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1、第9章 核酸的酶促降解和核苷酸代谢,第一节 核酸的酶促降解第二节 核苷酸的分解第三节 核苷酸的合成,核酸酶实质是磷酸二脂酶。根据酶对底物的专一性分为：核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、非特异性核酸酶。根据酶的作用方式分：内切酶、外切酶。,第一节 核酸的酶促降解,核酸酶 核酸 核苷酸,3、5-磷酸二酯键,一、核糖核酸酶,只水解RNA磷酸二酯键的酶（RNase）,牛胰核糖核酸酶I（RNaseI），作用位点是嘧啶核苷-3-磷酸与其它核苷酸间的连接键。（内切核酸酶）核糖核酸酶T1（RNaseT1），作用位点是3-鸟苷酸与其它核苷酸的5-OH间的键。（内切核酸酶）,只能水解DNA磷酸二酯键的酶。牛胰脱氧核糖核
2、酸酶（DNase）：可切割双链和单链DNA，降解产物为3-磷酸为末端的寡核苷酸。限制性核酸内切酶：细菌产生的、能识别并特异切割外源DNA特定序列中的磷酸二脂键(对碱基序列专一）的核酸内切酶。,二、脱氧核糖核酸酶,限制性内切酶类型,I型：识别位点与切割位点相差甚远,型：切割位点位于识别位点上，产物为专一性片段。,型：识别位点为5-7bp的非对称序列，切割位点在顺序之外离识别序列5-10bp,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,限制修饰,多功能,单功能,双功能,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,辅助因子,ATP Mg2+SAM,ATP Mg2+SAM,Mg2
3、+,识别序列,TGAN8TGCT,回文序列,GAGCC,AACN6GTGC,CAGCAG,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象,(K),大肠杆菌B,大肠杆菌K,1,1,410 4,10 4,E.O.P 成斑率efficiency of plating,宿主的限制和修饰现象,限制修饰的酶学假说,酶切位点不被修饰,噬菌体DNA被切割,酶切位点被修饰,基因组DNA不被切割,1968年，Meselson 和Yuan发现了I型限制性核酸内切酶1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中
4、分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶Hind II,限制性核酸内切酶的类型,首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,1.I型限制性内切酶,如 EcoB和 EcoK,未甲基化修饰的特异序列。,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,（3）作用机理,在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分
5、离出来分离的第一个酶是Hind。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。,2.II 类限制性内切酶,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,识别位点处。,（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：,5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCAG,3端凸出（如Pst I切点）,GACGTC,5-,
6、-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,3.III类限制性内切酶,在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,用途不大。,EcoP1:AGACC,EcoP15:CAGCAG,限制性内切酶的命名和意义,Eco R I,序号,属名,种名,株名,例：Eco R I是从大肠杆菌（E.coli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶,限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。,产生3-OH和5-P的末端,限制性内切酶,既
