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1、 山东农业大学硕士学位论文蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究姓名:朱雯静申请学位级别:硕士专业:生物化学与分子生物学指导教师:王晓云20080525英文缩略表缩略词 中文全称 英文全称二磷酸腺苷精氨酸激酶三磷酸腺苷 肌酸激酶二甲基亚砜二乙氨基.乙基.葡聚糖?,.二硫硝基苯甲酸 ,一二硫苏糖醇乙二胺四乙酸半抑制率常数 %木犀草素聚丙烯酰胺凝胶电泳苯乙二醛十二烷基磺酸钠槲皮素关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文,是在导师指导下,独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体,均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东
2、农业大学有关保留和使用学位论文的规定,同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名,.蒜重鸯导师签名:碱幺日 期:、.矿山东农业大学硕士学位论文蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究研究生:朱雯静指导教师: 王晓云教授业:专 生物化学与分子生物学摘要精氨酸激酶, .是磷酸原激酶的一种,广泛地存在于无脊椎动物中,是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、再生有直接关系的重要激酶。由于仅存在
3、于无脊椎动物中,与脊椎动物中参与能量代谢的肌酸激酶不同,因此可以作为控制昆虫的一个很好的靶标。本研究以蝗虫精氨酸激酶为研究对象,利用化学修饰法研究活性中心的必需基团,并以黄酮类物质筛选有效的抑制剂。本试验的主要结果如下:.精氨酸激酶活性中心半胱氨酸的研究:使用对精氨酸激酶半胱氨酸进行化学修饰,结果发现随修饰剂浓度增加,精氨酸激酶的活性逐渐丧失,这表明半胱氨酸位于该酶的活性中心部位。采用邹氏作图法求得该酶活性中心必需半胱氨酸残基的数目为。利用还原被修饰的精氨酸激酶推测这个必需半胱氨酸残基的位置及作用,结果显示这个半胱氨酸有可能位于的结合位点附近。.精氨酸激酶活性中心精氨酸的研究:通过测定酶活性解
4、离基团的性质,发现蝗虫精氨酸激酶活性中心标准解离热焓为. /,表明该酶的活性中心的可解离基团是精氨酸的侧链胍基。又以苯乙二醛为专一的修饰剂作用于蝗虫精氨酸激酶的精氨酸残基,根据等的方法求得每个酶分子中仅有一个精氨酸是酶活性所必需的。通过考察底物对苯醛修饰的保护作用,结果发现对苯乙二醛修饰该酶存在保护作用,蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究这表明该精氨酸可能位于的结合位点附近。.精氨酸激酶抑制剂效果的研究:黄酮类物质对体内和体外的精氨酸激酶都有一定的抑制效果。对龄蝗虫喷洒槲皮素和木犀草素六天后,提取精氨酸激酶测活发现酶活力仅为原来的.%和.%;在体外实验中当槲皮素和木犀草素的浓度达到/时,酶
5、活性分别下降了.%和.%。并进一步通过双倒数作图确定了槲皮素和木犀草素对精氨酸激酶的抑制类型和抑制常数。.精氨酸激酶抑制剂机理的研究:利用猝灭对抑制机理进行研究。确定槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶发生静态猝灭,说明槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶能相互结合并结合在色氨酸周围。利用.法求得其结合常数和结合位点。根据非辐射能量转移机理,分别求算了槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶之间的距离,并根据热力学参数推测了槲皮素和木犀草素与精氨酸激酶相互作用力是静电作用力。根据猝灭结果和抑制效果,推测槲皮素和木犀草素对精氨酸激酶的抑制活性的不同很有可能是由于结构上的差异引起的。关键词:蝗虫;精氨酸激酶;活性中心;抑制作
