶切除部分核苷酸。CCA末端是由tRNA核苷酸转移酶催化加入的。内含子被内切酶除去后，经连接酶连接为成熟的tRNA。,三.转移RNA的加工,一.原核生物RNA聚合酶 原核生物RNA聚合酶是多亚基的酶。从大肠杆菌提取的RNA聚合酶有五个亚基组成，分子量为500 000。两个亚基，一个亚基，和一个亚基组成核心酶（core enzyme），核心酶（2）能进行转录，但是没有RNA合成的特异性。第五个蛋白质亚基称因子，这五种亚基构成全酶（holoenzyme）,在体内及体外只有全酶（2）才能特异的合成RNA。因子参与识别特异的启动子。原核生物RNA聚合酶能被利福平（ri
11、fampicin）所抑制。利福平与亚基相结合，从而抑制酶的活性。,第四节 原核生物的转录,图13-13 细菌转录的启动子,二.原核生物的转录过程,图13-13 原核生物启动子区同源序列,图13-14原核RNA的转录过程圆圈表示RNA聚合酶的核心酶部分（2）。因子参与识别特异的启动子，它与核心酶一起结合到DNA模板的起始位置上。以NTP为原料，全酶催化合成RNA合成。当RNA链延长到大约10核苷酸时，因子从全酶上脱离，参与另外一次循环。核心酶沿着DNA模板移动，继续延长RNA链。当RNA聚合酶遇到了终止信号不能再继续前进，便在因子作用下与模板链脱离，RNA合成终止。核心酶参与另外一次循环。,图
12、13-15 RNA转录的终止(因子不依赖性的)A：DNA模板有特殊的序列，富含GC和AT区，反转重复顺 序（阴影所示）。B：RNA转录物可形成茎、环结构。,A,B,图13-16转录终止因子的作用因子是由6个亚基组成的蛋白质，它具有ATP酶的活性，能将RNA-DNA杂交双链解开，使RNA脱离模板，从而终止RNA转录。,图13-17 原核生物 rRNA的加工示意图,（四）转录后的加工原核生物转录与翻译过程是偶联的。即mRNA在转录过程中即进行翻译。原核生物mRNA初级转录物没有内含子，故没有剪接过程。核糖体RNA转录时即刻被剪切成23S及16S rRNA（图13-17）。tRNA也进行一些剪接及修
13、饰。,三、RNA的复制有些病毒或噬菌体的基因组是由RNA而不是由DNA组成的。病毒进入宿主细胞后，还可以进行复制生成RNA。催化此种RNA复制的酶为RNA复制酶，是一种RNA指导的RNA聚合酶(RNA directed RNA polymerase)。RNA复制酶催化的合成反应是以RNA为模板，由53方向进行RNA链的合成。反应机理与DNA作模板合成RNA反应相似。RNA复制酶仅对特异的病毒RNA起作用，对宿主细胞的RNA一般不进行复制。为此当病毒侵入宿主细胞后，病毒的RNA能大量复制。,多选题 A型题,1.RNA的生物合成见于RNA复制和 A.半保留复制 B.不对称转录 C.逆转录 D.翻译
14、 E.半不连续复制,多选题 A型题,2.转录需要的原料是:dNTPB.dNDP C.dNMP D.NTP E.NMP,多选题 A型题,3.真核细胞转录发生于:A.细胞浆 B.内质网 C.细胞核 D.线粒体 E.核蛋白体,多选题 A型题,4.转录需要:A.引物酶 B.RDRP C.DDDP D.DDRP E.RDDP,多选题 A型题,5.DNA模板链为 5-ATTCAG-3,其转录产物是:A.5-GACTTA-3 B.5-CTGAAT-3 C.5-UAAGUC-3 D.5-CUGAAU-3 E.5-TAAGTC-3,多选题 A型题,6.DNA复制和转录过程有许多相同点,下列描述哪项是错误的?A.
15、转录以DNA一条链为模板,而以DNA两条链为模板进行复制 B.在这两个过程中合成均为5-3方向 C.复制的产物通常情况下大于转录的产物 D.两过程均需RNA引物 E.DNA聚合酶和RNA聚合酶均需要Mg2+,多选题 A型题,7.关于启动子的描述,哪一项是正确的?A.mRNA开始被翻译的那段DNA序列B.开始转录生成mRNA的那段DNA顺序C.RNA聚合酶最初与DNA结合的那段 DNA顺序D.开始生成的mRNA顺序E.调节基因结合的部位,多选题 A型题,8.mRNA的转录后加工不包括:A.5端加入7-甲基鸟苷三磷酸 B.3端加poly A C.切除内含子,连接外显子 D.碱基修饰 E.加CCA尾
16、,多选题 A型题,9.原核细胞RNA聚合酶由以下亚基组成:A.B.C.D.E.,多选题 A型题,10原核RNA聚合酶亚基A.是核心酶的一部分B.与抗生素利福平相结合C.被-鹅膏蕈碱所抑制D.大多存在于转录的开始E.特异性识别启动子位点,多选题 A型题,11.下列有关真核生物初级转录物的论述是正确的，但除外A.通常比有功能的RNA长B.许多核苷酸序列不存在于有功能的RNA中C.全部不含有修饰的碱基D.可能含有一个以上的RNA信息E.含有TATA盒子,多选题 A型题,12.下列参与转移RNA的加工，但除外，A.在5末端加入甲基化的鸟苷B.从3及5端均出去多余的碱基C.核苷酸序列特异的碱基甲基化D.
