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1、植 物 学 报 1998 , 40 (2) :95101Act a Bot a nica Si nica综述 Revie w被子植物离体受精与合子培养研究进展杨弘远周嫦( 武汉大学生命科学学院 武汉 430072)关键词 被子植物 ,离体受精 ,合子培养 ,发育生物学RECENT AD VA NCES I N I N V I T R O FERTIL IZATIO NA ND ZY GOTE CUL TURE OF A NGIOSPERMS YAN G Ho ng2YuanZHOU Chang( Col lege of L i f e S cience , W u ha n U ni vers
2、i t y , Wuhan 430072)Abstract The successf ul i n v i t ro fertilizatio n and zygote cult ure in angio sper ms is t he mo stimpo rtant breakt hro ugh in t he experimental researches o n sexual plant rep ro ductio n during recent years. The p resent review includes t he following part s : 1) A brief
3、survey o n t he his2 to rical backgro unds and technical p rerequisites of t he achievement s. 2) Pro gresses of manip u2 latio n techniques ,including met ho ds of egg cell isolatio n ,intergametic f usio n , microcult ure of artificial as well as nat ural zygotes and regeneratio n of plant s , i n
4、 v i t ro develop ment f ro m f u2 sio n p ro duct s bet ween gametes of alien species ,f ro m unfertilized egg cells and f ro m cent ral cells ,etc. 3) Cyto biological and molecular biological st udies o n i n v i t ro fertilizatio n systems , e . g. time table of develop mental event s during i n
5、v i t ro fertilizatio n and po stfertilizatio n p ro2 cesses ,cell wall fo r matio n of artificial zygotes in relatio n to polysper my p reventatio n ,egg cell activatio n ,zygote polarit y and asymmet ric divisio n of zygotes ,co nst ructio n of cDNA libraries f ro m egg cells ,zygotes and early em
6、bryo s using R T/ PCR technique and screening of specific genes ,and t ransient exp ressio n of repo rter genes int ro duced into isolated zygotes. 4) St rate2 gies fo r f urt her broadening and deepening t he researches in t his area bot h in f undamental and applied aspect s. It is hopef ul t hat
