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1、微生物及发酵工程摘要 微生物是发酵工程的灵魂，近年来，对于发酵工程的生物学属性的认识愈益明朗化，发酵工程正在走近科学。人们熟知的利用酵母菌发酵制造啤酒、果酒、工业酒精，乳酸菌发酵制造奶酪和酸牛奶，利用真菌大规模生产青霉素等都是这方面的例子。本文主要讲述了微生物发酵工程技术及新的研究方向。关键词 微生物发酵 历史 发酵技术 应用一、微生物工程的发酵历史发酵工程1是指采用工程技术手段，利用生物（主要是微生物）和有活性的离体酶的某些功能，为人类生产有用的生物产品，或直接用微生物参与控制某些工业生产过程的一种技术。20世纪20年代，酒精、甘油和丙酮等发酵工程，属于厌氧发酵。从那时起，发酵工程开始在不断
2、地发展和完善。 20世纪40年代初，随着青霉素的发现，抗生素发酵工业逐渐兴起。由于青霉素产生菌是需氧型的，微生物学家就在厌氧发酵技术的基础上，成功地引进了通气搅拌和一整套无菌技术，建立了深层通气发酵技术。它大大促进了发酵工业的发展，使有机酸、微生素、激素等都可以用发酵法大规模生产。 1957年，日本用微生物生产谷氨酸成功，如今20种氨基酸都可以用发酵法生产。目前，代谢控制发酵技术已经应用于核苷酸、有机酸和部分抗生素等的生产中。 20世纪70年代以后，基因工程、细胞工程等生物工程技术的开发，使发酵工程进入了定向育种的新阶段，新产品层出不穷。 20世纪80年代以来，随着学科之间的不断交叉和渗透，微
3、生物学家开始用数学、动力学、化工工程原理、计算机技术对发酵过程进行综合研究，使得对发酵过程的控制更为合理。在一些国家，已经能够自动记录和自动控制发酵过程的全部参数，明显提高了生产效率。二、微生物发酵工程2的内容(1)、菌种的选育方法：A、从自然界中先分离出相应的菌种；B、利用诱变筛选出符合生产要求的优良菌种 ；C、利用基因工程、细胞工程的方法构建工程细胞或工程菌。例：可将人工合成的人的胰岛素基因与大肠杆菌的质粒结合，形成重组DNA，再把重组DNA导入大肠杆菌细胞内形成工程菌。通过筛选则可培养出能生产人的胰岛素的菌种。(2)、培养基的配置及原则：A、根据不同的菌种，选择不同的材料配制培养基。B、
4、配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源长因子、水、无机盐等方面的营养要求，并为微生物提供适宜的PH。C、培养基的营养要协调，以利于产物的合成。D、培养基在满足微生物的营养需求的基础上应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。(3)、灭菌及原因：在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响 。举例：如果在谷氨酸发酵过程中混人放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解掉。 (4)、扩大培养和接种：扩大培养是将培养到对数期的菌体分开，分头进行培养，以促使菌体数量快速增加，能在短
5、时间里得到大量的菌体 接种：接种过程要注意防止杂菌污染。(5)、发酵过程：发酵产物主要在菌体生长的稳定期产生。在发酵过程中随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及时添加必需的培养基成分来延长菌体生长稳定期的时间，以得到更多的发酵产物 。发酵生产中温度、pH、溶氧量等对发酵过程有重大影响。(6)、分离提纯发酵产物不同，分离提纯的方法会有所不同。一般方法是：代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换等方法。菌体本身：过滤、沉淀。三、微生物发酵过程的多种培养技术1、分批培养分批发酵是一种封闭培养系统, 含有初始限制量的基质的发酵方式, 菌体接种到培养基后除了气体流通外，发酵液始终留在生物反应器内