6、用 :?:; .;:?,. 也 ,. ,.:.。.,. , .【. /,.蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究.,: , .,. . :,. .; ;:;山东农业大学硕士学位论文引言.精氨酸激酶的研究背景精氨酸激酶,.是磷酸原激酶的一种,主要存在于无脊椎动物体内,如昆虫、虾、蟹及软体动物中.,;,;,;,。它的作用是催化如下反应:将上的磷酸基团转移到精氨酸上,从而生成和一种具有高能键的储能分子?磷酸精氨酸,该反应需要二价金属离子如矿、参与,反应方程式如下:一:?磷酸原激酶家族是一个保守家族,可逆催化肌酸或精氨酸与之间的转磷酰基反应,反应形成的高能磷酸化的磷酸肌酸或磷酸精氨酸称为磷酸原。高能磷
7、酸原在能量储备方面起关键作用,因为当需要再生时,可以在磷酸原激酶的催化下由磷酸原转化而来。磷酸原不仅是一个能量储备库,同样在不断耗能的体系中它也是一个能量传送体.,。一般认为磷酸原及磷酸原激酶具有方面的生物功能:起能量暂时缓冲作用;起空间能量缓冲作用;提高氧化磷酸化的效率。能量的缓冲指的是当的消耗量超过线粒体产生的量时,由磷酸原激酶催化磷酸原形成;空间能量的缓冲指的是来源于心肌细胞等的一些线粒体磷酸原激酶将转化成磷酸原,这些磷酸原扩散到细胞质中,然后在磷酸原激酶的催化下,重新形成;另外也发现线粒体磷酸原激酶可通过保持低浓度来提高氧化磷酸化的效率。肌肉组织中含有丰富的磷酸原激酶,用以维持肌肉收缩
8、过程中的.,;稳态 .,;。另外,在大量需能的组织如脑、肾中磷酸原激酶也大量表达,用于离子运输、突触传递等 .,; ,。蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究等在蜜蜂的脑、触角和复眼中发现了大量不同形式的精氨酸激酶存在,而且在需能变化较大的视觉系统的能量释放机制中,精氨酸激酶是最重要的一种酶。生殖细胞精子的运动性、肠内上皮细胞绒毛小突的收缩,也受或的调控 。;。在细胞分裂后期,微管蛋白驱动纺锤体移动所需的以乎与磷酸原激酶有关,;,.,;。是节肢动物体内唯一的磷酸原激酶。在昆虫肌肉中,磷酸精氨酸是唯一有效形成的磷酰基供体,能在一定时间内给剧烈运动的肌肉提供能量,同时又维持的恒定水平.,;,; .
9、,;,; .,。等证明:磷酸精氨酸在蝗虫腿肌中起暂时能量缓冲库的作用,在静止不动时,蝗虫腿肌中磷酸精氨酸的浓度是浓度的倍;当蝗虫跳跃时,催化磷酸精氨酸形成所需要的。高活性的也被发现存在于参与离子运输的上皮细胞中,如蝗虫的后肠,及鳞翅目昆虫如烟草天蛾的中肠中,; .,;,。另外有些能与肌动蛋白结合,从而使其与动物的运动有密切关系.,.,。; .,;,;发现已经超过年了,它属于磷酸原胍基化合物激酶家族,现在已经在许多种无脊椎动物中发现。尽管基本功能都是催化高能磷酸键的转移,但是从不同的无脊椎动物分离得到的在结构和分子量大小方面却存在着很大差异。这些不同的结构和大小有以下类别:单亚基,如海湾对虾 的
10、 .,是一种相对分子量约为的单亚基的蛋白质。单亚基的是目前研究最多的一种,本文中用到的即是单亚基。双亚基,如海参.,相对分子量,中分离到的。四亚基,如环节动物中具有相对分子量在.的四亚基,。综上所述,是昆虫生命活动过程中参与能量代谢的关键性酶,而山东农业大学硕士学位论文且仅存在于无脊椎动物中,与脊椎动物中参与能量代谢的肌酸激酶不同,因此可以作为控制昆虫的一个很好的靶标,而且对高等动物安全性好。.蛋白质化学修饰.蛋白质化学修饰概述蛋白质化学修饰是指蛋白质化学结构的改变。蛋白质的化学修饰严格来说包括两个方面:其一指侧链的改变,其二指主链的改变。主链的改变属于定点突变的内容,人们一般认为蛋白质化学修
11、饰指的是改变蛋白的侧链。化学修饰的位点或者氨基酸残基一般都是蛋白质分子活性较高且暴露在外部能够被修饰剂接触到的基团,这些活性基团对蛋白质的性质可能具有很重要的作用,因此蛋白质的化学修饰很多情况下会造成蛋白质性质发生很大的变化,致其空间构象发生变化以及生物活性的降低或者丧失。随着生物技术的发展,很多先进的技术不断涌现,例如定点突变、核磁共振、晶体衍射等。蛋白质的化学修饰被许多人认为是已经落伍并且可以被取代的技术。但是,近年来由于很多专一性很高的化学修饰剂的出现,定量处理方法和不可逆抑制动力学理论方法的发展,蛋白质侧链的化学修饰这个经典的用来研究蛋白质结构和功能关系和定向改变蛋白质功能和性质的工具