7、i n v i t ro fertilizatio n and zygote cult ure will bring new light s in t he develop mental biology of fertilizatio n and early embryogenesis and open up new p ro spect s fo r biotechnology in plant s.Key words Angio sper ms , I n v i t ro fertilizatio n , Zygote cult ure , Develop mental biology历
8、史背景自从 19 世纪末发现被子植物双受精现象以来 ,关于植物受精的研究大致沿三个方向发展 : ( 1) 细胞 胚胎学方向 ,由早期的石蜡切片 、光镜观察发展到 60 年代以后的以超微结构研究为主 。80 年代以来进 一步采用三维重构 、图象分析等精密方法 ,揭示了雄性与雌性生殖单位 、精细胞二型性 、偏向受精等新现 象1 3 。(2) 生理学方向 ,早期主要是研究传粉 、受精前后花器生理变化 ,以后着重花粉与雌蕊组织间的 识别反应 ,80 年代以后开始探索配子间的识别等生理 、生化机理4 。( 3) 实验胚胎学方向 ,应用离体培 养方法在人工控制的条件下研究受精和受精后的发育 ,从 60 年
9、代开始 ,至 90 年代实现了重大的飞跃 , 并由此推动了整个受精与胚胎发生的发育生物学研究 。本文重点综述这后一研究方向的新进展 。160 年代开始成功的离体受精 ,当时称为试管受精 ,实际上是在胚珠 ( 或柱头) 上授粉 ,然后通过胚珠或子房培养完成受精和胚胎发育 ,形成有萌发力的种子 。这样的受精仍然处于胚珠以至子房的孕育下 , 只能认为是离体受精研究的初级阶段 ,近来多数文献改称为离体授粉 。90 年代成功的精 、卵离体融合 , 才是严格意义上的离体受精 。由体内受精到离体授粉再到真正的离体受精 ,标志着人类对植物受精的 实验控制能力不断提高 。现在不仅可以像动物体外受精那样 ,在离体
10、环境中完成被子植物精 、卵融合 , 而且还可以将受精所产生的“人工合子”培养再生植株 ,做到整个受精与胚胎发育过程完全在离体条件 下完成 。这样一种实验系统的建立无论在基础研究与高新技术研究上均有重大意义 。因此 ,把离体受 精的成功看作植物受精研究史中的重要里程碑是毫不夸张的 。离体受精的突破有其学术思想背景与实验技术前提 。近 10 多年 ,随着雌 、雄配子分离技术的成熟 , 研究者们预见到配子离体融合指日可待 ,提出了开展这一研究的设想5 ,6 。到 80 年代后期 ,精 、卵离体 融合的思路在国际上已经很明朗了 ,同时实现这一工作的技术前提也已具备了 。Kranz 等7 ,8 把握了这
11、 一机遇 ,利用前人多方面的研究成果加以综合 ,在玉米上作出了首次突破 。他们的成功是依靠三项技术 前提 : (1) 雌 、雄配子分离技术 。不少实验室在 80 年代均建立了此项技术6 ,9 ,10 , 其中包括玉米精细胞11 13 和卵细胞14的分离 。(2) 单对原生质体融合技术 。由于分离的卵细胞数目有限 ,很难将一般原生质体群体融合的方法用于精 、卵离体融合 ,而微机操纵的单对原生质体微电融合技术15 则可有目的地挑选一对原生质体进行融合 。(3) 微培养技术 。由于同样的理由 ,精 、卵融合产物的数目有限 ,不可能 采用常规的原生质体群体培养方法 ,而必须依靠单个或微量原生质体培养技