6、。分批培养过程中微生物生长一般可以分为四个阶段:延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期，在接种后一段时间, 细胞数目和菌体量不变，因菌体对新的生长环境有一个适应过程,所以工业生产从发酵产率和发酵指数以及避免染菌考虑,应尽量缩小延滞期，扩大生长期。延滞期过后进入对数生长期 ，如果条件良好, 营养充分,微生物会以最大生长速率生长3，经过一段时间, 由于养分的消耗和微生物产物的分泌,生长速率逐渐减速直到停止 ，从对数生长期到稳定期有一个过渡,称为衰减期 , 衰减期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力 ,例如对基质的亲和力高( 具有低 Ks值) ,则衰减期很短,反之 ,则长4；当生长率下降为零时, 便进入稳
7、定期,但是稳定期菌体代谢仍然十分活跃,有许多次级代谢产物在此时合成。分批培养的产物大概可以分为两种: (l)与生长联动的产物；(2)与生长不联动的产物。前者相当于初级代谢产物, 由正在生长的细胞合成,后者相当于次级代谢产物,多在稳定期中合成5，若所需产物不同,要选择不同的分批发酵工艺，对于产物是细胞本身, 可采用能支持最高生长量的培养条件；对于产物是初级代谢产物, 可设法延长与产物关联的对数生长期； 对于次级代谢产物, 可缩短对数生长期，延长稳定期 ,或降低对数生长期的生长速率, 从而使次级代谢产物更早形成。2、分批补料培养在发酵开始时投人一定量的基础培养基,到发酵过程的适当时期，开始连续补加
8、碳能源或氮源或和其他必需基质,直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后, 将发酵液一次全部放出, 这种操作方式称为分批补料发酵6。 分批补料培养, 最初以分批方式建立 , 因为简单分批发酵不能维持一定的菌体浓度, 当基质消耗后菌体将加速死亡, 使活细胞数量迅速下降 ,分批补料由于持续供给菌体维持和生长所需的营养,故能保持发酵液中有较高的活菌体浓度,从而克服上述缺点，另外,不断的补料稀释, 对降低发酵液的粘度, 改善流变学性质,强化好氧发醉的供氧,也是十分有利的。分批补料发酵目前已广泛应用于各种发酵产品的工业生产中。优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度: (l)可以除去快速利用碳源的阻遏效应,并
9、维持适当的菌体浓度,使不至于加剧供氧的矛盾；(2)避免培养基积累有毒代谢物，与连续发酵相比, 分批补料发酵不需要严格的无菌条件,也不会产生菌种老化和变异等问题 ,其应用范围十分广泛, 包括抗生素、氨基酸 、酶蛋白、核昔酸 、有机酸及高聚物等 。3、半连续培养一部分培养物有规律的间隔收获以及被等体积新鲜培养基替换的培养方式称为半连续培养7。半连续培养在分批补料的基础上，间歇放掉部分发酵液,与其他发酵罐的发酵液一起进行提炼, 通常在行业中称为带放，这种方式可以通过补充养分和放掉部分发酵液 ,使发酵持续下去, 因为在发醉中有害物的积累,也会造成合成产物遭到抑制, 所以放掉一部分发酵液再补人适当原料
10、, 使得营养充分, 代谢有害物浓度稀释, 从而有利于产物的继续合成。不足之处: (1)放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生长旺盛的菌体；(2)定期补充和带放使发酵液稀释,送去提炼的发酵液体积更大；(3) 发酵液稀释后可能产生更多的有害代谢物, 最终限制发酵产物的合成；(4) 一些经代谢产生的前体可能丢失；(5)有利于非产生菌突变株的生长，因此,采用该法时要考虑到这些限制,要具体问题具体分析。4 、连续培养连续培养是发酵过程中一面补入新鲜的料液,一面以相同的流速放料，维持发酵液在原来的体积。连续发酵8是一个开放系统,通过连续流加新鲜培养基并以相同的流量连续地排出发酵液,可以使微生物细胞群