12、仍然被广泛采用,并且有了新的发展。.蛋白质侧链基团各种氨基酸残基的修饰反应侧链基团化学修饰一个非常重要的作用是用来探测活性部位的结构。反应试剂与蛋白质分子接触并发生化学反应,与蛋白质分子的侧链氨基酸残基共价连接形成某些可探测的报告基团。从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成的影响,就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能。只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰,这些基团的反应性决定于它们的亲核性,并且很多因素都会影响蛋白质的化学修饰反应。因此,通过选择不同的化学修饰剂和控制合适的条件可以专一的修饰不同活性的氨基酸残基。赖氨酸的.氨基是亲核反应性较高的基团,三硝基苯磺酸是
13、修饰赖氨酸非常有效的试剂蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究,。除此之外,氨基的烷基化也是目前非常重要的方法之一,。在蛋白质序列分析中,利用氨基的反应修饰多肽末端的方法也占有极重要的地位,常用的修饰剂有一二硝基氟苯和丹磺酰氯。组氨酸残基位于很多酶的活性中心,所以对其咪唑基的修饰研究较多,焦碳酸二乙酯是最常用的组氨酸修饰剂 ,。酪氨酸残基的修饰最常用的试剂是高,度专一性并且反应温和的四硝基甲烷。色氨酸多位于蛋白质内部,而且色氨酸中的吲哚基很难被修饰,.,以及常用的是.溴代琥珀酰亚胺试剂 ,。丝氨酸和苏氨酸专一性化学修饰试剂研究比较少。而蛋氨酸残基的极性较弱,比较难以进行选择性修饰反应。其中,强
14、极性的巯基具有很强的亲核性,因此化学修饰研究最多最深入的氨基酸是半胱氨酸,它是蛋白质中最为活跃的残基之一。烷基化试剂是一种重要的修饰试剂,例如碘乙酸和碘乙酰胺等 .,。.乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修饰试剂,。有机汞试剂专一性很强,但是有剧毒,所以现在使用较少 ,。目前最常用的巯基修饰剂是,二硫.硝基苯甲酸,又称试剂,。可以与巯基反应生成二硫键,使蛋白质分子上标记一个.硝基.硫苯甲酸,同时释放一个黄色的阴离子,见图.。椭,小心%髻竺睁咱如优。己扣懒州。图对巯基的修饰反应. .时的释放出的阴离子在媳具有很强的吸收,其中消光系数./ ,.,所以可以很容易通过光吸收的变化来检测反应的程度。由于定
15、点诱变的迅速发山东农业大学硕士学位论文展,在目前蛋白质结构和功能的研究中,特别是半胱氨酸的侧链基团的化学修饰有被取代的趋势。然而,仍然是目前最常用的定量测定蛋白质分子巯基数目的试剂,也可以用来定量检测蛋白质中的可反应基数和总基数,并用以研究毓基改变程度的和巯基所处环境的探测,。用氨基酰化酶后修饰发现有四个可反应巯基,其中两个慢反应巯基是必需基团,它们的破坏将导致酶活性的丧失周海梦,。等采用精氨酸专一性修饰剂苯甲酰甲醛对来源于黑曲霉的植酸酶进行修饰,发现精氨酸残基位于该植酸酶的活性部位。等采用专一的修饰试剂对植酸酶组氨酸残基进行修饰,并进一步研究组氨酸残基在植酸酶催化过程中的作用机理。利用和修饰
16、葡聚糖水解酶的赖氨酸和半胱氨酸,确定这两个残基位于活性中,并确定其个数和作用。.精氨酸激酶的催化机制和活性中心研究早期,人们用化学修饰结合光谱学的方法研究酶活性中心及其催化机制。研究发现中的半胱氨酸,、组氨酸,、赖氨酸 ,和酪氨酸.,是胍基底物及核甘结合所必须的氨基酸残基。其中,赖氨酸残基是核甘与酶结合所必需的,而酪氨酸是核甘和胍基底物与酶结合都必需的 .,。现代定点突变和晶体衍射技术的发展有力地加强了人们对酶催化机制以及活性中心的认识。从解出的鲎单体的晶体结构可以看到图.,它的底物类似物中的磷酸基团定位在一系列带正电的组成的口袋中,?,和一,底物精氨酸的肌基与形成盐桥,羧基与.,.和.主链上
17、的形成氢键,并且通过带负电的.与底物形成氢键来提供精氨酸甲基所需要的催化环境 .,。对来说,催化的关键在于两个结构域的相对旋转以及同时两个高度保守的柔性环环和环.的运动引起了酶分子构象上发生较大的变化。其中两个柔性环蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究分别位于结构域中,催化时向底物塌陷靠近,以排除水分子,为底物反应提供疏水性环境。构象变化诱导双底物的精确定位和以最佳反应的角度对齐是这个催化反应的最主要的机理。?蚤?.。?一妒美二二二二夏芦末:孑;眨.:岫山东农业大学硕士学位论文叶与在底物结合后在晶体结构中的位置并没有发生改变,他们认为半胱氨酸并不参与底物诱导构象变化的过程,而硫醇基对催化起重