12、术 ,其中微滴培养法是比较 有效的16 ,以后又进一步改进 ,采用了商品生产的微室 ( millicell) ,将被培养的细胞置于微室中 ,通过室 底的微孔滤膜吸取周围饲养细胞的活性成分 ,这种微室饲养法更有利于培养对象的持续发育而被用于 玉米“人工合子”的培养8 。总之 ,被子植物离体受精之所以直到 90 年代方才成功 ,是建立在近 10 多年 来几方面的研究基础之上的应运而生的结果 。操作技术的研究进展如前所述 ,植物离体受精包括三项技术基础 ,即配子分离 、单对配子融合与人工合子的培养 ,这也是 整个实验操作系统中的先后三个主要环节 。211 卵细胞分离技术关于精细胞分离技术可参阅前节所
13、引证的文献 ,此处不赘 。卵细胞分离相对困难 。玉米离体受精 程序中所成功使用的方法是 :切取包含胚囊的胚珠部分 ,经酶处理约 30 min 使之软化 ,然后用细玻璃针 从其中解剖出卵细胞 。在 2 h 内可由 100 枚胚珠中获得 2025 个卵细胞 ,供 1 d 融合实验所需17 。大 麦与小麦自然合子培养中成功使用的卵和合子分离方法 ,则是不经酶处理的解剖技术 ,其特点是以镊尖 由胚珠的准确部位刺入中央细胞 ,引起后者膨压剧变致使卵细胞逸出 。在 90 min 内 ,由 20 个子房可解 剖出 15 个卵或合子 ,频率高达 75 %18 。以上两种方法的共同点是其最终步骤均依靠手工解剖
14、,但在是 否经过酶解预处理上有差别 。最近 ,在玉米受精后胚囊培养中 ,就酶解步骤的影响作了专门实验 ,结果 表明即使微量和极短暂 (2 min) 的酶处理 ,均有害于胚囊的存活并导致以后发育异常19 。关于酶处理 有害的论断似乎还需要更充分的实验证明 ,但尽量在卵细胞分离过程中减少酶的影响是值得注意的 。212 精 、卵融合技术在精 、卵融合实验中迄今共试验了四种融合技术 : ( 1) 微电融合 。这是 Kranz 等7 ,8 最早进行玉米 精 、卵融合取得成功的方法 ,融合率高达 85 % ,以后一直有效地加以沿用 。迄今仍然只有用这种方法融 合的产物再生了植株 。但此法依赖特制的自动化操
15、作系统 ,尚未在国际上推广 。另一个问题是 :强制性 的电融合作为细胞工程手段是适用的 ,但不适用于研究受精的机理 。( 2) 高钙2高 p H 介导融合 。Kranz2与 L rz20进一步尝试了在高钙 (0 . 05 mol/ L CaCl2 ) 与高 p H (11) 的条件下介导玉米精 、卵融合 ,融合产物培养成含 3050 个细胞的微愈伤组织 。作者的本意是探索一种能借以研究受精机理的方法 。然而 ,高2 期杨弘远等 : 被子植物离体受精与合子培养研究进展97钙 、高 p H 这种化学诱导方法未必能模拟受精的自然条件 ,仍然带有人为强制的特点 。(3) 一般钙条件下的融合 。Faur
16、e 等21 在一般含钙介质中观察玉米配子间与配子 、体细胞间的融合情况 ,发现在 5 mmol/ L CaCl2 条件下 ,精 、卵在数分钟内粘贴 ,然后在 10 s 的瞬间融合 ,融合率高达近 80 % ,而其它组合的融合 率则很低甚至完全不融合 ,认为这表明雌 、雄配子间确有互相识别的能力 。可惜这种融合产物的发育前 途却不清楚 。(4) P E G(聚乙二醇) 诱导的融合 。P E G 是原生质体融合最常用的诱导剂 ,但一般用于原生 质体群体内的融合 ,具有随机 、不定向的特点 ,融合后的异核体混杂于大量未融合的原生质体和同核体 群体内 ,筛选也很麻烦 。孙蒙祥等22 ,23 对这一常规
17、方法加以改进 ,创建了 P E G 诱导单对原生质体融合 技术 ,用微吸管挑选一对原生质体置于 P E G 微滴内使之融合 ;以后又应用这一方法实现了包括雌 、雄性 细胞在内的多种组合成对融合 。此法无需采用价格高昂的显微操作与微电融合设备即可有目的地选择 单对性细胞进行融合 ,是一种便于推广的简易方法 。但精 、卵融合产物的培养前途仍不清楚 。此外 ,和 电融合一样 , P E G 法在细胞工程上是有价值的 ,但也不适宜于受精机理的研究 。213 合子培养与植物再生精 、卵离体融合产生的“人工合子”和由体内直接分离的自然合子 ,现均已培养成植株 。这是植物胚 胎培养技术由成熟胚培养到幼胚培养