11、体保持稳定的生长环境和生长状态,并以发酵中的各个变量都能达到恒定值而区别于瞬变状态的分批发酵 ，连续发酵对于微生物典型的生长曲线实际上是尽量缩短或消除延滞期, 使菌体一直处于良好的条件下, 以最大生长率生长，获得较高的菌体量。连续发酵包括恒化器发酵和恒浊器发酵，前者以某种必需营养作为生长限制基质, 通过控制其流加速率，造成适应这种流加条件的生长密度和生长速率；后者控制生长限制基质的流量以维持恒定的菌体密度，无论恒化器还是恒浊器, 除了控制进出口物料流量外，许多重要的环境因素如温度、pH、空气流量、压力等也必须加以控制以保持稳定。同时，还应具有良好的搅拌混合条件，使整个发酵液中所有物质的分布都达
12、到均一，以保证流出液中各物质的浓度与反应器中的浓度相同。一般多用恒化器 ,但有时恒化器也会有偏差或异常, 由于不完全的搅拌和器壁猫附,恒化器的改良可以通过增加容器的级数，将菌体反馈到容器中等手段来实现，例如, 多级恒化器、内部反馈系统和外部反馈系统。连续发酵具有的优点:(l) 能够维持较低的基质浓度；(2)可以维持稳定的操作条件,连续培养具有稳态优势, 从而使产率和产品质量也相应的保持稳定；(3)便于自动控制, 有效的实现机械化和自动化, 降低劳动强度,减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会；(4)减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时；(5)由于灭菌
13、次数少，使测量仪器探头的寿命得以延长；(6)容易对过程进行优化,有效的提高发酵产率。在大规模生产中也有不足之处：(l)对仪器设备及控制元件的技术要求较高, 从而增加投资成本；(2)连续培养是开放系统，并且发醉周期长，有极大的可能性造成菌体染菌，这也是生产成败的关键问题；(3)在长期的发酵过程中，微生物容易发生变异, 菌株退化问题也限制了大型连续培养生产，生产慢的高产菌株很可能逐渐被生长快的低产变异菌株取代，从而降低生产效率；(4)丝状真菌菌体容易附着在器壁上生长以及在发酵液内结团, 给连续发酵操作带来困难。鉴于以上情况, 连续发酵目前主要用于研究工作。5 、其他技术(1)膜分离与发酵的耦合为解
14、决产物反馈阻遏和代谢有害产物限制的问题,理想的办法是在发酵过程中产物积累时将产物即使从发酵液中分离与回收，膜分离技术与发酵的耦合可避免菌体丢失这一缺点,可排除有害代谢物,避免或减轻产物的反馈抑制，从而使高密度细胞培养成为可能, 更合理的利用微生物的生产性能，以提高产率。与膜结合的生物反应器在这方面最能发挥他的特长，膜生物反应器是一种借助于膜截留住酶、细胞器、微生物、动物或植物细胞,用以生产较为贵重的物质，或进行污水处理，膜生物反应器可以分为两类:第一类用膜保留培养物, 使之悬浮于生物反应器中, 不会因微滤或透析作用是细胞流失, 因而水流和培养物在反应系统中的持留时间各异； 第二类把生物催化剂固
15、定在膜表面上或网格中或夹持在两张膜的中间, 因此, 生物催化剂是不能运动的。膜技术的优点除了排除有害代谢物、避免反馈抑制外, 可以提高发酵中有机酸的产率, 乙醇、丙酮、丁醇发酵的反馈抑制 ,在基因工程菌的培养、超氧歧化酶生产、单克隆抗体生产等方面都能达到较高的产率。(2)高细胞密度培养代谢产物的合成是靠菌( 生产者) 来完成的，量越多，自然产量就越大, 条件是菌的生产力能保持在最佳状态和具备适当的生产条件，包括足够的产物合成所需的基质、前体、诱导物等和没有有害代谢物的积累10 。高细胞密度培养曾成功地应用于各种代谢产物的生产，高细胞密度培养一般指微生物沉没培养时其细胞浓度达到100g/L以上的
16、水平，最早应用于生产单细胞蛋白、乙醇等，可用于高细胞密度培养的生物反应器类型有常用的搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器, 一般多用于研究，在工业生产中，还是采用一般的搅拌罐与补料工艺进行高细胞密度培养, 因为它简单、生产潜力高,适合于进行多参数的相关控制11。四、发展趋势(1)、菌种改良青霉素和链霉素的相继发现,开启了现代微生物药学的大门。微生物产生的生物活性物质(比如:抗生素、维生素、氨基酸、酶等)渗透了人们的生活, 并在医药、食品和化工工业中有着不可取代的地位，但是,由于刚从自然界分离得到的原始菌株代谢产物产量往往很低,远不能满足生产需要,所以, 通过菌种改良手段筛选高产菌种,