18、要作用,半胱氨酸而通过静电作用加快了催化的速率 .,。等用修饰精氨酸激酶的活性半胱氨酸残基,精氨酸激酶失活,再用进行复性处理,结果表明,饱和浓度的二硫苏糖醇可完全使修饰过的精氨酸激酶复性.和过渡态类似物可减小表观失活常数,但精氨酸对表观失活常数无影响。该半胱氨酸可能位于结合位点的附近。等邻苯二醛修饰精氨酸激酶发现荧光光谱在 处有最大吸收峰,表明精氨酸激酶中氨基与半胱氨酸中的巯基相邻,在邻苯二醛作用下形成了吲哚环。根据邹式作图法确定只有一个半胱氨酸是催化酶活性所必须的。当其中任何一个亚基的被修饰时将导致整个酶分子活力丧失,说明双亚基的失活是协同性的,暗示其催化也具有协同性,一个亚基活性位点修饰可
19、能会引起结构上较大的变化,通过亚基之间的作用力传递给另外一个亚基,引起其结构变化,导致酶整体活力丧失。.精氨酸激酶抑制剂的研究进展.。精氨酸激酶抑制剂作为磷酸原激酶家族中的重要一员,在无脊椎动物的能量代谢中起着关键作用。因此通过研究的抑制剂来阻止能量代谢,从而达到杀虫的作用是十分重要的。目前对此的研究仍处于探索阶段。证明对龙虾中的有抑制作用,的抑制作用可能与结合有关。等等从龙虾中提纯到,并证明其活性可被巯基促进,而被巯基试剂抑制,如碘乙酰胺。对的反应机制进行了研究,证明存在一个.复合体.。加入硫氰酸根,硝酸根,硼酸根,亚硝酸根等一价阴离子后对复合体的形成有一定的影响,其中。对有抑制作用,抑制分
20、数能达到%,并求得其抑制常数是. /,属于的非竞争性抑制剂。研究表明精氨酸的类似物:精胺,高精氨酸,刀豆氨酸,硝酸精氨酸对锥形虫中的有抑制作用。其中,刀豆氨酸和高精氨蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究.和./。从锥形虫寻找抑制剂的优点是其磷酸原的生物合成途径与哺乳动物完全不同。等对底物.精氨酸的类似/。物研究表明.精氨酸是的竞争性抑制剂,抑制常数是.刀豆氨酸作为.精氨酸的类似物也会起到抑制作用,而且在.精氨酸和.刀豆氨酸混合时可能会引起酶结构的变化。绿茶中含有大量的化学物质对害虫有杀灭作用。研究了儿茶酚对锥形虫的杀灭作用。经过高效液相色谱分离出儿茶酚的多种成分,其中没食子儿茶酚和表儿茶酚对
21、有%的抑制作用,其他五种对并无影响。虽然国内外学者已经发现.刀豆氨酸对昆虫特别是鳞翅目昆虫的生长发育有影响,具有使幼虫体重减轻且生长发育延缓、造成蛹及成虫畸形并直接杀死幼虫等类似杀虫剂的性能,但对刀豆氨酸的作用机制特别是农业昆虫体内能量代谢影响的研究极少且不深入国内尚未有关于的研究文献,国外文献也极少。从结构上看,刀豆氨酸是底物精氨酸的类似物,理论上可以作为抑制剂,由于是能量代谢中最敏感的酶,那么从抑制剂上来筛选比刀豆氨酸活性更强的天然物质,是否目标及针对性更强呢特别是针对一些飞翔昆虫,如蝗虫、飞蝇、菜蛾等,通过利用抑制剂来控制能量代谢从而控制昆虫的运动,并结合其他防治措施以达到控制害虫的目的
22、。这个问题值得研究探索。.荧光猝灭对小分子物质和蛋白质结合机理的研究.荧光猝灭的原理,荧光猝灭是指物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用的过程。与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质,称为荧光猝灭剂。荧光猝灭过程可以分为两种:一种是动态猝灭,另一种是静态猝灭。动态猝灭是指猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间所发生的相互作用过程,如能量转移或电子转移过程。动态猝灭过程是与自发的发射过程相竞争从而缩短激发态分子寿命的过程。静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合反应,所产生的配合物通常是不发光的;即使配合物在激发态时可能离解而产生发光的型体,但激态复