18、再到原胚培养不断深化的必然趋势 。成功的关键在于采用了有效 的饲养系统 。首先成功的是玉米人工合子培养 ,将微量人工合子置于微室中 ,以玉米悬浮细胞作为饲养 物 ,合子分裂率高达 79 % ,并发育为多细胞结构8 。以后进一步报道玉米品种间精 、卵融合产物经胚胎 发育途径 (偶而经多胚发育或器官发生途径) 再生植株 ,自融合开始 100 d 内达到开花 。11 株的根尖染 色体均为 2n ;植株正常结实 ,穗部具双亲中间颜色性状 ;种子胚乳颜色表现 31 分离 ,与有性杂交的规律一致24。除玉米外 ,小麦精 、卵融合25 ,玉米卵细胞分别与高梁 、薏苡 、小麦 、大麦等禾本科植物的精细胞融合
19、,以及玉米卵细胞与玉米悬浮培养细胞原生质体等多种融合组合的产物26 ,亦均培养到多细胞阶段 。但玉米卵细胞分别与油菜精细胞 、玉米卵细胞 、玉米珠心细胞等组合的融合产物则不能分裂26 。以上表明 ,禾本科的属间离体受精似无困难 ,而科间融合或非雌 、雄配子间的融合产物则难以发育 。由于缺乏遗传学鉴定 ,目前还不能对属间离体受精的结果作出评价 。关于自然合子培养 ,在其成功前不久曾报道含合子的玉米胚囊培养再生植株27 ,28 。然而所培养的 还不是完全分离的胚囊 ,而是带有或多或少的珠心组织 ,实际上介于胚珠培养与胚囊培养之间 ,尽管较 近的一篇报道中 ,包围胚囊的珠心组织已减少到可以依稀透视合
20、子的程度29 。真正的合子培养是由 Holm 等18 实现的 :用解剖法由大麦和小麦胚珠中直接分离出卵细胞和合子原生质体 。卵细胞培养未 能启动分裂 ,而合子在大麦小孢子饲养下发育成胚状结构 ,频率高达 75 % ,其中约 50 %胚状体再生为可 育植株 。实验材料中包括在花药培养中反应迥异的品种 ,但其在合子培养中再生植株频率相近 ,似乎表 明基因型对培养结果影响不大 。小麦的合子在大麦小孢子饲养下也再生了一个可育植株 。迄今无论人工合子或自然合子培养的实验均局限于禾本科植物 。在双子叶植物中 ,仅在烟草中开 展了合子培养试验 :用酶解2研磨法从烟草受精后胚珠中分离出胚囊 ,再由胚囊分离合子
21、 ,以叶肉原生质 体作饲养物 ,在微室中培养合子启动了第一次分裂30 。随后在 64 个微室中培养了 242 个合子 ,进一步 研究了合子分离方法 、合子发育时期 、饲养细胞发育状态以及培养方式等对合子培养的影响 ,经改进技 术后 ,约 60 %合子完成第一次分裂 ,培养 12 d 形成少数原胚或细胞团 (李师 等 ,未发表资料) 。214 未受精卵细胞与中央细胞的培养在未传粉子房与胚珠培养诱导单倍体植株成功以后 ,研究者曾试图直接培养分离的胚囊而未获进展 。但最近未受精卵细胞的培养却取得了可喜的初步结果 。玉米品系 Garant 的卵细胞经高浓度 ( 25 、30 、40 mg/ L ) 2
22、 ,42D 处理 1 h ,再在 2 mg/ L 2 ,42D 条件下微室饲养 ,6 %分裂成多细胞团 ,品系 A188 则不分裂26。由于有的多细胞团已达到含 100 以上细胞 ,因而预期应有继续发育与分化的可能 ,但是否最细胞与精细胞离体融合产物的培养最初未能分裂31 ,但最近在一篇综述中提及 ,玉米中央细胞离体受精后能够生长 ,不过中央细胞不易分离 ,难以获得其融合产物17 。至于未受精中央细胞的培养则更无 报道 。最近 ,傅缨等32 借鉴玉米未受精卵细胞培养的经验 , 在烟草胚珠酶解过程中伴以高浓度 ( 20 mg/ L ) 2 ,42D处理 ,由此分离的中央细胞在微室饲养条件下可启动
23、分裂 。共培养了 184 个中央细胞 ,最 高分裂频率达 14 % ,有的已形成小细胞团 ; 以同样方法分离和培养的卵细胞与助细胞原位融合体及反 足细胞亦诱导了一次分裂 。细胞生物学与分子生物学研究3311 细胞生物学研究离体受精提供了直接观察受精和受精后发育动态的实验系统 ,初步揭示出若干新的现象 。在玉米 离体受精成功后 ,研究者先后以 3 种方法进行了有关细胞生物学研究 : 一是将精 、卵融合材料固定与包 埋后制作半薄与超薄切片 ,进行光镜 、电镜及三维重构观察33 ;二是应用荧光显微术对生活材料进行观察26;三是应用图象分析和共焦激光显微术进行研究34 。研究结果首先是得出了离体受精过
