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2、正，其国风一定颓败。塞内加5、法律不能使人人平等，但是在法律面前人人是平等的。波洛克人类细胞质、RPCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用分离提纯RNA的目的分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物,人类细胞质、RPCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用,分离提纯RNA的目的分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物,RNA提取的原理在哺乳动物中,rRNA占总量的80%85%,RNA和核内小分子RNA占10-15%,而mRNA只占1-5%。RNA由28S、18S、55等几类组成,这些RNA分子根据蜜度和分子大小,
3、)过密度梯度离心、凝胶电冰、离子交析进行分离RNA分子种类繁多,分子量大小不均一,在细胞中含量少,绝大多数mRNA分子(除血红蛋有些组蛋白mRNA以外)在3,端存在20250个多聚苷酸pOA用此特点,用ogo(亲和层析柱分离mRNA,RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定,分布广泛,除纽胞内源性RNA酶外,环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时,应尽量创造个无RNA酶的环境,包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性,主要是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶,通过RNA酶的阻抑蛋白Rnsn和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制內源性RNA
4、酶。,RNA提取的方法1、异硫箐酸胍法GuSCN是一种强的蛋白质变性剂,能够裂解细孢的同时,还能有效地抑制内源性 Rnase的活性,通过有机溶剂的分步抽提,可获得纯度较高的细胞总RNA特点:需低温操作,但价格经济。2、Trizol试剂(商品化产品)特点:在室温下可以提取细胞总RNA,具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3未端有ploy(A)尾,利用寡聚dT纤维素结合mRNA,将其从细胞总RNA中分离出来。,rio法Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的
5、核酸酶。在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用,Izo法io的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍爲于解偶剂,是类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA活性,因此o中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制內源和外源 RNaSe。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。,rio法izo试剂可用于小量样品(50-1
6、0m9组织、5106细胞)也适用于大量样品(1g组织、107细胞)。对人,动物,植物组织,细菌均适用,整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于 Northern blot,dot blot,poyA筛选,体外翻译,RNSe保护分析和分子克隆。,RNA提取的一般步骤破碎组、分离织RNARNARNARNA,1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行可以用盐酸胍、硫氰酸胍、-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织加入-M可以抑制RNA酶活性2、分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开。3、沉淀RMA般用乙醇、3 d NaAc(pH-5.2)或异丙醇。,谢谢！,21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。培根22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。韩愈23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。马克思24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。莎士比亚25、学习是劳动，是充满思想的劳动。乌申斯基,供娄浪颓蓝辣袄驹靴锯澜互慌仲写绎衰斡染圾明将呆则孰盆瘸砒腥悉漠堑脊髓灰质炎(讲课2019)脊髓灰质炎(讲课2019),