23、合物的离解作用可能较慢,以致激态复合物经由非辐射的途径衰山东农业人学硕上学位论文变到基态的过程更为有效;结果,基态配合物的生成由于与未配合的荧光物质的基态分子竞争吸收激发光而降低了荧光物质的荧光强度。猝灭剂的存在,可能使待测物质的荧光强度显著降低甚至完全猝灭,这对荧光分析会产生严重的影响。利用某种物质对某荧光物质的荧光猝灭作用而建立对该猝灭剂的荧光测定方法,即荧光猝灭法。般来说,荧光猝灭法比直接荧光测定法更为灵敏,并且具有更高的选择性。此外,猝灭效应的研究还可以用来揭示猝灭剂的控散速率,或在生物化学研究中用以推测蛋白质上结合点的位置和蛋白质的形状等。蛋白质在紫外光照射下能发出荧光,是因为在它的
24、结构中含有三种芳香族氨基酸:色氨酸,、酪氨酸,及苯丙氨酸,。的疏水作用很强,而及则由于侧链中带有极性基团,疏水作用较差,在高值环境中,的酚基甚至还能解离出旷。虽然有一定的亲水作用,但酚基可参与形成氢键且较强,故也常出现在分子内部。由于它们具有不同的发光团,在一定条件下,它们发射出的荧光强度是不同的。的荧光往往不易观察到。而与常常作为蛋白的内源荧光探针。天然蛋白质的内源荧光主要表现为分子内残基的发射,残基发射的荧光强度相对较弱主要归因于残基,。与残基之间的能量转移.荧光猝灭的应用基于上述蛋白质的特性,荧光猝灭法可以用来研究蛋白质与小分子物质的相互作用,研究内容主要包括结合常数、结合位点数、结合位
25、置、作用力类型以及蛋白质分子在相互作用中构象的变化等。通过能量转移理论来求药物与色氨酸残基之间的距离。在荧光能量的给体和受体分子之间可以发生电子激发能的无辐射转移,这种能量转移以给体的荧光发射谱和受体吸收谱之间有适当的光谱重叠为前提条件,当给体.受体相隔的距离远大于它们的碰撞直径时,只要供体分子的基态和第一激发态两者的振动能级间的能量差相当于受体分子的基态和第一激发态两者的的振动能级间的能量差,就可能发生从供体到受体的非辐射能量转移,这种非辐射能量转移是通过分子间偶极.偶极耦合作蝗虫精氮睃激酶的活性中心及其抑制剂研究用发生的。偶极偶极非辐射能量转移理论是由提出的。蛋白质的内源荧光主要是色氨酸发
26、出的,利用能量转移理论可以求出和蛋白质作用的药物与色氨酸残基之间的距离,由此推测药物与蛋白质结合的空间部位。能量转移作用可以发生在药物与蛋白质复合物内部,也可以发生在药物与蛋白质分子之间。在后一种情况时,求得的药物与色氨酸残基之间的距离表示分子扩散过程中药物分子与色氨酸残基的最近距离。作用力类型的确定:药物等有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、氢键、范德华力和静电引力等。不同药物与蛋白质结合力的类型是不同的,等根据大量的实验结果,总结出了判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力性质的热力学规律,根据反应前后热力学焓变和熵变的相对大小,可以判断药物与蛋白质之
27、间的主在作用力类型。近年来,荧光猝灭法广泛应用于药物和蛋白质作用的研究。,;,。目前文献报道涉及的药物主要有抗癌药物、抗菌消炎药物、精神治疗药物、心血管类药物、抗自由基药物等杨曼曼,;颜承农,;徐文祥,;马正国,。研究小分子与生物大分子之间的相互作用,特别是具有生物活性的药物小分子与生物大分子的相互作用,有助于了解药物在体内的运输和分布情况,对阐明药物的作用机制、药物代谢动力学及药物的毒副作用有重要意义。不仅如此,荧光猝灭还被延伸应用分子和其他蛋白质之间的相互作用中,例如小分子物质与酶.。之间的作用,;,;徐美娟,.生物农药的研究进展.生物农药的定义长期以来,人们不惜花费大量的人力财力去研制化
28、学农药,结果单一使用化学农药防治害虫,对提高农作物的产量起了很大作用,但亦由于化学农药的广泛使用,导致了三大难题:.环境污染,残毒积累,最终危害人类健康:.害虫抗药性直线上升;.杀伤天敌,破坏生态平衡,从而致使害虫再猖獗和次级害虫大爆发。人们对农药的认识也发生了变化,现山东农业大学硕士学位论文代农药要求是:对有害生物高效、对非靶标生物安全、在产品中无残留、易分解且分解产物对环境无害。人们期望世纪的农药将是一种“环境和谐农药 / ”操海群,。而植物源农药正属于此类。植物性杀虫物质是天然产物,含多种有效成分,对害虫有毒杀、拒食、忌避、抑制生长发育和控制种群生长等作用徐汉虹,;贝纳新等,;它来源于自