24、程的时间表 :精 、卵细胞融合十分迅速 ,在 1 s 内即已完成 ; 细胞融合后 30 s 开始合成细胞壁 ,20 min 内完成壁的再生 ;3560 min 完成核融合 : 1846 h 出现两个核仁 ; 3950 h 发生核分裂 ; 4060 h 完成合子分 裂 。这样一个时间表对于离体受精而言是比较精确的 ,便于在此基础上开展进一步的细胞生物学 、分子 生物学和遗传工程研究 。实验表明 ,在离体受精后 1045 min 再以附加精细胞与人工合子融合是不成 功的 ,这是由于人工合子再生细胞壁之后 ,构成了防止多精入卵的障碍21 。在这里可以提出一个问题 : 如果同时以两个以上的精细胞对一个
25、卵细胞进行离体受精 ,结局会如何呢 ? 是否可以获得多精入卵的 结果呢 ? 可惜迄今还没有这方面的实验 。离体受精系统还可以用于研究卵细胞通过受精而激活的机 制 。初步观察到卵细胞和 4 h 的人工合子中有钙调素和膜结合钙的分布 ,这暗示植物受精可能如动物 受精那样 , 钙在卵的激活中起重要作用34 。离体受精系统还可以用于研究合子的极性与分裂模式 。据 观察 ,玉米的分离卵细胞即使变成圆球形依然保持极性 ,其表现之一是 : 未受精的卵细胞或两个卵细胞 的融合产物 ,仅仅在一极形成壁物质 ,与体内状态相似26 。受精后的人工合子的第一次分裂也和体内 合子一样是不对称的 ,这不仅见于玉米离体受精
26、产物 ,而且亦见于玉米与其它禾本科植物远缘离体受精产物26,由此导致此后主要按胚胎发育模式发育 。最后值得提及离体受精和体内受精一个显著的差异是 ,精细胞质恒定进入卵细胞33 ,而体内受精时精细胞质的行为则因物种而异 。研究雄性细胞质在离体受精植株的遗传规律将是一个有意义的方面 。312 分子生物学研究利用离体受精系统研究受精与早期胚胎发生过程中的基因表达 ,是本研究由细胞水平进入分子水 平的新趋势 ,也是植物发育生物学中的一个新热点 。获得小批量卵细胞与人工合子的方法以及由微量细胞构建 cDNA 文库的方法已经建立 ,为开展这一研究奠定了技术基础 。实验材料迄今仍然是玉米 。在 Kranz
27、实验室 ,应用逆转录酶2聚合酶链式反应 ( R T- PCR) 技术 ,由 128 个分离的卵细胞与 104 个离体受精后 18 h 的人工合子构建了 cDNA 文库35 ,并通过差异筛选从后者分离出若干在卵细胞中特异表达 或由受精诱导表达的基因17 。由人工合子文库中分离出编码钙结合蛋白 calreticulin 的克隆 ( 该蛋白主 要存在于细胞内质网及某些细胞的核或质中 ,与细胞分裂有密切关系) ,测序分析表明它和常规的 cal2 reticulin 基因 DNA 序列一致 。从而证明 ,所构建的 cDNA 文库是符合质量要求的36 。此外 ,根据 1996 年德国汉堡大学“Plant
28、Embryogenesis Wor kshop”论文摘要介绍 ,由以上文库中还分离出如下一些克隆 : 与核糖体蛋白 L 39 、S21 及 Po 族同源的克隆 ;与哺乳动物翻译起始因子 EIF4D 类似的克隆 ;编码 MCM/3/ 4/ 5 基因族转录因子的克隆 ;类似哺乳动物 DNA 聚合酶一个亚单位的克隆 ; 哺乳动物 flap2endo nucle2 ase 的克隆等 。在 Dumas 实验室中 ,由 100 个玉米过渡期幼胚构建了 cDNA 文库 ,从中克隆出在胚胎发 生过程中表达的钙调素基因37 。迄今取得的成果仅仅在分离受精前后与早期胚胎发生过程中特异或2 期杨弘远等 : 被子植物