7、可水解RNA，又可水解DNA磷酸二酯键的核酸酶。小球菌核酸酶（内切酶），可作用于RNA或变性的DNA，产生3-核苷酸或寡核苷酸。蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶（外切酶）。,三、非特异性核酸酶,蛇毒磷酸二酯酶能从RNA或DNA链的游离的3-OH逐个水解，生成5-核苷酸。牛脾磷酸二酯酶从游离的5-OH开始逐个水解，生成3核苷酸。,第二节 核苷酸的降解,一、核苷酸的降解,一、核苷酸的降解,1、核苷酸酶（磷酸单脂酶）水解核苷酸，产生核苷和磷酸。,2、核苷磷酸化酶,广泛存在，反应可逆,不同生物降解的产物不同,二、嘌呤的降解,（人类和灵长类动物）,（灵长类以外的哺乳动物）,尿囊酸酶,H2O,脲酶,2H2O
8、,4NH3+2CO2,乙醛酸,尿素,尿囊酸,（植物）,（鱼类、两栖类）,（海洋无脊椎动物）,三、嘧啶的降解,脱氨 还原 水解,一、嘌呤核苷酸的生物合成,从头合成途径,补救途径,二、嘧啶核苷酸的生物合成,从头合成途径,补救合成途径,第三节 核苷酸的生物合成,三、脱氧核苷酸的合成,（1）嘌呤环上各原子的来源,一、嘌呤核苷酸的生物合成（AMP、GMP),合成嘌呤核苷酸，先合成IMP，再转化为AMP、GMP。,1、从头合成,IMP的合成是从5-磷酸核糖开始的，先于ATP反应生成5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），然后嘌呤环的各原子在PRPP的C-1位置上逐渐加上去。,（2）IMP的合成,5-P核糖,
9、ATP AMP,5-P核糖-1-焦磷酸,IMP,9,4,5,7,8,3,6,1,2,川,IMP的合成是从5-磷酸核糖开始的，先于ATP反应生成5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），然后嘌呤环的各原子在PRPP的C-1位置上逐渐加上去。,5-磷酸核糖+CO2+甲川THFA+甲酰THFA+2Gln+Gly+Asp+5ATP IMP+2THFA+2Glu+延胡索酸+4ADP+1AMP+4Pi+PPi,总反应式：,（3）IMP转变为GMP和AMP,2、补救途径(利用已有的碱基和核苷合成核苷酸),(1)磷酸核糖转移酶途径（重要途径）,腺嘌呤在核苷磷酸化酶作用下转化为腺嘌呤核苷，后者在腺苷激酶的作用下与A
10、TP反应，生成腺嘌呤核苷酸。,2、核苷激酶途径（生物体内只发现有腺苷激酶）,与嘌呤核苷酸合成不同，在合成嘧啶核苷酸时，首先合成嘧啶环，再与磷酸核糖结合，生成尿嘧啶核苷酸，最后由尿嘧啶核苷酸转化为胞嘧啶核苷酸。,二、嘧啶核苷酸的合成,1、从头合成,（1）嘧啶环上各原子的来源,氨甲酰磷酸,（2）尿嘧啶核苷酸的合成,尿嘧啶核苷三磷酸可直接与NH3（细菌）或Gln（动物）反应，生成胞嘧啶核苷三磷酸。,UMP+ATP,尿嘧啶核苷酸激酶Mg2+,UDP+ADP,UDP+ATP,核苷二磷酸激酶Mg2+,UTP+ADP,CTP合成酶,UTP+Gln（NH4+）+ATP+H2O,CTP+Glu+ADP+Pi,（
11、3）胞嘧啶核苷酸的合成,嘧啶碱与1-磷酸核糖生成嘧啶核苷，然后由尿苷激酶催化尿苷和胞苷形成UMP和CMP。,嘧啶碱+1-磷酸核糖,核苷磷酸化酶,嘧啶核苷+Pi,尿苷（胞苷）+ATP,尿苷激酶Mg2+,UMP（CMP）+ADP,（2）磷酸核糖转移酶途径（胞嘧啶不行）,尿嘧啶磷酸核糖转移酶,尿嘧啶+5-PRPP,UMP+PPi,2、补救途径,（1）嘧啶核苷激酶途径（重要途径）,嘌啶核苷酸与嘧啶核苷酸合成的比较,相同点,1.合成原料基本相同,嘌啶核苷酸,嘧啶核苷酸,2.都有从头和补救途径,3.先合成有关的核苷酸,再合成核苷酸。,不同点,1.在5-P-R基础上合成嘌呤环,2.最先合成的核苷酸是 IMP
12、,3.在IMP基础上完成AMP和GMP的合成,1.先合成嘧啶环再与5-P-R结合,2.先合成UMP,3.以UMP为基础,完成CTP,TMP的合成,脱氧核糖核苷酸是由相应的核糖核苷酸衍生而来的。,三、脱氧核苷酸的合成,核糖核苷酸还原酶,二、核苷酸的生物合成,3、脱氧核糖核苷酸的生物合成,核糖核苷酸还原需要二个氢，其最终的给体是NADPH,硫氧还蛋白,谷氧还蛋白,（1）核糖核苷酸的还原反应,NADP+,NADPH+H+,硫氧还蛋白还原酶,FAD,核糖核苷酸还原酶（B1和B2）,ATP、Mg2+,ADP、GDP、CDP、UDP,腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶核糖核苷酸经还原，将核糖第二位碳原子的氧脱去，即成为相应的脱氧核糖核苷酸。还原反应一般在核苷二磷酸（NDP）水平上进行,由尿嘧啶脱氧核苷酸（dUMP）经甲基化生成。Ser提供甲基，NADPH提供还原当量。,（2）胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成,H,四氢叶酸是一碳的载体，参与嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成。氨基蝶呤、氨甲蝶呤是叶酸的类似物，能与二氢叶酸还原酶不可逆结合，阻止FH4的生成，从而抑制FH4参与的一碳单位的转移。,三、核苷酸合成总结,