29、然,在环境中易降解,残留量低,对人畜及天敌安全,它不仅具有直接利用价值,其有效成分还可通过仿生合成成为更有价值的环境友好农药的模板陈万义等,。寻找有应用前途的新的杀虫植物资源是当国内外对植物源农药研究的重点之一.生物农药的分类植物源农药主要包括生物碱,萜类物质和黄酮类物质。生物碱是人们较早知道的植物性有效杀虫成分如烟草中的烟碱,毒扁豆碱,藜芦生物碱等。棱果立和鱼藻两种植物的种子和叶片中发现一种多羟基生物碱,具有对害虫拒食和对葡萄糖酶的抑制活性屠豫钦,。从喜树中提取到的喜树碱可使昆虫不育徐礼,。番茄植株中的番茄碱对菜青虫有拒食作用徐美娟,。植物杀虫剂的另一种有效成分是萜类物质。研究人员从苦皮藤中
30、提取到的苦皮藤酯对昆虫有毒杀,拒食,麻醉等作用刘惠霞,。黄杜鹃所含的闹羊花毒素为四环二萜类化合物,对许多昆虫有防治作用朱正方,。 等发现除虫菊素不仅对菜粉蝶幼虫具有很高的致死作用,而且对害虫还有拒食和驱避作用,处理后幼虫蜕皮时间延长,化蛹时间推迟。.黄酮类物质作为生物农药的应用黄酮类化合物主要是指基本母核为.苯基色原酮.类化合物。鱼藤酮及其衍生物通常被称作鱼藤酮类化合物,是黄酮类化合物中研究最多且最深入的一种化合物,主要提取自豆科植物,特别是鱼藤属和灰叶属等植物中。鱼藤酮由于易分解,在空气中易氧化分解为无毒和低毒的化合物,残留时间短,对环境无污染,应用范围比较广,而且作用方式也很全面。它对菜粉
31、蝶幼虫等有强烈的触杀作用和胃毒作用,张业光蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究测定了非洲山毛豆叶丙酮提取物对菜粉蝶幼虫的生物活性,实验结果表明,提取物对其有明显的拒食、抑制生长发育和杀卵作用及一定的急性胃毒致死作用。随着越来越多的黄酮类物质从植物中提取出来,如绿茶,香椿,银杏叶,山楂叶,苦丁,芦丁,甘草董彩霞,;陈辉强,。黄酮研类物质在杀虫剂的研究更为广泛,; ,。究发现苦参乙醇提取物的二氯甲烷部分对蘑菇酪氨酸酶具有潜在的抑制活性。经鉴定发现,化合物.分别为苦参黄酮、次苦参黄素、狭叶槐素。与曲酸相比,苦参黄酮、次苦参黄素和狭叶槐素具有更强的酪氨酸酶抑制活性,首次揭示了苦参黄酮、次苦参黄素为潜
32、在的酪氨酸酶抑制剂。除此外黄酮类物质被作为主要生物农药进行研究。研究发现,苦参的丙酮提取物即黄酮类化合物对锥虫有致死性杀虫作用,并对其活性成分进行了鉴定。黄荆提取物对菜青虫、小菜蛾、麦长管蚜和桃蚜都有较高的杀虫活性,尤其是对菜青虫的活性最高袁林,。深入地研究植物中的黄酮成分,不仅有理论上的意义,更有其巨大的实用价值。.本实验研究目的和意义蝗灾是一种世界性的灾害,在我国的历史上与旱、涝并称三大自然灾害。由于蝗虫的高密度群居性和远距离迁移危害的特点,其大面积发生造成巨大的经济损失。因此找到有效的杀虫剂,对控制蝗虫的危害有重要的作用。由于长期使用化学农药,虽然取得了一定的灭虫效果,但化学农药不仅使蝗
33、虫产生了抗药性,而且对环境,人畜都带来不良影响,引起了一系列严重后果。对于无脊椎动物内能量的代谢,储存和利用具有非常关键的作用。因此对于蝗虫中的活性中心及其抑制剂及抑制动力学的研究,对于寻找有效的生物杀虫剂具有积极意义。山东农业大学硕士学位论文材料与方法.实验材料东亚飞蝗妇购于山东农业大学南校区蝗虫养殖基地。.主要试剂和仪器设备,精氨酸,:公司。.:公司。,:公司。其余均为国产分析纯试剂。冷冻离心机,恒流泵自动,部分收集器,梯度发生器,层析冷柜,脱色摇床,电子天平,恒温水浴,蛋白质纯化系统,.型核酸二分光光度计,蛋白检测仪,计,.荧光光度计.精氨酸激酶的分离纯化.试剂的配制分离纯化工作液/ ,
34、 /浸提缓冲液 /巯基乙醇,.混合液。.,/ , /分子筛层析平衡液/巯基乙醇, .混合液。.,/ /,分子筛层析洗脱液/.混合液。巯基乙醇,.,.阴离子交换层析柱平衡液/, /巯基乙醇, .混合液。.,.阴离子交换层析柱洗脱液蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究/ ,液: /巯基乙醇,.,.混合液。液:液当中加入固体至酶液稀释用液. 甘氨酸和.巯基乙醇,.工作液%.%: 丙烯酰胺,. 甲叉比丙烯酰胺,溶于 蒸馏水中,过滤,于 暗处贮存,一月内可使用。/ .?缓冲液:溶于蒸馏水,用浓。.,以蒸馏水定容至调至/.缓冲液:溶于蒸馏水,用浓。.,以蒸馏水定容至调至,用双蒸水溶解至 。室温保存。%.