17、有时从反密码环去掉内含子E.通过核苷酸转移酶的作用加入CCA顺序,B 型题,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶1.催化逆转录过程需要:,B 型题,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶2.催化转录过程需要:,B 型题,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶3.促进细胞增殖需要:,B 型题,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶4.催化RNA病毒需要:,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶5.催化转录的RNA链5-3延伸需要:,B 型题,B 型题,A.
18、HnRNA B.mRNA C.rRNA D.snRNA E tRNA6.哪一种RNA修饰的百分比最多？,B 型题,A.HnRNA B.mRNA C.rRNA D.snRNA E tRNA7.哪一种稳定存在的RNA从重量看在细胞中百分比最多？,B 型题,A.HnRNA B.mRNA C.rRNA D.snRNA E tRNA8.哪一种RNA既含有7-甲基鸟苷三磷酸，又含有多聚腺苷酸的末端？,多选题A型答案,1.RNA的生物合成见于RNA复制和 B.不对称转录 即仅用DNA双链中某一条链作为模板链进行转录。有时是这条链的某区段，有时是另一条链的某区域具有模板作用。通常将模板链称为反(意)义链，将其
19、互补的另一条链称为有(意)义链或编码链。,多选题A型答案,2.转录需要的原料是:D.NTP（核苷三磷酸）RNA聚合酶需要以四种核苷三磷酸，即ATP，GTP，UTP和CTP为原料。RNA的合成反应是一个消耗能量的过程，释放出焦磷酸驱动反应的进行。,多选题A型答案,3.真核细胞转录发生于:C.细胞核 RNA转录是以DNA为模板，在DNA指导的RNA聚合酶催化下进行的。DNA位于细胞核内，故转录发生在细胞核内。,多选题A型答案,4.转录需要:D.DDRP DNA指导的RNA聚合酶（DNA directed RNA polymerase，DDRP）是RNA合成中最主要的酶类。,多选题A型答案,5.DN
20、A模板链为 5-ATTCAG-3,其转录产物是:D.5-CUGAAU-3 RNA转录物与DNA模板的碱基互补，而且方向相反，U取代T 与A配对。,多选题A型答案,6.DNA复制和转录过程有许多相同点,下列描述哪项是错误的?D.两过程均需RNA引物 DNA复制需要引物，RNA转录不需要引物，故这两个过程均需RNA引物是错误的。,多选题A型答案,7.关于启动子的描述,哪一项是正确的?C.RNA聚合酶最初与DNA结合的那段DNA顺序 转录开始时，RNA聚合酶结合于DNA模板的特定部位，此部位称启动子区。启动子（promoter）是DNA上的特殊的序列,多选题A型答案,8.mRNA的转录后加工不包括:
21、E.加CCA尾 tRNA 3-末端的CCA顺序是转录后加上去的。mRNA的3末端是多聚A，而不包括加CCA尾。,多选题A型答案,9.原核细胞RNA聚合酶由以下亚基组成:B.这五种亚基构成全酶核心酶的组成为（2）,多选题A型答案,10原核RNA聚合酶亚基E.特异性识别启动子位点 RNA转录起始时，因子参与识别DNA模板上特异的启动子，它与核心酶一起结合到DNA模板的起始位置上。以NTP为原料，全酶催化合成RNA合成。当RNA链延长到大约10核苷酸时，因子从全酶上脱离，参与另外一次循环。,多选题A型答案,11.下列有关真核生物初级转录物的论述是正确的，但除外E.含有TATA盒子 此盒子是位于DNA
22、上启动子区的特殊序列，它不是RNA初级转录物的组分。,多选题A型答案,12.下列参与转移RNA的加工，但除外，A.在5末端加入甲基化的鸟苷 tRNA的加工过程中5末端要切除一些核苷酸。在mRNA的加工中5端加入甲基化的鸟苷。,多选题B型答案,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶1.催化逆转录过程需要:C.RDDP（RNA directed DNA polymerase)即RNA指导的DNA聚合酶,多选题B型答案,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶2.催化转录过程需要:B.DDRP（DNA directed DNA polymeras