17、从而降低生产成本的工作就显得尤为重要。早期的菌种改良思路主要集中于随机筛选和简单的理性筛选,利用这些传统方法进行菌种改良12也取得了许多成功,例如: 最初的青霉素生产菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum NRRL 1951)的产量为60 mg/L, 经过多年的传统选育,如今的生产菌种产量已到达 70 g/L。但是,传统方法耗时、费力、工作量大以及诱变结果不具定向性的缺点随着时间推移也逐渐暴露出来 ，随着 DNA 重组技术、原生质体融合和组学研究的应用日益广泛, 菌种改良的新方法和新策略如雨后春笋,层出不穷。如今,对于那些生化途径清晰的菌株,通过代谢工程策略可以更容易地选择
18、菌种改良靶点；而对那些生化代谢途径不清楚的菌株,也可以直接通过基因组改组(Genome shuffling)、系统生物技术、核糖体工程和表观遗传修饰等手段进行遗传选育,从而获得理想突变表型。新方法和新策略的出现,使得微生物菌种选育的工作更具定向性和正突变性,为构造高产菌种提供了更广阔的空间。以下为近年来菌种改良相关领域的最新方法和策略的进展。A、代谢工程 代谢工程是使用现代基因工程技术对产生菌细胞进行定向改造的优化手段。以了解相关代谢产物的生化反应途径为重点，应用多种不同的代谢分析手段确定生物合成的“瓶颈”,集中于细胞代谢流的控制，比如:调整参与目的抗生素合成的前体化合物的代谢通路，以提高目的
19、代谢物的产量或产率；最小限度地限制流向副产物的代谢流，排除某些不需要的副产物的合成；使微生物合成新的代谢产物等。应用代谢工程进行微生物的遗传育种主要体现在提高途径限制酶的活力、对全局性调控基因或整个基因簇的操作、增强菌种代谢产物的耐受性及其生物合成途径的异源表达。B、基因组改组 基因组改组(Genome shuffling)9技术是结合传统菌种改良技术与细胞融合技术发展的一种新兴菌种改良手段, 它主要是指将传统育种得到的具有不同表型的菌株进行全基因重组,从而使得这些菌株的优良性状能集于一身。C、系统生物技术 近年来, 随着组学(基因组、蛋白质组、代谢组等)和高通量筛选技术的蓬勃发展, 探索细胞
20、内复杂的次级代谢调控网络逐渐成为可能。通过系统生物技术将获得的相关组学数据整合,通过计算机建模和预测,从而确定相关的遗传操作靶点,使微生物的遗传育种更具定向性。D、核糖体工程 微生物在恶劣的环境下,比如:碳源、氮源或者磷酸盐营养突然匮乏时, 自身的rRNA以及tRNA合成受到限制,从而导致蛋白合成水平低,启动抗生素等次级代谢产物的合成,这种应答机制被称作应急反应。通过研究发现,小分子化合物四磷酸鸟苷(ppGpp)是导致微生物出现应急反应中的主要响应因子,它能直接作用于RNA 聚合酶, 调节tRNA 和 mRNA 合成水平。实验表明, 作用位点与 ppGpp 邻近的抗生素利福平以及作用位点在核糖
21、体上的抗生素(链霉素、庆大霉素、巴龙霉素、硫链丝菌肽)等,都能模拟ppGpp 的作用,使微生物产生类似应急反应的现象,从而使得菌株相关代谢产物产量增加或者产生新型化合物,基于这些发现,提出了核糖体工程育种技术的概念。E、表观遗传修饰 上述的微生物遗传育种的新方法与新策略主要集中于提高已知目的代谢物的产量，其实寻找新结构的代谢产物也是微生物遗传育种的重要面。近年来，由于真菌具有强大的生物酶系和代谢系统的特殊性等特点，其产生的一系列新颖的化学小分子实体引起了广泛微物药学家的重视。通“基因组挖掘”技术研究发现，真菌基因组中存在广泛的次级代谢生物成途径,但由于实验室条件对于菌株的“驯化”,大量潜在的生