35、双蒸水中。%过硫酸铵新配制:. 过硫酸铵溶于:直接用原液,避免挥发。表 .凝胶的配制?山东农业大学硕士学位论文.: . 电极缓冲液 ,甘氨酸. , ,溶于蒸馏水并定容至 。使用时稀释倍。样品释液: ,甘油 ,溴酚蓝,巯基乙醇 ,/ . ,.缓冲液 ,用蒸馏水溶解并定容至贮存。以此液制各样品时,样品若为固体,应稀释倍使用:若为液体,则加入与样品等体积的原液混合即可。,”考马斯亮蓝染色液:.考马斯亮蓝,甲醇冰醋酸 ,加水定容至 ,过滤后使用。脱色液:醋酸 ,甲醇 ,加水定容至 。使用后的脱色液用活性炭吸附后过滤,可以重复使用。.凝胶按表.进行配制。.精氨酸激酶的纯化方法取冷冻东亚飞蝗后腿,去外壳,
36、剥取腿部肌肉约克,加入少量预冷 ,匀浆,继续加入预冷 至。高速冷冻离心机以,取上清。的速度离心进行层析柱进行层析分离,用所得酶液用洗脱,洗脱速度为./。洗脱出来后,逐管测蛋白含量及活性,计算比活。蛋白质的活力使用 .所介绍的连续测活法进行测定。选取比活高的酶液合并,上.离子交换柱,用洗脱过夜,收集穿过峰,检测活性及蛋白含量。用. /用 配溶液进行梯度洗脱,洗脱流速为. /。逐步检测每一管的蛋白量以及蛋白质的活性,计算比活。利用.检测蛋白质的纯度。将纯度和活性较高的组分用贮存透析,最后收集,浓缩,冷冻干燥保存。蝗虫精氮酸激酶的活性中心及其抑制剂研究.精氨酸激酶活性中心化学修饰测定.精氨酸激酶浓度
37、和活力的测定蛋白质浓度采用传统的考马斯亮蓝法计算得出,。以牛血清白蛋白为标准蛋白,作标准曲线,根据标准曲线求得待测样品的蛋白质含量。考马斯亮蓝.试剂的配制精确称取 %乙醇中,加入考马斯亮蓝.,溶于。%的磷酸,用水定容至 。此试剂在常温下可保存标准蛋白质溶液的配制,精确称取结晶牛血清蛋白 水溶解并定容至,加即为/的标准蛋白质溶液。标准曲线的制作取支试管,按表?配制?./的牛血。清蛋白质溶液各待测样品的蛋白质浓度测定吸取待测液此,做两次重复,分别放入具塞试管中,加入考马斯亮蓝.试剂 ,然后盖上盖子波长下摇匀,放置 之后,以标准曲线号管作为空白,在比色,记录吸光值。代入标准曲线,求得待测样品的蛋白质
38、浓度。表考马斯亮蓝.标准曲线的制作. .?准确吸取所配各管溶液,分别放入具塞试管中,加入考马斯亮山东农业大学硕士学位论文波长下蓝.试剂 ,然后盖上盖子摇匀,放置 后在比色测定。以处的吸光值为横坐标,以牛血清蛋白/为纵坐标,绘制标准曲线图.。其标准曲线的回归方程为:.?,.。蛋白质含量/,一吸光度酶活力测定的方法由等人提出。这个底物反应体系含有/ /精氨酸,复合酸碱指示剂.%麝香草酚蓝.。.%甲酚红 /乙酸镁,?,每次取 底物于塑料比色杯中,加入酶液,迅速混合,测定一分钟内 处吸收值的减少值。测定反应曲线扣除空白对照后的斜率值,以此斜率值乘以反应时间可以得到该反应时间内的吸光值的下降值。然后再从
39、矿】标准曲线中求出反应中生成的,进一步计算就可以得出的活性。所有测定都是在 条件下进行的。在此条件下,催化生成磷酸精氨酸反应的个活力单位被定义为分钟内催化产生旷。?高口一。. 。 。图考马斯亮蓝标准曲线.蝗虫精氮酸激酶的活性中心及其抑制剂研究.精氨酸激酶活性中心半胱氨酸的测定.精氨酸激酶必需巯基数目的确定将酶溶解于.。取多份相同浓度的/,缓冲液,酶液,分别加入不同浓度的在 下保温 ,通过控制和酶的分子比来控制反应程度,得到不同修饰程度的酶,分别测定修饰酶的剩余巯基数目和剩余活力。剩余巯基数用方法测定,其摩尔消光系数为. /.。用邹氏作图法即酶的剩余活力分数对巯基剩余分数作图求必需巯基数目。.激
