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1、第10章,DNA的生物合成DNA Biosynthesis(Replication),复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,本章主要内容：,复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程 逆转录和其他复制方式 DNA损伤（突变）与修复,复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinuous replica
2、tion),复制的基本规律,一、半保留复制是DNA复制的基本特征,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGC
3、CACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,密度梯度实验:,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义:,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向
4、复制,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leading strand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(laggi
5、ng strand)。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,参与DNA复制的物质:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。,一、核
6、苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应的特点:,DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行。,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：,1.53 的聚合活性2.核酸外切酶活性,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,原核生物
7、的DNA聚合酶,功能：,DNA-pol（109kD）,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能：,DNA-pol(250kD),是原
8、核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,真核生物的DNA聚合酶,三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。,（一）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是
9、指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,DNA pol 的校读功能,（二）复制的保真性依赖正确的碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：,四、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑
10、学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,E.Coli 基因图,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链,复制过程正超螺旋的形成：,解链过程中正超螺旋的形成,既能水解、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶 拓扑异构
11、酶,拓扑异构酶分类：,拓扑异构酶作用特点：,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制：,拓扑酶的作用方式：,五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连
12、接酶的作用：,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,DNA生物合成过程The Process of DNA Replication,第 三 节,（一）复制起始：DNA解链形成引发体,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,1.DNA解链,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2
13、.引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,随从链的合成,同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(t
14、er)处汇合。,（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口,随从链上不连续性片段的连接：,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,（一）真核生物复制的起始与原
15、核基本相似,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期
16、蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。,哺乳类动物的周期蛋白和CDK,哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点(check point)蛋白。,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol，继
17、续合成DNA子链。,（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,真核生物复制叉的延长：,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,切除引物的两种机制,线性DNA复制的末端,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,端粒的功能：,维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性,端粒的结构特点：,由末端
18、单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),组成：,端粒酶催化作用的爬行模型,逆转录和其他复制方式Reverse Transcription&Other DNA Replication Ways,第四节,双链DNA是大多数生物
19、的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如M13噬菌体，它的感染型只含单链DNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),逆转录酶,一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录,RNA,DNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recomb
20、ination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,二、逆转录的发现发展了中心法则,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。
21、,滚环复制(rolling circle replication),三、噬菌体DNA按滚环方式复制和线粒体DNA按D环方式复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,D-环复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。,
22、DNA损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)&Repair,第五节,DNA突变具体指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变在生物界普遍存在,（一）突变是进化、分化的分子基础,从长远的生物史看，进化过程是突变的不断发生所造成的。大量的突变都是属于这种类型，只是目前还未能认识其发生的真正原因，因而名为自发突变或自然突变(spontaneous mutation)。,（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性,这种突变没有可察觉的表型改变，例如在简并密码
23、子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。这些现象也相当普遍。多态性(polymorphism)一词用来描述个体之间的基因型差别现象。,（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（四）突变是某些疾病的发病基础,二、多种化学或物理因素可诱发突变,大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变的因素，主要有物理和化学因素。,物理因素：紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射,化学因素：,三、引起突变的分子改变类型有多种,错配(mismatch)缺失(deleti
24、on)插入(insertion)重排(rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某一碱基的置换。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。,（一）错配可导致编码氨基酸的改变,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,镰形红细胞贫血病人,图10-29膀胱癌细胞c-ras H基因点突变，基因表达产物仅12号氨基酸的变异,（二）缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子
25、中间。缺失或插入都可导致框移突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失引起框移突变：,（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型：,DNA损伤（突变）可能造成两种结果：其一是导致复制或转录障碍（如胸腺嘧啶二聚体，DNA骨架中产生切口或断裂）；其二是导致复制后基因突变（如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶），使DNA 序列发生永久性改变。所以，必须通过进化使细胞拥有灵敏的机制，以识别和修复这些损伤，否
26、则细胞无法维持正常代谢。,四、DNA损伤的修复有多种类型,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,错配修复(mismatch repair)直接修复(direct repair)光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型：,（一）直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤,光修复酶(photolyase),UV,（二）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形,这是细胞内最重要和有效的修复方式。其过程包括去除损伤的DNA，填补空隙
27、和连接。主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即参与转录偶联修复(transcription-coupled repair)。转录偶联修复的意义在于，将修复酶集中于正在转录的DNA，使该区域的损伤尽快得以修复。,（三）重组修复,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,