22、物合成基因簇仍处于沉默状态, 菌株实际产生的次级代谢产物远远低于预 期。虽然通过改变养条件或分子操作手段能适当激活一些沉默基因的表达，但是操作基因未知性以及异宿主的兼容性等原因依然成为限制的主要因素。因此, 寻找一种能效激活真菌沉默的次级代谢生物合成基因的遗传育种方法迫在眉睫。(2)、高效呼吸膜固态发酵近20多年来人们逐渐认识到抗生素对人和动物存在的潜在危害，因此，在动物营养研究和动物养殖中，人们不得不花费大量心血研究抗生素替代品及其应用推广。农业部饲料工程研究中心和晟亚育达生物科技有限公司经过共同努力，结合传统发酵饲料技术和传统食品发酵防杂菌污染经验，发明了带呼吸膜可移饲料发酵技术。该技术关
23、键在于发明了一种能使微生物有益菌在自然状态下保持高活性生长代谢的生命呼吸装置- 呼吸膜它可以使活菌，主要是乳酸杆菌和酵母菌在自然条件下能够长期保持高活性，巧妙地解决了微生物固态发酵散热、厌氧控制以及包装、储运、稳定性等难题，高效呼吸膜固态发酵核心技术在于抗生生产技术是以各种轻工业副产物或杂粕作为发酵底物，原料不需要经过消毒，采用独创的微生物呼吸膜和先包装后发酵的移动式微生物厌氧固态发酵工艺，低成本、规模化的生产，含高量有益微生物。复合培养物每克成品发酵料中，乳酸菌活菌数可以达到10亿个。我国现有生猪饲养条件下，在配合饲料中添加15-25% 发酵饲料就可以完全替代抗生素，在基本不增加饲养成本条件
24、下，实现生猪从15 千克至出栏无抗生素饲养，猪肉品质达到欧盟安全肉品要求。高效呼吸膜固态发酵技术对实现我国饲料安全有重大意义，通过微生物发酵无抗饲料，实现生猪无抗生素饲养技术项目的实施具有划时代意义。 此技术将解决饲料中全面禁止使用抗生素难题，可以提高酒糟、醋渣、果渣、棉籽粕、菜籽粕等非粮食饲料资源利用率3-5%。 在动物饲料中添加量可以达到20-40% 且生产工艺简单、成本低、投资少、可操作性强、成品使用方便、特别适合广大农村养殖场户，对解决人畜争粮及饲料数量安全问题建设节约型社会具有重大意义。(3)、利用代谢工程技术提高工业微生物对胁迫的抗性13代谢工程是微生物菌种改造的平台技术，它通过修
25、饰和优化微生物代谢网络与表达调控网络14，改善细胞的生理功能，从而将微生物改造成“细胞工厂”生产有用的物质，是一个极具吸引力的研究热点。A、借鉴传统代谢工程技术构建胁迫抗性突变株a构建新的代谢途径合成胁迫抗性物质；b拓展已有的代谢途径组成完整有效的抗胁迫途径；c 削弱已有的代谢途径。B、借鉴反向代谢工程技术构建胁迫抗性突变株a 在异源微生物或相关模型系统中获得预期的表型； b确定导致这一表型的遗传基因； c通过遗传改造使这一表型在特定微生物中表达。四、微生物发酵工程的应用(1)、食品工业方面：酒类：如果酒（葡萄酒等）、米酒、白酒等；(2)、有机溶剂：如乙醇、丙酮、丁醇、甘油；(3)、有机酸：如
26、醋酸、乳酸、葡萄糖酸、柠檬酸、酒石酸、衣康酸、长链二元酸（以十三到十八碳的直链烷烃为原料的发酵产品）；(4)、氨基酸：如谷氨酸（谷氨酸钠又称味精）、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等；核苷酸及其类似物：如鸟嘌呤核苷酸（5-GMP）、肌苷酸（5-IMP）、腺嘌呤核苷酸（5-AMP）、黄嘌呤核苷酸（5-XMP）等；(5)、抗生素：包括疾病治疗的药用抗生素，农业和畜牧业用于防病抗病的抗生素，如青霉素、头孢霉素、链霉素、四环素、土霉素、红霉素、稻瘟素、井岗霉素、春日霉素等等；(6)、多糖：如黄原胶、普鲁兰等；(7)、酶15：如碱性蛋白酶
27、（洗涤剂）、中性蛋白酶（洗涤剂等）、脂肪酶（洗涤剂）、-淀粉酶（淀粉水解）、葡萄糖淀粉酶（葡萄糖生产）、葡萄糖异构酶（高果糖糖浆生产）、纤维素酶（纤维素水解、纺织品加工）、果胶酶（食品、水果加工等）、凝乳酶（奶酪制造）、青霉素酰化酶（青霉素母核生产）、天冬氨酸酶（L天冬氨酸制造）、延胡索酸酶（L苹果酸制造）、葡萄糖氧化酶（检验葡萄糖）、乳酸脱氢酶（临床检验）、链激酶（治疗血栓）等，目前世界上有100多种酶用微生物发酵生产，应用于不同领域。参考文献1储炬、李友荣. 现代工业发醉调控学. 化学工业出版社,2002：230-250.2熊宗贵. 发酵工艺原理. 中国医药科技出版社, 1995 : 17
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