29、离体受精与合子培养研究进展99优势表达基因上迈出了第一步 ,距离揭示这些基因在这一发育过程中的功能还远 。除了通过构建 cD2NA 文库研究基因表达外 ,还尝试了将外源基因导入合子的实验 : 应用显微注射将两种报告基因 ( GU S基因 、花青素调节基因) 分别导入玉米的分离合子 ,经短时间培养后 ,证明被导入的基因在合子中瞬间表达38。显微注射技术在动物受精机理和受精工程研究中是一项有力的手段 ,在植物中的这一尝试是一个有意义的开端 。战略思考受精是植物亲代与子代之间的联系桥梁 ,在发育与遗传中具有多重的作用 : 激活卵细胞 ,启动胚胎 发生 ;实现由配子体向孢子体 ,由单倍体向二倍体的世代
30、转换 ;实现双亲遗传物质的结合 。因此 ,在植物 有性生殖研究中 ,受精始终占有中心的位置 。受精又是一个十分复杂的自然过程 ,包含一系列精巧有序 的发育事态 ;被子植物的受精过程是在深藏的雌配子体中进行并包含独有的双受精特点 ,这更加重了研 究的难度 。在 19 世纪植物胚胎学的奠基阶段 ,双受精的发现是在大 、小孢子发生与雌 、雄配子体发育和 胚与胚乳发育这些生殖过程的前后两段已经基本弄清之后方才突破的 。历史似乎在新的水平上重演 : 在 20 世纪 90 年代 ,离体受精也是在生殖过程前后两段的实验研究 ( 花药与花粉培养 、未传粉子房与胚4珠培养 、胚囊分离 、雌雄配子分离 、离体授粉
31、 、胚胎培养 、胚乳培养) 已经达到相当深度之后方才突破的 。在生殖过程的基因表达研究中 ,似乎也有这种由前后两段向受精这个中心发展的趋势 。这样 ,可以预见21 世纪将迎来受精机理和受精工程研究的辉煌时代 。在近年发表的一些综述中 ,从不同角度对离体受精研究进展与前景进行了探讨17 ,39 41 。本文在 总结前述各方面研究成就的基础上对今后发展趋势提出一些战略思考 :在玉米离体受精这一模式系统之后 ,创建更多离体操作模式系统仍将是未来发展的动力 。将有更 多的植物离体受精与合子培养成功 。首先是其它禾本科植物 ,包括已经取得阶段性成果的小麦 、大麦 。 作为重要粮食作物的水稻已有较好的胚胎
32、培养基础 ,合子培养指日可待 ,而离体受精则由于其花粉生活 力极弱可能遇到困难 。双子叶植物中 ,烟草在现有基础上应是最有希望成功的 ;油菜的精细胞分离与原 胚培养均较成熟 ,只要卵细胞与合子分离成功 ,也很有前途 。除了种内的离体受精外 ,远缘离体受精 、多 精受精 、未受精卵细胞培养 、未受精与受精中央细胞培养等各种实验研究 ,因为在理论研究与遗传育种 上各有独特的价值 ,将呈现广阔的研究天地 。利用卵细胞 、合子等作为基因工程的受体有旺盛的生命 力 。前述研究结果表明 ,无论人工合子或自然合子 ,在离体条件下均有很高的分裂频率并基本遵循胚胎 发育途径 ,这是一般体细胞和其它性细胞系统所不
33、可比拟的优点 。考虑到合子数目有限 ,外源基因导入 将主要采取显微注射的手段 ,这样一种在动物生殖工程中证明有效的方法 ,在植物中也必然开拓出强有 力的新转化体系 。在各种实验系统建立的基础上 ,有关受精和早期胚胎发生的理论研究将深入到新的层次 。体内的 受精与早期胚胎发生包含的主要发育事态有 :花粉管进入退化助细胞释放精子 ;精子由退化助细胞转移 至受精靶区并分别趋向卵与中央细胞 ;雌 、雄性细胞融合与核融合 ,卵细胞 (及中央细胞) 通过受精激活 ; 合子的极性分裂与胚和胚柄的分化 ;原胚分化 ;胚乳发育等 。对于这些发育事态 ,体内研究只能解决部 分问题 ,离体研究也只能解决部分问题 ,
34、而两方面研究互相参照则将获得较全面的认识 ,这由前述离体 受精的细胞生物学研究已略显端倪 。由于离体研究具有可控条件和生活状态两大优点 ,特别适于应用 细胞生理学 、生物物理学的方法 ,以研究受精和胚胎发生过程中的信号传递等体内研究难以奏效的问 题 ,正如花粉离体萌发系统中有关研究所显示的那样 。至于应用分子生物学方法研究这一过程中的基 因表达更是方兴未艾 。有朝一日将能解析决定上述各个发育环节的功能基因 ,然后应用转基因技术改 变受精与胚胎发育过程 。例如 ,如果找到决定卵细胞激活的有关基因 ,就有希望通过基因操作创造出无喻的 。参考文献Hu Shi2Yi ( 胡适宜) . Male ger
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