23、e)即DNA指导的DNA聚合酶,多选题B型答案,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶3.促进细胞增殖需要:A.DDDP（DNA directed DNA polymerase)即DNA指导的DNA聚合酶,多选题B型答案,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶4.催化RNA病毒需要:D.RDRP（RNA directed RNA polymerase)即RNA指导的RNA聚合酶,多选题B型答案,A.DDDP B.DDRP C.RDDP D.RDRP E.核心酶5.催化转录的RNA链5-3延伸需要:E.核心酶在原核生物中RNA聚合酶的核心酶
24、在RNA链的延伸过程中起作用。两个亚基，一个亚基，和一个亚基组成核心酶（2）。,多选题B型答案,A.HnRNA B.mRNA C.rRNA D.snRNA E tRNA6.哪一种RNA修饰的百分比最多？E tRNA 所有核酸中，tRNA分子是高度甲基化的。大约有60多种碱基及核糖被修饰。,多选题B型答案,A.HnRNA B.mRNA C.rRNA D.snRNA E tRNA7.哪一种稳定存在的RNA从重量看在细胞中百分比最多？C.rRNA rRNA的稳定性对核糖体的重复功能是必须的.,多选题 B型 答案,A.HnRNA B.mRNA C.rRNA D.snRNA E tRNA8.哪一种RNA
25、既含有7-甲基鸟苷三磷酸，又含有多聚腺苷酸的末端？B.mRNA 在真核生物mRNA的加工过程中既含有7-甲基鸟苷三磷酸，又含有多聚腺苷酸的末端。这种加工对mRNA的功能是必须的.,历史故事,一.断裂基因的发现1977年，在寒春港会议上，来自寒春港实验室的罗伯茨（Richarl J.Roberts）和麻省理工学院癌症研究中心的夏普（Pilip A.sharp）报道了他们关于真核生物断裂基因的发现。因为这一发现，他们分享了1993年诺贝尔生理医学奖,英国科学家，因发现断裂基因于1993年获诺贝尔奖,罗伯茨（Richarl J.Roberts）1943年出生于英格兰的得拜。1968年获得谢菲尔大学的
26、哲学博士学位。（生物化学专业），其后，他到美国哈佛大学做博士后。他曾在桑格实验室做过短期访问。学习RNA指纹技术和测序技术。1972-1992年，他在寒春港实验室工作。他对腺病毒Ad2进行了精细的研究。罗伯茨与其同事在实验室里分离和鉴定了许多限制酶。并用这些酶作Ad2 DNA限制酶图谱。1974年，他们对这些片段进行测序。其中有一个小片段包含Ad2 mRNA的末端和一个启动子。正是对这个包含启动子片段的搜索，导致对RNA剪切及断裂基因的发现。可以说，断裂基因的发现是罗伯茨测序研究的意外发现,美国科学家，因发现mRNA的剪接于1993年获诺贝尔奖,夏普于（Pilip A.sharp）1944年出
27、生在美国肯塔基州。60年代，他获得肯塔基联合学院的文学士学位（化学与数学专业）。而后获得伊利诺伊大学博士学位。他先后在加州理工学院的戴维森和寒春港实验室watson(沃森)手下做过博士后。1974年，他来到麻省理工学院的癌症研究中心。他集中于肿瘤病毒的分子生物学和RNA剪接研究。夏暜关注腺病毒的基因表达过程。他想看看hnRNA和 mRNA有什么不同。他利用DNA和RNA杂交的方法找到了二者的不同。他们发现hnRNA明显长于mRNA.mRNA不能与DNA全部杂交。在电子显微镜下发现有三个环。这表明mRNA比DNA小了许多；一个连续的DNA分子包含了没有反映在mRNA中的信息。夏普认为hnRNA中
28、的内含子片断被切除，而外显子片断拼接起来。断裂基因的发现揭示了真核生物不同于原核生物。其次，这一过程体现了生物进化中的自然选择机制的美妙。第三，它成为生物研究的一个重要生长点。为此。他们获得了1993年诺贝尔奖。,霍利1922年出生于美国伊利诺斯州。1942年，他以优异成绩毕业于伊利诺斯大学。1947年在康内尔大学获有机化学博士学位。霍利在研究tRNA之前，就已经取得了不少优秀成果。例如分离青霉素结晶。首先合成苄基青霉素，分析了植物生长素吲哚乙酸。首次合成组氨酰肽等等。1957-1964年，霍利在美国农业部纽约州伊太卡“植物、土壤和营养实验室工作。1964年，他受聘于康内尔大学生物化学和分子生
29、物学教授。从1957年起，他的研究方向便集中精力在细胞内蛋白质和核酸的分析及其合成方面。由于tRNA是核酸中分子最小、结构最简单的一种，因此他首先选择这种核糖核酸。1957年，他从大鼠肝脏分离和鉴定出各种携带不同氨基酸的tRNA。并发现所有的氨基酸首先要和ATP结合。形成有活性的氨基酸后才能与相应的tRNA结合。然后，他应有重组实验，将从酵母提取的并浓缩500倍的活性的丙氨酸，与其相应的微量的tRNA结合起来。发现它们的结合能力很高。为了深入研究tRNA在蛋白质合成中的作用，1963年霍利从100磅酵母中提取出65克tRNA。利用各种分离技术，最终得到了高纯度的酵母丙氨酸tRNA。并分析了全部化学结构。为此，1968年，霍利获得诺贝尔奖。,二.转移核糖核酸的发现,