40、活实验.,.的复活过程使用邹氏底物动力学的方法来研究。的/修饰酶置于含有不同浓度的底物的反应混合物中保温,观察不到底物反应,表明修饰酶已经完全丧失活力。不同量.?. /的溶液加入在反应,并在厂分光光度计上检测眦时的光吸收曲线。通过固定同一,丌浓度,改变底物的浓度来检测反应曲线,探测底物对激活过程的影响。.精氨酸激酶活性中心精氨酸的测定.精氨酸激酶活性中心解离基团的解离热焓的测定/ .固定某一温度,测定在不同.的测活体系中的动力学参数,研究对酶催化的动力学参数的影响。通过对不同的酶催化反应动力学参数的比较,确定时对酶催化底物水解反应影响的机理。进一步以。对的进行二次作图,求出酶的活性中心可解离基
41、团解离常数值,并根据值初步推断酶活性中心解离基团的性质。改变酶催化反应温度、,按上述方法测定不同温度下酶活性中心解离基团解离常数,以对厂的作图,从直线的斜率可以求得酶的可解离基团的解离热焓。山东农业大学硕士学位论文.修饰精氨酸激酶中的精氨酸/.,缓冲体系中,室温以为修饰剂,在下修饰分钟后,在正常体系中测定不同浓度对酶活力的影响。在一定量酶液中加入.的缓冲液和不同浓度的底物室温放置后,加入终浓度为/室温放置 ,取出此处理酶在正常体系中测活,探讨必需精氨酸残基的个数。对照用等体积缓冲液代替,以各自相应的对照的酶活力为%。计算不同浓度底物保护下经 修饰后酶的剩余活力。./.精氨酸激酶抑制剂的研究.精
42、氨酸激酶活性的测定/ ., /定磷法:反应液包括 .精氨酸,/, /醋酸镁,/ .巯基乙醇。反应在.的酶液溶解于. 甘氨酸和.下进行,取“/后.巯基乙醇, .加入旺反应混合液中,反应加入 %三氯乙酸终止反应,在 下加热 ,再冰浴,然后加入此定磷显色液%, /。作用和%在下使用 分光光度计和测定吸光值,此时的吸光值的变化与反应时间.酶的浓度. /蛋白成正比。酶活性定义:在.条件下,以每分钟产生无机磷为一个酶活单位。.槲皮素和木犀草素对体内精氨酸激酶的抑制效应测定和结构式如图。蝗虫的体外生物活性测定:将黄酮类物质溶于,加水后稀释成所需浓度的药液,的终浓度不超过.%。选择五龄期大小一致的蝗虫,放在
43、光照培养箱中恒温饲养。每小时将浓度为/的和溶液均匀喷洒于蝗虫,持续六天,以.%作对照。每天处理后取出头蝗虫,获得的粗酶蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究液,并测定其活性。图.槲皮素和木犀草素的结构式. .槲皮素和木犀草素对体外精氨酸激酶的抑制效应的测定.槲皮素和木犀草素对体外精氨酸激酶的抑制作用及类型固定酶浓度,改变黄酮类物质的加入量,测定酶的剩余活力与加入黄酮类量的关系,确定其对体外的抑制作用。在/.缓冲液中含不同浓度的黄酮的测活体系中,改变底物浓度,测定酶促反应的初速度,以双倒数作图法作图,比较酶催化的动力学参数,包括表观米氏常数和最大反应速度的变化来判断其机理,。.槲皮素和木犀草素对
44、精氨酸激酶光谱影响的测定取浓度为. 一,一的加入在的比色皿中,分别依次加入.击?的和溶液。利用.荧光检测仪预定其荧光的变化。狭缝宽度为,激发光波长为,发射光波长为.。取和溶液.而一在分光光度计上进行吸光度测定。山东农业大学硕士学位论文结果与分析.精氨酸激酶活性中心必需基团的研究.精氨酸激酶活性中心半胱氨酸的研究.精氨酸激酶必需巯基数目的确定如图.所示,随着浓度的增加,酶的活力逐渐降低,当浓度达到岬/时,酶活力几乎为零。这是因为随着修饰剂的浓度的加大,活性中心的巯基被修饰的程度也相应增加,参与催化反应的巯基的数目也就相应减少,酶活力受到影响而降低。一寥一人;芍叱 【】图 浓度对反应速率的影响。的浓度分别为.、.、/。酶浓度为“/。., ., , /.,/.根据邹氏作图法,控制对的反应分子比:.:可以得到一系列不同修饰程度的酶,分别测定对应的剩余酶活性,得到了蝗虫精氨酸激酶的活性中心及其抑制剂研究、 到了酶的不同修饰程度和相应的活性之间的关系,结果如图.。以反应基团的剩余分数为横坐标,活力剩余分数为纵坐标,使用邹氏作图法作图,。.图活力剩余分数埘
